食品中乳酸菌定量檢測(cè)方法研究進(jìn)展

劉艷容,舒永紅,楊佳瑋,顧慧丹,楊 瑤,*

(1.南京市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院,國家加工食品及食品添加劑質(zhì)檢中心,江蘇南京 210019;2.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇南京 210023)

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一類能發(fā)酵糖產(chǎn)生乳酸的微好氧、厭氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性細(xì)菌[1]。乳酸菌很早就被人們應(yīng)用到各種食品的生產(chǎn)中,如奶酪、泡菜、酸奶等。如今,隨著乳酸菌健胃整腸、抑制致病菌、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫等益生功能被不斷揭示,乳酸菌在農(nóng)牧業(yè)、食品乃至醫(yī)藥行業(yè)的應(yīng)用更為廣泛[2],而食品中乳酸菌的檢測(cè)則成為相關(guān)食品生產(chǎn)企業(yè)及食品監(jiān)督檢測(cè)部門重要的工作內(nèi)容。

2014年,由國際益生菌與益生元科學(xué)聯(lián)合會(huì)(ISAPP)發(fā)布的關(guān)于益生菌的共識(shí)中突出強(qiáng)調(diào)了益生菌的3個(gè)核心特征,即足夠數(shù)量、活菌狀態(tài)、有益健康功能[3]。2018年我國修訂的《益生菌類保健食品申報(bào)與審評(píng)規(guī)定(征求意見稿)》已采納了這一概念。由于益生菌食品功效的發(fā)揮主要取決于活菌的作用,因此,食品中乳酸菌的活菌數(shù)量是該類食品檢驗(yàn)的核心內(nèi)容。目前我國產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定發(fā)酵乳制品及活菌型乳酸菌飲料中乳酸菌活菌數(shù)不得少于1×106CFU/g(mL)[4-5],其檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)為GB 4789.35-2016[6],采用的是平板計(jì)數(shù)法,但是該方法在實(shí)際應(yīng)用中存在耗時(shí)長(zhǎng)(一般為72 h)、工作量大和操作繁瑣等缺點(diǎn)。隨著分析檢測(cè)技術(shù)的蓬勃發(fā)展,一些快速檢測(cè)方法在食品中乳酸菌檢驗(yàn)應(yīng)用越來越廣泛。2015年,國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)頒布了采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定乳及乳制品、發(fā)酵劑及發(fā)酵產(chǎn)品和益生菌制品中乳酸菌數(shù)量的方法標(biāo)準(zhǔn)[7],該方法檢測(cè)時(shí)間短,大大提高了檢測(cè)效率,但是檢測(cè)特異性存在不足。

熒光定量PCR法(qPCR)作為快速、靈敏且特異性強(qiáng)的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品微生物檢驗(yàn)領(lǐng)域,在qPCR法基礎(chǔ)上通過研發(fā)新型DNA染料建立的EMA-qPCR和PMA-qPCR法可有效區(qū)分活和死的微生物,是近些年來興起的活菌檢測(cè)技術(shù),在食品乳酸菌活菌檢測(cè)中的研究報(bào)道日益增多。本文綜述了近年來國內(nèi)外研究學(xué)者對(duì)食品中乳酸菌定量檢測(cè)方法的研究進(jìn)展,以平板計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)為基礎(chǔ),重點(diǎn)闡述了熒光定量PCR法及前沿的 PMA-qPCR法在食品乳酸菌定量檢測(cè)中的方法原理、應(yīng)用現(xiàn)狀和技術(shù)優(yōu)勢(shì),引發(fā)研究者對(duì)該方法的深入思考,也為更好地開發(fā)熒光定量PCR技術(shù)在食品乳酸菌活菌檢測(cè)中的應(yīng)用提供參考。

1 平板菌落計(jì)數(shù)法

平板菌落計(jì)數(shù)法是一種統(tǒng)計(jì)菌落總數(shù)的常用微生物學(xué)方法,目前我國食品中乳酸菌的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)為GB 4789.35-2016[6],采用的就是平板計(jì)數(shù)法,具體方法如表1所示。

表1 現(xiàn)行國標(biāo)GB 4789.35-2016檢測(cè)食品中乳酸菌數(shù)量Table 1 Number of lactic acid bacteria in food detected by current national standard GB 4789.35-2016

