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    二至丸對去卵巢所致AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響*

    2020-06-17 09:54:34周茂福黃麗萍劉超侯敏燕波官揚謝永艷彭楊鵬陳耀輝
    關(guān)鍵詞:迷宮海馬低劑量

    ★ 周茂福 黃麗萍 劉超 侯敏 燕波 官揚 謝永艷 彭楊鵬 陳耀輝

    (1.江西中醫(yī)藥大學(xué) 南昌 330004;2.江西中醫(yī)藥大學(xué)科技學(xué)院 南昌 330004;3.江西省人民醫(yī)院腎內(nèi)科 南昌 330006)

    阿爾茨海默?。╝lzheimer's disease, AD)是進(jìn)行性記憶和認(rèn)知功能障礙為特征的神經(jīng)退行疾病,其主要病理變化表現(xiàn)有膽堿神經(jīng)元缺失、細(xì)胞外Aβ 沉積和細(xì)胞內(nèi)高度磷酸化Tau 蛋白形成。AD發(fā)病率逐年增高,但目前尚無特效防治藥物。越來越多的資料證明,AD 的發(fā)生與雌激素水平低下密切相關(guān)。流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,女性絕經(jīng)后AD 的發(fā)病率是同齡男性的1.5~3 倍[1-2],并且伴隨著絕經(jīng)后雌激素的減少癡呆的發(fā)生率越高。臨床上雌激素替代療法能顯著改善絕經(jīng)期婦女AD 的相關(guān)癥狀[3],但會給患者增加患腫瘤的風(fēng)險,從天然藥物中尋找有效的AD 防治藥物是目前研究的熱點。

    “腎主智”,腎虛是AD 發(fā)生內(nèi)在機(jī)理,女性絕經(jīng)期前后,天癸將竭,腎精日衰,沖任二脈逐漸虧虛,雌激素分泌不足,腦髓失養(yǎng),發(fā)為癡呆。二至丸由女貞子、墨旱蓮二味中藥組成,功能補肝腎、益精血之功效?,F(xiàn)代藥理研究表明,二至丸可改善D-半乳糖致衰老模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力,具有清除腦自由基、抗衰老和神經(jīng)元保護(hù)等作用[4]。但二至丸能否能改善雌激素缺乏所致AD 動物的認(rèn)知能力?目前未有研究。因此,觀察二至丸對雌激素低下AD 動物學(xué)習(xí)記憶能力的影響,將為臨床應(yīng)用二至丸防治AD 的研究提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗藥物 二至丸,江西中醫(yī)藥大學(xué)自制,批號:20150803,規(guī)格:48g/瓶。用研缽研磨并用雙蒸水配成二至丸高劑量0.2g/mL、低劑量0.1g/mL混懸液。苯甲酸雌二醇購自寧波市三生藥業(yè)有限公司,批號:S141201,用芝麻油稀釋至0.2mg/mL。

    1.2 動 物 昆 明 種 雌 性SPF 級 小 鼠,70 只,22~28g,購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司,動物許可證號:SCXK(湘)2013-0004。

    1.3 試劑 HE 染色試劑盒、尼氏體染色試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司,批號分別是20160810、20160726);免疫組化試劑盒(康為世紀(jì)生物科技有限公司,批號為:40113);Aβ1-40 抗體(艾博抗貿(mào)易有限公司,批號:GR91656-16)。

    1.4 儀器 Y 迷宮、八臂迷宮(荷蘭noldus 公司);分析天平(梅特勒公司);石蠟切片機(jī)(Lecia 公司);顯微鏡(Lecia 公司)。

    1.5 方法

    1.5.1 造模、分組與給藥 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后,摘除卵巢:先用1%戊巴比妥鈉溶液50mg/kg腹腔注射麻醉,末肋骨下皮常規(guī)皮膚消毒,手術(shù)剪縱向切開皮膚,鈍性分離肌肉,找出卵巢并結(jié)扎卵巢下輸卵管,切除脂肪包裹的兩側(cè)卵巢。假手術(shù)組小鼠僅除去卵巢周圍的部分脂肪。手術(shù)一周后,對去卵巢小鼠進(jìn)行陰道上皮脫落細(xì)胞涂片檢查,取角化細(xì)胞持續(xù)5d 陰性者為實驗用。去卵巢小鼠隨機(jī)分為4 組:即模型組、陽性對照組(雌二醇)、二至丸高劑量組、二至丸低劑量組,每組14 只小鼠,另設(shè)14 只為假手術(shù)組。術(shù)后6 周后開始灌胃給藥,模型組、假手術(shù)組用灌胃雙蒸水,二至丸高低劑量組分別灌胃給予2.0g 生藥/Kg、1.0g 生藥/kg,給藥容量為1.0mL/100g,陽性對照組小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇0.1mL/只,隔天注射1 次,連續(xù)32d。

    1.5.2 二至丸對去卵巢AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響 在給藥25d 后,用Y 迷宮和八臂迷宮檢測小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。

