芍藥甘草湯及其拆方對超高溫環(huán)境大鼠Ach、PGE2和HSP70 含量的影響*

★ 左錚云** 吳瑩瑩 王琳 劉春花 王炳志 姚鳳云***

（江西中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 南昌 330004）

高溫作業(yè)是當(dāng)前從事農(nóng)業(yè)、建筑業(yè)、環(huán)衛(wèi)、煉油、交通、冶煉、煉焦、石油地質(zhì)勘探等眾多行業(yè)群體不可回避的現(xiàn)實(shí)問題［1］。然而，眾多研究資料表明，高溫作業(yè)可引起體溫、代謝、消化系統(tǒng)、循環(huán)系統(tǒng)等多方面的損害，嚴(yán)重的可危及生命［2-4］。如何預(yù)防或降低高溫環(huán)境對高溫作業(yè)者的損害，維護(hù)生命的健康與完美，成為各國領(lǐng)導(dǎo)人、管理者、科學(xué)家以及廣大勞動者共同關(guān)注的突出問題［5］。芍藥甘草湯是漢代醫(yī)家張仲景所創(chuàng)造的“酸甘化陰”配伍的代表方劑，“酸甘化陰”是方劑性味配伍中五味配伍法之一，現(xiàn)代研究表明，酸甘化陰法可以有效補(bǔ)充陰精，減緩陰精的虧耗，甚至對于延長壽命也有著重要意義［6］。本課題組研究發(fā)現(xiàn)芍藥甘草湯及其拆方能降低高溫環(huán)境下大鼠的死亡率，并選擇Ach、PGE2、HSP70 為主要評價指標(biāo)，對芍藥甘草湯“酸甘化陰”配伍耐高溫機(jī)理進(jìn)行探討。

1 材料

1.1 動物 SPF 級SD 雄性大鼠，7～8 周齡，購于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司，合格證號：SCXK（湘）2013-0004。

1.2 藥品 白芍、甘草均購自北京同仁堂（亳州）飲片有限公司，產(chǎn)地分別是安徽、內(nèi)蒙古。 批號分別為：301003383P、401133319P。

1.3 主要試劑 大鼠Ach、PGE2、HSP70 酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒，均購自武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號為L171109660、L171013561、L171109692。

1.4 主要儀器 電子分析天平（型號為BT-25-S），賽多利斯科學(xué)儀器公司生產(chǎn)；漩渦混合器（型號為XW-80A），上海青浦瀘西儀器廠生產(chǎn)；智能型人工氣候箱（型號為RXZ），寧波江南儀器公司生產(chǎn)；多樣品組織研磨機(jī)（型號為Tissuelyser 24），上海凈信科技生產(chǎn)；酶標(biāo)儀（型號為Chromate4300），美國Awareness 公司生產(chǎn)；煎藥壺（型號為A7），齊家電器有限公司生產(chǎn)；低溫離心機(jī)（型號為CT14RD），上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司生產(chǎn)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動物分組 SPF 級SD 雄性大鼠75 只，在常溫（23±2）℃環(huán)境適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為5 組，即常溫正常組、高溫正常組、芍藥甘草湯組、單味白芍組和單味甘草組，每組15 只。

2.2 飼養(yǎng)環(huán)境 實(shí)驗(yàn)動物分組后均飼養(yǎng)于人工氣候箱，高溫組儀器條件設(shè)置：每天上午9～10 點(diǎn)溫度從30℃升至36℃，10～15 點(diǎn)從36℃升至39℃，其它時間段飼養(yǎng)溫度均控制在（31±1）℃，濕度為55%；常溫組飼養(yǎng)溫度為（23±2）℃，濕度為45%，晝夜交替光照，24h 為一個循環(huán)。

2.3 實(shí)驗(yàn)方案 各組動物分別置于“2.2”環(huán)境飼養(yǎng)，每天上午9 時分別灌胃給予各組動物相應(yīng)的藥物1 次，芍藥甘草湯組、單味芍藥組、單味甘草組給藥劑量分別為2.16g/kg、1.08g/kg、1.08g/kg，給藥體積均為10mL/kg，每3d 稱量一次體重，常溫正常組和高溫正常組均給予等體積的純凈水。在連續(xù)給藥/水13d 后參照文獻(xiàn)方法處理動物并采集血清、腦、心、肝組織［5］，分離血清及組織勻漿上清液，按照ELISA 試劑盒說明書檢測Ach、PGE2、HSP70含量。大鼠處理前禁食但不禁水14h。

2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)計數(shù)資料以表示。兩樣本間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)，無序分類資料采用卡方檢驗(yàn)Fisher 精確概率法，以P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

3 結(jié)果

3.1 芍藥甘草湯及其拆方對超高溫環(huán)境大鼠存活情況的影響

表1 芍藥甘草湯及其拆方對大鼠存活情況的影響 只（%）

由表1 可知，與高溫正常組相比，芍藥甘草湯及其拆方組大鼠死亡率均有不同程度降低，死亡率從低到高依次為單味甘草組26.67%、芍藥甘草湯組33.33%和單味白芍組46.67%。五組大鼠存活情況比較采用卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示P＜0.01（P=0.008，t=13.388），說明五組存活情況比較有差異，且差異極顯著。