平板菌落計(jì)數(shù)法作為最常用的也是現(xiàn)行國標(biāo)中的檢測(cè)方法,其中平板培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)條件和接種方法等對(duì)計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大的影響,現(xiàn)有研究對(duì)培養(yǎng)基成分優(yōu)化的研究報(bào)道最多。方改霞等[8]報(bào)道了向MRS培養(yǎng)基中加入適量硫酸多粘菌素和放線菌酮可抑制大腸菌群和致病菌等雜菌生長(zhǎng),從而增加對(duì)活菌型乳酸菌飲料中乳酸菌計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。蔡芷荷等[9]研究表明添加2.5 mg/100 mL莫匹羅星鋰鹽(Li-MUP)能明顯區(qū)分保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌與雙歧桿菌。蔣曙光等[10]開發(fā)了用于區(qū)分雙歧桿菌和其他乳酸菌的顯色培養(yǎng)基。黃寶瑩等[11]研究表明含氧量對(duì)不同乳酸菌樣品的計(jì)數(shù)結(jié)果影響較大。多篇文獻(xiàn)[8,11-13]研究表明傾注法接種的乳酸菌生長(zhǎng)情況更好,計(jì)數(shù)結(jié)果也較涂布法更為準(zhǔn)確。

平板菌落計(jì)數(shù)法操作簡(jiǎn)便,結(jié)果直觀準(zhǔn)確。然而,該方法也存在弊端,主要表現(xiàn)在操作工作量大,此外,檢驗(yàn)周期長(zhǎng)(72 h左右)是最大的缺點(diǎn),尤其對(duì)原本貨架期較短的發(fā)酵乳制品的檢測(cè)更為不利[14]。因此,快速檢測(cè)食品中乳酸菌數(shù)量則是對(duì)食品企業(yè)及監(jiān)管部門提出的更高要求。

2 流式細(xì)胞術(shù)

2.1 流式細(xì)胞術(shù)的檢測(cè)原理

流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry,FCM)是基于流式細(xì)胞儀的一種檢測(cè)技術(shù),當(dāng)帶有熒光標(biāo)記的細(xì)胞進(jìn)入儀器內(nèi)液流系統(tǒng)時(shí)被鞘液包裹而形成單細(xì)胞懸液,單細(xì)胞懸液經(jīng)過噴嘴進(jìn)入光學(xué)檢測(cè)系統(tǒng),被激光激發(fā)而產(chǎn)生特異性熒光,熒光的強(qiáng)弱與細(xì)胞標(biāo)記的熒光分子多少相關(guān),從而可定量分析出細(xì)胞中DNA、RNA或者某蛋白質(zhì)的含量以及細(xì)胞數(shù)量[15]。FCM在微生物學(xué)領(lǐng)域如菌體計(jì)數(shù)、活性判斷、在線監(jiān)測(cè)等方面的應(yīng)用廣泛[16]。

2.2 FCM定量檢測(cè)乳酸菌

FCM在分析乳酸菌過程中通常與免疫熒光技術(shù)結(jié)合,熒光染料的選擇對(duì)于檢測(cè)的成敗至關(guān)重要。Bunthof等[17]研究表明5(6)-羧基二乙酸熒光素琥珀酰亞胺酯(CFDA)和噻唑橙二聚體-1(TOTO-1)的聯(lián)合使用更適用于多種乳酸菌檢測(cè)。Bensch等[18]采用了SYBR Green I和碘化丙酸丙酯PI對(duì)植物乳桿菌發(fā)酵劑進(jìn)行染色,準(zhǔn)確地測(cè)定活細(xì)胞濃度。Salma等[19]報(bào)道了運(yùn)用FCM和BOX/PI染料的組合測(cè)定葡萄酒中乳酸菌。熊濤等[20]運(yùn)用CFDA和PI對(duì)細(xì)胞進(jìn)行雙染,通過熒光強(qiáng)度對(duì)比分析出細(xì)胞膜受損與未受損細(xì)胞的量。劉洋等[21]建立了FCM結(jié)合SYTO?24和碘化丙錠染色的乳酸菌檢測(cè)方法。