    1.5.2.1 Y 迷宮實驗 裝置由三個成120°夾角的臂組成,即迷宮的A、B、C 三個臂。每臂長50cm,高15cm,寬6cm。實驗時將小鼠從A 臂末端放入,讓其在三個臂中自由的出入。然后記錄5min 內(nèi)小鼠進(jìn)入三個臂的順序,接著統(tǒng)計小鼠進(jìn)入各個臂的總次數(shù)N 以及計算自發(fā)交替反應(yīng)率C。一次正確的自發(fā)交替反應(yīng)是連續(xù)進(jìn)入三個不同的臂,它反映了小鼠的記憶能力,其計算公式為:C=正確交替反應(yīng)/(N-2) ×l00%。

    1.5.2.2 八臂迷宮實驗 實驗前2d 小鼠禁食不禁水,體重下降15%~20%。并進(jìn)行連續(xù)2 天的適應(yīng)性訓(xùn)練,檢測記憶實驗開始時,只在迷宮的1、3、5、7 放射臂頭端放入飼料,將小鼠放入八臂迷宮的中心區(qū),先用一個不透明的盒子將其罩住,5s 后移去,記錄檢測以下指標(biāo):①小鼠找到1、3、5、7 臂頭內(nèi)食物所需的總時間。②錯誤總數(shù),即小鼠出現(xiàn)錯誤的總次數(shù),每重復(fù)進(jìn)入已吃過餌的臂1 次記為1次錯誤。③首錯前正確數(shù),即首次錯誤出現(xiàn)前連續(xù)走完正確的臂數(shù)。注意在1、3、5、7 臂外相應(yīng)位置放一些標(biāo)志物,保證在實驗的過程中標(biāo)志物位置和周圍環(huán)境不變,同時整個實驗過程都要在安靜狀態(tài)下進(jìn)行,防止噪音對實驗結(jié)果的影響。

    1.5.3 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬神經(jīng)元影響小鼠1%戊巴比妥鈉50mg/kg 腹腔注射麻醉,PBS 心臟灌流沖洗,4%多聚甲醛灌流進(jìn)行體內(nèi)組織固定,取出海馬組織。在4%甲醛溶液中進(jìn)行固定24h,梯度脫水二甲苯透明后用石蠟加以包埋、切片,切片厚度為4μm,按試劑盒說明進(jìn)行HE 染色、尼氏染色,觀察海馬神經(jīng)元的細(xì)胞形態(tài);光鏡下每張切片計數(shù)3 個視野(400×)的細(xì)胞,總和除以3,作為該鼠的海馬細(xì)胞計數(shù)[5],衡量海馬神經(jīng)元丟失情況。

    1.5.4 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬CA1 區(qū)Aβ 表達(dá)的影響 取右腦標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋,切片,免疫組化染色觀察海馬CA1 區(qū)Aβ 陽性細(xì)胞的表達(dá),并按2.4 法進(jìn)行計數(shù)。

    2 結(jié)果

    2.1 二至丸對去卵巢AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

    2.1.1 Y 迷宮實驗結(jié)果 結(jié)果見表1。與假手術(shù)組比較,模型組小鼠正確交替率明顯較低(P<0.05),與模型組比較,經(jīng)二至丸給藥干預(yù)后低劑量組小鼠正確交替率明顯提高(P<0.05),高劑量組和陽性組正確交替率有提高但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

    表1 二至丸對AD小鼠Y迷宮正確交替率的影響(,n=14)

    表1 二至丸對AD小鼠Y迷宮正確交替率的影響(,n=14)

    注:與模型組比較,*P<0.05。

    組別 劑量 正確交替率/%假手術(shù)組 - 0.67±0.13*模型組 - 0.55±0.09陽性對照組 0.5mg·kg-1 0.66±0.15二至丸高劑量組 2 g·kg-1 0.63±0.12二至丸低劑量組 1 g·kg-1 0.66±0.09*

    圖1 海馬形態(tài)學(xué)觀察(HE染色,×400)

    2.1.2 八臂迷宮實驗結(jié)果 結(jié)果見表2。與假手術(shù)組相對比,模型組小鼠進(jìn)入1、3、5、7 號臂(有效臂)所需的總時間、總錯誤次數(shù)明顯上升,首錯前正確數(shù)降低;與模型組相對比,二至丸高、低劑量組小鼠進(jìn)入1、3、5、7 號臂所需的總時間與總錯誤次數(shù)明顯下降,首錯前正確升高。陽性對照藥雌二醇組小鼠進(jìn)入有效臂總時間也有縮短少,但不具有統(tǒng)計學(xué)差異。

    2.2 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬神經(jīng)元影響 結(jié)果見圖1-2 及表3-4。HE 染色見假手術(shù)組小鼠海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元呈圓形或者橢圓形,細(xì)胞形態(tài)整齊、無破損,核仁清晰,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較多;與假手術(shù)組對比,模型組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元丟失對比嚴(yán)重,細(xì)胞排列稀疏,細(xì)胞核染色較深,核固縮較嚴(yán)重,神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較少;與模型組比照,二至丸高、低劑量組和陽性藥物組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元數(shù)量比模型組多,形態(tài)比較完整,排列比較整齊,核仁較少發(fā)生固縮現(xiàn)象。