3.2 芍藥甘草湯及其拆方對超高溫環(huán)境大鼠血清Ach、PGE2含量的影響

表2 芍藥甘草湯及其拆方對大鼠血清Ach、PGE2含量的影響pg·mL-1

由表2 可知，在超高溫環(huán)境下，大鼠血清Ach和PGE2含量均呈現(xiàn)上升趨勢，其中以Ach 上升的幅度尤為顯著（P＜0.01）；各給藥組對高溫所致大鼠血清Ach 的升高無明顯的對抗作用，而對血清PGE2水平的上升均呈現(xiàn)協(xié)同作用，其中以芍藥甘草湯組和單味白芍組的增高幅度尤為突出（P＜0.05，P＜0.01），單味甘草組PGE2含量雖略有升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3.3 芍藥甘草湯及其拆方對超高溫環(huán)境大鼠腦、心、肝組織HSP70 含量的影響

表3 芍藥甘草湯及其拆方對大鼠心、肝組織HSP70含量的影響 ng·mL-1

由表3 可知，在超高溫環(huán)境下，大鼠腦、心、肝組織HSP70 含量均呈現(xiàn)上升趨勢，其中以腦、肝組織的上升幅度尤為顯著（P＜0.05，P＜0.01）；各給藥組對超高溫所致腦組織HSP70 的升高均有顯著的對抗作用（P＜0.05，P＜0.01），但對肝組織HSP70 的升高均無下調(diào)趨勢，而單味甘草組則可顯著下調(diào)心肌HSP70 水平（P＜0.01）。

4 討論

芍藥甘草湯始載于《傷寒論》太陽病篇，該方由芍藥、甘草兩味藥組成，是“酸甘化陰”的代表方劑?！八岣驶帯笔峭ㄟ^酸甘藥物的配伍以補(bǔ)陰補(bǔ)血、生津補(bǔ)液的一種配伍方法［7］，這里的“陰”即血和津液。當(dāng)處于高溫環(huán)境下，機(jī)體通過散熱來維持機(jī)體體溫的相對恒定，人體散熱主要通過皮膚來完成的，環(huán)境溫度愈高，人體出汗則愈多［8］。而汗是由人體陽氣蒸化陰液所化生［9］，出汗越多，陰液損耗就越大，這與芍藥甘草湯可治療營陰不足之證［10］相符。

在高溫環(huán)境下，機(jī)體因熱平衡和水鹽代謝紊亂等因素造成體溫調(diào)節(jié)異常，體溫調(diào)節(jié)由中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)共同協(xié)作完成［11］。本課題前期研究表明，高溫條件下，Ach 作為一種外周神經(jīng)遞質(zhì)，可支配心血管功能，使全身血管擴(kuò)張以達(dá)成散熱目的［12］。此外，Ach 還有心肌保護(hù)作用［13］。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，超高溫環(huán)境可導(dǎo)致大鼠血清Ach 含量顯著上升，但各給藥組對其上升均無明顯的調(diào)節(jié)作用。

PGE2是最強(qiáng)的中樞發(fā)熱介質(zhì)之一［14-15］，下丘腦視前區(qū)（POAH）為主要調(diào)節(jié)體溫變化的中樞區(qū)域。PGE2與POAH 區(qū)域的EP3 受體結(jié)合，繼而引起發(fā)熱［16］。同時，PGE2也是重要的炎癥介質(zhì)，其還可通過上調(diào)具有神經(jīng)保護(hù)作用的熱休克蛋白（HSPs）而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用［17］。HSPs 是細(xì)胞在受到損傷時細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的一組具有維持細(xì)胞功能穩(wěn)定的蛋白質(zhì)［18］，由熱和各種有害刺激誘發(fā)，其中HSP70 對熱的反應(yīng)最為敏感。機(jī)體或細(xì)胞受到應(yīng)激刺激時，HSP70 合成增加， 使機(jī)體或細(xì)胞受到的耐熱性提高，損傷減輕，恢復(fù)速度加快，因此HSP70 水平升高可以暫時保護(hù)整個器官免受缺血性損傷［19-20］。本研究結(jié)果顯示，超高溫可使大鼠血清PGE2、腦、心、肝組織HSP70 含量均呈現(xiàn)一定的上升趨勢，且各給藥組對PGE2的上升均呈現(xiàn)不同程度的協(xié)同作用，其中芍藥甘草湯組和單味芍藥組的協(xié)同作用尤為顯著（P＜0.05，P＜0.01），而各給藥組對超高溫所致腦組織HSP70 的升高均有顯著的下調(diào)作用（P＜0.05，P＜0.01），但均對肝組織HSP70 的升高均無下調(diào)趨勢，單味甘草組則可顯著下調(diào)心肌HSP70 水平（P＜0.01）。綜上所述，課題組認(rèn)為，芍藥甘草湯及其拆方耐大鼠高溫死亡機(jī)制可能與其刺激機(jī)體產(chǎn)生某種類似于HSPs 類物質(zhì)或通過上調(diào)血清PGE2水平增強(qiáng)原有HSP70 作用有關(guān)，其結(jié)果有待進(jìn)一步驗(yàn)證。