除了染料的選擇,樣品的預(yù)處理方法也是FCM定量檢測(cè)乳酸菌的關(guān)鍵影響因素。發(fā)酵乳是最常見的檢測(cè)乳酸菌的食品,其主要成分為生乳,而生乳的成分復(fù)雜,含有多種微粒和膠體物質(zhì),檢測(cè)的干擾因素多。Gunasekera等[22]報(bào)道先用酶法清除乳中的蛋白和脂粒,應(yīng)用FCM在1 h內(nèi)快速測(cè)定出牛奶中的總細(xì)菌。Bunthof等[23]通過優(yōu)化原料的清潔處理方法提高了信噪比,并使乳中植物乳桿菌WCFS1的提取率保持較高水平且菌體活力不受此步驟的影響。王寧等[7]通過對(duì)生乳采用酶法消化蛋白質(zhì)顆粒、高速離心脫脂的方式來消除大顆粒物質(zhì)對(duì)流式檢測(cè)的影響,并對(duì)菌體進(jìn)行熱處理,使其易于被熒光性染料PI染色。

如今FCM對(duì)食品中乳酸菌定量檢測(cè)日趨成熟。2015年,國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(ISO)已經(jīng)頒布了FCM測(cè)定乳及乳制品、發(fā)酵劑及發(fā)酵產(chǎn)品和益生菌制品中乳酸菌數(shù)量的方法標(biāo)準(zhǔn)[7]。該標(biāo)準(zhǔn)通過對(duì)DNA、原生質(zhì)體和膜電位三處進(jìn)行染色的方法實(shí)現(xiàn)了對(duì)活性乳酸菌的準(zhǔn)確計(jì)數(shù),檢測(cè)范圍為104～108CFU/mL。國內(nèi)杜耿記等[24]對(duì)29種商品乳的FCM檢測(cè)結(jié)果與GB 4789.35-2010 國標(biāo)方法對(duì)比顯示出較高的一致性,且FCM檢測(cè)單一樣品僅需13 min。

2.3 FCM的優(yōu)勢(shì)與問題

FCM在檢測(cè)過程中無需培養(yǎng)細(xì)菌,大大縮短了檢測(cè)時(shí)間。此外,FCM檢測(cè)具有更高的準(zhǔn)確度,且能辨別活/死菌分別進(jìn)行計(jì)數(shù)[21]。雖然國際上已確定FCM為檢測(cè)發(fā)酵品中乳酸菌的標(biāo)準(zhǔn)方法,但是該方法仍存在一定的缺陷:儀器昂貴,運(yùn)行操作費(fèi)用高;染料對(duì)于待檢菌株靈敏度的不同可能引起檢測(cè)數(shù)據(jù)的不準(zhǔn)確;對(duì)于復(fù)雜樣品如生乳,需要進(jìn)行前處理才能得到準(zhǔn)確結(jié)果[7,22-23];不能特異性針對(duì)樣品中的某一種或多個(gè)菌株分別進(jìn)行檢測(cè)。因此,關(guān)于FCM檢測(cè)乳酸菌的研究仍舊需要優(yōu)化和完善,如Geng等[25]將FCM與多克隆抗體結(jié)合建立了一種乳品中動(dòng)物雙歧桿菌的快速特異性計(jì)數(shù)方法。

3 熒光定量PCR法

3.1 檢測(cè)原理

熒光定量PCR法(簡(jiǎn)稱qPCR法)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針,對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤,通過儀器和相應(yīng)軟件分析結(jié)果,對(duì)待測(cè)樣品中的初始模板進(jìn)行定量分析,包括SYBR Green染料和TaqMan熒光探針的方法(下文簡(jiǎn)稱染料法和探針法)。

3.2 qPCR法檢測(cè)食品中的乳酸菌

本文就我國近年來使用qPCR技術(shù)對(duì)食品中乳酸菌定量檢測(cè)的研究方法列表見表2。實(shí)際操作中該方法主要受引物設(shè)計(jì)、DNA模板制備、qPCR反應(yīng)條件等關(guān)鍵因素的影響。

表2 qPCR技術(shù)檢測(cè)食品中乳酸菌數(shù)量Table 2 Numbers of lactic acid bacteria in food detected by qPCR

3.2.1 引物及其設(shè)計(jì) 根據(jù)待測(cè)菌株的基因信息設(shè)計(jì)特異性引物,通過qPCR法,能夠高效、靈敏和準(zhǔn)確的檢出目標(biāo)微生物。目前特異性引物的設(shè)計(jì)主要是針對(duì)菌株16S rDNA可變區(qū)序列設(shè)計(jì)的,如其木格蘇都等[26]報(bào)道通過對(duì)待測(cè)菌株16S rDNA區(qū)域設(shè)計(jì)引物,在益生菌共生發(fā)酵豆乳飲料中分別檢測(cè)了LactobacilluscaseiZhang和BifidobacteriumlactisV9兩種乳酸菌的數(shù)量。如果待檢微生物具有獨(dú)有基因,那么針對(duì)該基因序列設(shè)計(jì)引物將有助于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性,如陳臣等[29]報(bào)道利用L.plantarumST-III菌株獨(dú)有的KilA結(jié)構(gòu)域蛋白(YP_003924036.1)設(shè)計(jì)引物,檢測(cè)限達(dá)到2.85×103CFU/mL。為了進(jìn)一步提高qPCR法檢測(cè)的特異性,有研究學(xué)者選擇用探針法對(duì)復(fù)雜樣品中的目標(biāo)乳酸菌進(jìn)行定量檢驗(yàn),如張娜娜等[34]通過增加設(shè)計(jì)一條探針引物,對(duì)乳酸菌飲料樣品中的L.acidophilusNCFM菌株進(jìn)行定量檢測(cè),檢測(cè)的絕對(duì)靈敏度達(dá)到3 pg,相對(duì)靈敏度達(dá)到了103CFU/mL。

3.2.2 樣品DNA提取 選擇合適的DNA提取方法以獲得高質(zhì)量的模板DNA也是qPCR法成功的一個(gè)決定因素。由于含乳酸菌的食品樣本如酸奶、乳酸菌飲料或奶酪等一般成分復(fù)雜,偏酸性且不均一,因此食品中乳酸菌DNA的提取需要先除雜[23]。由于乳酸菌是革蘭氏陽性細(xì)菌,其細(xì)胞壁具有致密的肽聚糖層而不易破碎,因此,乳酸菌DNA的提取具有較大的難度,目前提取含乳酸菌的食品樣本或乳酸菌菌液DNA主要采用酶解法、堿式提取法、試劑盒法等[31,35]。劉紅娟等[36]利用溶菌酶破壞乳球菌KLDS4.0309、KLDS4.0311和乳桿菌KLDS1.0316、KLDS14-1的細(xì)胞壁。吳艷濤等[31]使用鏈霉蛋白酶E處理提取發(fā)酵乳中的雙歧桿菌。臧凱麗等[37]采用球磨-CTAB法結(jié)合堿式提取法提取嗜酸乳桿菌基因組DNA。如今文獻(xiàn)報(bào)道最多的提取乳酸菌DNA的方法是試劑盒法[27,30,38],該方法具有普遍的適用性。

3.2.3 qPCR反應(yīng)條件 qPCR反應(yīng)的重要條件包括模板DNA濃度、退火溫度以及PCR的循環(huán)次數(shù)等。魏霜等[39]為了檢測(cè)微生物肥料中的鼠李糖乳桿菌設(shè)計(jì)了DPO引物,同時(shí)探究了不同退火溫度下該引物的特異性;張娜娜等[34]根據(jù)L.acidophilusNCFM的SPIDR保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物與探針,并對(duì)擴(kuò)增溫度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明60 ℃擴(kuò)增效率最高。

綜上所述,qPCR法具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn),在乳酸菌檢測(cè)方面的研究報(bào)道較多。但是,由于活的乳酸菌數(shù)量才具有實(shí)際檢測(cè)意義,因此無法對(duì)活/死菌進(jìn)行區(qū)分是該方法的嚴(yán)重不足[40]。

4 PMA-qPCR法

4.1 檢測(cè)原理

疊氮溴化乙錠(EMA)和疊氮溴化丙錠(PMA)是一類新型DNA高親和力的光敏反應(yīng)染料,染料嵌入雙鏈DNA中在強(qiáng)烈的可見光下可形成共價(jià)連接的化學(xué)修飾,修飾后的DNA不能經(jīng)PCR擴(kuò)增[41]。由于EMA和PMA完全不能透過細(xì)胞膜,這一特性使得它們可以和qPCR法聯(lián)合使用,進(jìn)行選擇性的擴(kuò)增活細(xì)胞DNA,而不擴(kuò)增死細(xì)胞(細(xì)胞壁和細(xì)胞膜已破損的細(xì)胞)DNA,大大提高了活菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性,原理如圖1所示[42]。有研究者發(fā)現(xiàn),EMA處理會(huì)造成活菌的基因組DNA的損失,因此選用PMA染料的該類研究更多[43]。

圖1 利用PMA染料選擇性檢測(cè)活細(xì)胞的原理Fig.1 Principle of selective detection ofviable cells using PMA dye

4.2 PMA-qPCR法檢測(cè)食品中的乳酸菌

目前PMA-qPCR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用在食品、食品接觸材料和水環(huán)境中的致病微生物的安全檢測(cè)中[44-45]。自2009年García-Cayuela等[46]首次報(bào)道了利用PMA-qPCR技術(shù)檢測(cè)發(fā)酵乳中的乳酸菌活菌數(shù)量之后,近幾年相關(guān)報(bào)道逐漸增多,但國內(nèi)的相關(guān)研究很少。本文將已報(bào)道的PMA-qPCR技術(shù)用于乳酸菌活菌數(shù)量檢測(cè)的研究結(jié)果列于表3,并對(duì)該技術(shù)的關(guān)鍵因素控制展開討論。

表3 PMA-qPCR技術(shù)檢測(cè)乳酸菌食品Table 3 Lactic acid bacteria food detected by PMA-qPCR

4.2.1 引物及其設(shè)計(jì) 與常規(guī)qPCR技術(shù)相類似,目前PMA-qPCR技術(shù)檢測(cè)單一乳酸菌的活菌數(shù)量已經(jīng)在很多乳酸菌菌株中研究成功,如副干酪乳桿菌、保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌BB12[46]等。我國張和平團(tuán)隊(duì)也報(bào)道了PMA-qPCR技術(shù)檢測(cè)植物乳桿菌P-8的研究[47]。Desfossés-Foucault等[48]在定量檢測(cè)鼠李糖乳桿菌時(shí),還設(shè)計(jì)了一條探針引物以進(jìn)一步確保對(duì)目標(biāo)菌株計(jì)數(shù)的靈敏性和準(zhǔn)確性。但是,由于在乳酸菌食品中,一般是多種乳酸菌混合添加的,因此,同時(shí)檢測(cè)不同種乳酸菌的活菌數(shù)將更符合乳酸菌檢驗(yàn)的實(shí)際需要。Zorica等[49]報(bào)道了利用設(shè)計(jì)的兼并引物,同時(shí)對(duì)Lb.plantarum564和Lb.paracaseiZ-8進(jìn)行檢測(cè)。Desfossés-Foucault等[46]報(bào)道了設(shè)計(jì)通用引物對(duì)契達(dá)奶酪中乳球菌屬菌株進(jìn)行活菌檢測(cè)。此外,在腸道菌群的研究中,通過設(shè)計(jì)通用引物對(duì)腸道中雙歧桿菌屬、乳桿菌屬等不同種屬微生物進(jìn)行定量檢測(cè)可為乳酸菌食品中分類檢測(cè)乳酸菌提供有利參考條件。

4.2.2 膜損傷菌的制備 膜損傷菌的制備直接影響到PMA染料與“死細(xì)胞”DNA的結(jié)合效率,是建立PMA-qPCR法檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前,膜損傷菌的制備方法報(bào)道有熱致死法、玻璃珠破碎法、有機(jī)溶劑處理法、紫外線處理法和凍融法等多種[50],而在乳酸菌的研究中,大都采用熱致死處理法,但熱處理的具體條件不一致。Reimann等[51]采用56 ℃處理B.longumNCC2705。Scariot等[52]研究結(jié)果顯示對(duì)副干酪乳桿菌60- ℃處理30 min效果最佳。Lai等[53]研究表明,在100 ℃熱處理30 min的條件下,干酪乳桿菌死菌的DNA已不再被檢出,而唾液酸乳桿菌死菌的DNA仍舊有少量被檢出。

4.2.3 PMA染料的工作條件優(yōu)化 PMA染料的工作條件具體包括PMA染料濃度、光反應(yīng)時(shí)間和暗反應(yīng)時(shí)間等因素[54],需要根據(jù)檢測(cè)菌株特性、菌株數(shù)量和實(shí)際檢測(cè)樣品中活菌數(shù)量的不同而優(yōu)化研究。García-Cayuela等[46]檢測(cè)發(fā)酵酸奶中的雙歧桿菌的PMA處理?xiàng)l件為濃度50 μmol/L,暗反應(yīng)5 min和光反應(yīng)15 min,而Fujimoto等[55]檢測(cè)短雙歧桿菌時(shí)PMA處理光反應(yīng)2 min。Pinheiro等[56]檢測(cè)糞腸球菌的最佳PMA工作條件為濃度100 μmol/L,暗反應(yīng)5 min和光反應(yīng)10 min。

5 數(shù)字PCR法

5.1 檢測(cè)原理

數(shù)字PCR(dPCR)技術(shù)是一種核酸分子的絕對(duì)定量技術(shù),主要分為基于芯片的dPCR(chip digital PCR,cdPCR)和基于微滴的dPCR(droplet dPCR,ddPCR)這兩大類。其中cdPCR的主要原理是將反應(yīng)體系通過微流控等技術(shù)均勻地導(dǎo)入到含有數(shù)萬個(gè)小孔的芯片上,每個(gè)小孔作為一個(gè)反應(yīng)室;而ddPCR則是將PCR反應(yīng)體系均勻地分割成大量的乳液包裹的微小液滴,實(shí)現(xiàn)每個(gè)反應(yīng)微滴只有單個(gè)或幾個(gè)模板分子進(jìn)行擴(kuò)增[57-58]。由于dPCR是通過采集陽性信號(hào)與陰性信號(hào)的比例,按照泊松分布統(tǒng)計(jì)學(xué)方法直接確定原始反應(yīng)體系中樣品的數(shù)量,因此從原理上克服了傳統(tǒng)PCR易受引物之間的相互干擾以及DNA樣品的純度等因素的影響的缺點(diǎn),可實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜樣本模板的各自不同引物PCR檢測(cè)[59]。

5.2 dPCR法在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用

目前,dPCR技術(shù)在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用研究日益增多[60]。Li等[61]利用dPCR技術(shù)與測(cè)序技術(shù)相結(jié)合,特異性檢測(cè)食品樣本中產(chǎn)溶血素的副溶血性弧菌,該研究結(jié)果比傳統(tǒng)基于副溶血性弧菌分離的方法所得的結(jié)果更準(zhǔn)確,降低了假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。蔡教英等[58]利用dPCR技術(shù)精準(zhǔn)定量轉(zhuǎn)基因油菜中RF1基因含量,檢測(cè)限和最低檢測(cè)限分別為18拷貝/反應(yīng)和3.7拷貝/反應(yīng)。Floren等[62]報(bào)道了dPCR法對(duì)加工肉制品中牛、馬和豬肉含量的精確定量,結(jié)果顯示dPCR法在不同肉制品中的定量限和檢測(cè)限分別為0.01%和0.001%,顯著優(yōu)于qPCR法。近年來dPCR法已納入多項(xiàng)食品檢測(cè)國家標(biāo)準(zhǔn)中,主要涉及轉(zhuǎn)基因食品的檢測(cè)[63-64]和食源性病原微生物的檢測(cè)[65]。2018年Hansen等[66]報(bào)道了PMA結(jié)合基因芯片dPCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)混菌樣品中L.acidophilusNCFM和B.animalissubsp.lactisBl-04的活菌數(shù)量,得出的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為5%和4%,顯著優(yōu)于平板計(jì)數(shù)法(15%),可見該方法精確度高,穩(wěn)定性強(qiáng)。目前,國內(nèi)還未有dPCR技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌食品檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道,可以預(yù)見,隨著dPCR技術(shù)的研究與推廣,其在乳酸菌檢測(cè)中的應(yīng)用也會(huì)愈加廣泛。

6 展望

食品中乳酸菌定量檢測(cè)的核心是活菌檢測(cè)?，F(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)采用平板計(jì)數(shù)法,該方法直觀易行,是活菌檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”,但是該方法最大的缺點(diǎn)是耗時(shí)長(zhǎng),不能滿足食品行業(yè)快速檢測(cè)的發(fā)展需要,開發(fā)快速檢測(cè)方法勢(shì)在必行。此外,平板計(jì)數(shù)法得到結(jié)果的準(zhǔn)確性也存在一些爭(zhēng)議。一些研究者指出平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)的是可培養(yǎng)的活菌,而實(shí)際樣品中存在未能培養(yǎng)的活菌[69],這些活菌也可能對(duì)產(chǎn)品功效起作用,因此其數(shù)量也需要準(zhǔn)確測(cè)量。

流式細(xì)胞術(shù)(FCM)的應(yīng)用極大縮短了樣品的檢驗(yàn)時(shí)間,根據(jù)歐盟標(biāo)準(zhǔn)采用FCM對(duì)食品中乳酸菌活菌定量測(cè)定,檢測(cè)時(shí)間約20～30 min,極大提高了檢測(cè)效率。該方法的檢測(cè)原理是針對(duì)標(biāo)記的微生物直接計(jì)數(shù),因此檢測(cè)結(jié)果比依賴培養(yǎng)的平板計(jì)數(shù)法更為準(zhǔn)確。但是FCM法的局限性在于不能特異性檢測(cè)食品中特定乳酸菌,因此不適用于樣品中存在污染雜菌等情況。此外,由于含乳酸菌食品常為發(fā)酵乳,樣品成分復(fù)雜,檢測(cè)背景高,會(huì)干擾檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。因此,FCM技術(shù)的發(fā)展需要結(jié)合特異性檢驗(yàn)技術(shù)、預(yù)處理方法的優(yōu)化及靈敏度更高的熒光染料的開發(fā)以增強(qiáng)該方法的適用范圍及提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度。

熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)通過設(shè)計(jì)特異性引物有效地檢驗(yàn)樣本中的特定微生物,該方法快速、靈敏,在食品微生物檢驗(yàn)中廣泛應(yīng)用,對(duì)食品中特定乳酸菌的檢驗(yàn)研究報(bào)道有很多[61,70-71]。但是由于不能區(qū)分活/死菌,qPCR法在乳酸菌食品檢驗(yàn)中遇到難題。近年來,隨著EMA/PMA染料的開發(fā),EMA/PMA結(jié)合qPCR法檢測(cè)食品中特定活菌的研究報(bào)道日益增多,但該方法在食品乳酸菌檢驗(yàn)的應(yīng)用研究報(bào)道不多。通過本文對(duì)PMA-qPCR法的工作原理、操作步驟及應(yīng)用實(shí)例的詳細(xì)闡述,不難判斷,選用PMA-qPCR法對(duì)食品中乳酸菌活菌定量分析是可行的,且該方法靈敏度高、檢測(cè)時(shí)間短,符合快速檢驗(yàn)的食品檢測(cè)行業(yè)發(fā)展需求。但是,隨著越來越多不同種類的益生菌開發(fā)并添加至食品中,對(duì)食品中多種乳酸菌的同時(shí)定量檢測(cè)將成為乳酸菌食品的更高的檢測(cè)要求,因此qPCR技術(shù)不僅需要結(jié)合PMA等染料的研發(fā)區(qū)分活/死菌,還需要結(jié)合更前沿的微流控、基因芯片等高通量檢測(cè)技術(shù)(如dPCR技術(shù))等,才能符合乳酸菌食品更高的檢驗(yàn)要求。這將是對(duì)每一位乳酸菌檢驗(yàn)研究的工作者的挑戰(zhàn)。

綜上所述,國內(nèi)外對(duì)食品中乳酸菌的活菌檢驗(yàn)的研究不斷發(fā)展,涌現(xiàn)出基于不同工作原理下的檢測(cè)方法,主要有平板計(jì)數(shù)法、FCM法及熒光定量PCR法。本文綜述了各方法的工作原理、研究現(xiàn)狀及發(fā)展動(dòng)態(tài),總結(jié)了各自的優(yōu)缺點(diǎn),為把握食品中乳酸菌活菌定量檢測(cè)的行業(yè)方向提供依據(jù)?？梢灶A(yù)見,隨著多學(xué)科交叉,更多檢測(cè)技術(shù)將不斷深入研究與完善,對(duì)食品中乳酸菌“快速”和“精準(zhǔn)”檢測(cè)的目標(biāo)不久將會(huì)實(shí)現(xiàn)。