    尼氏染色見假手術(shù)組海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞密集,胞漿內(nèi)含有豐富的尼氏小體,甲苯胺藍(lán)染色較深,尼氏體數(shù)量較多;與假手術(shù)相比,模型組小鼠CA1 區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列疏松,神經(jīng)元丟失以及核固縮嚴(yán)重,尼氏小體隨神經(jīng)元的丟失而減少;與模型組比較,二至丸高、低劑量組和陽性藥物組神經(jīng)元細(xì)胞較為完整,尼氏小體染色較深且數(shù)量明顯增加,但與假手術(shù)組比較,尼氏小體染色較淺。

    圖2 海馬CA1區(qū)形態(tài)學(xué)觀察(尼氏染色,×200)

    表2 二至丸對AD小鼠八臂迷宮總時間、錯誤總數(shù)、首錯前正確數(shù)(,n=14)

    表2 二至丸對AD小鼠八臂迷宮總時間、錯誤總數(shù)、首錯前正確數(shù)(,n=14)

    注:與模型組比較,*P<0.05。

    組別 劑量 進(jìn)入有效臂所用時間/s 錯誤總數(shù)/次 首錯前正確數(shù)/次假手術(shù)組 - 56.33±35.92* 3.2±0.94* 2.3±0.79*模型組 - 169.40±79.28 4.8±1.33 1.33±0.49陽性對照組 0.5mg·kg-1 105.89±86.09 3.3±1.05* 1.7±0.67二至丸高劑量組 2g·kg-1 49.26±32.91* 3.1±0.74* 2.0±0.66*二至丸低劑量組 1g·kg-1 63.79±46.47* 3.6±1.19* 1.7±0.72

    表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響(,n=3,HE染色)

    表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響(,n=3,HE染色)

    注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別 劑量 細(xì)胞總個數(shù)/個 壞死細(xì)胞個數(shù)/個 細(xì)胞壞死率/%假手術(shù)組 - 52.67±5.03** 3.67±3.05** 7.23±0.06**模型組 - 41.33±4.04 31.33±8.32 75.01±0.13二至丸高劑量組 2g·kg-1 49.67±4.51* 7.33±2.53** 14.74±0.02**二至丸低劑量組 1g·kg-1 47.33±3.05* 8.33±3.78** 17.78±0.09**陽性對照組 0.5mg·kg-1 48.33±3.52* 7.00±2.01** 14.44±0.04**

    表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響(,n=3,尼氏染色)

    表3 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞的影響(,n=3,尼氏染色)

    注:與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01。

    組別 劑量 尼式體個數(shù)/個假手術(shù)組 - 47.33±7.05**模型組 - 8.67±1.53二至丸高劑量組 2g·kg-1 40.67±5.51**二至丸低劑量組 1g·kg-1 39.67±5.03**陽性對照組 0.5mg·kg-1 36.67±8.08**

    2.3 二至丸對去卵巢AD 小鼠海馬CA1 區(qū)Aβ 表達(dá)的影響 結(jié)果見圖3 和表5。假手術(shù)組海馬CA1區(qū)見少量Aβ 陽性細(xì)胞,胞漿和突起著色較淺;與假手術(shù)組比較,模型組Aβ 陽性細(xì)胞數(shù)量顯著增多,胞漿和突起著色較深,部分聚集在一起;與模型組比較二至丸高、低劑量組、陽性藥物組陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少,胞漿和突起著色較淺。但在海馬區(qū)各組均未發(fā)現(xiàn)老年斑。

    圖3 海馬CA1區(qū)Aβ表達(dá)(免疫組化,×200)

    表5 二至丸對去卵巢AD小鼠CA1區(qū)細(xì)胞Aβ陽性細(xì)胞表達(dá)的影響(n=3)

    3 討論

    流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,圍經(jīng)期女性存在較高的癡呆患病率,而且伴隨著絕經(jīng)后雌激素的減少癡呆的發(fā)生率越高[1]。雌激素對于AD 有積極的影響,雌激素能夠促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞軸突、樹突的生長、突觸的形成,雌激素可促進(jìn)長時程增強(qiáng)而促進(jìn)學(xué)習(xí)記憶, 雌激素具有抗興奮性氨基酸毒性、增加大腦皮質(zhì)血流量和提高大腦葡萄糖的利用率, 雌激素可減少神經(jīng)細(xì)胞的凋亡并且可以防止毒性Aβ 片段的產(chǎn)生等[6-7]。去卵巢所致動物模型和雌激素信號通路常用于老年癡呆的發(fā)病機(jī)制及抗老年性癡呆藥物的藥效與機(jī)制研究[8]。

    本次試驗結(jié)果表明,與假手術(shù)組小鼠比較,模型組小鼠在八臂迷宮實驗中其進(jìn)入有效臂所用時間、總錯誤次數(shù)顯著上升,首錯前正確數(shù)明顯降低性延長,且在Y 迷宮實驗中正確交替率明顯減少;形態(tài)學(xué)顯示細(xì)胞總數(shù)顯著減少,壞死細(xì)胞數(shù)顯著增加,細(xì)胞壞死率顯著升高,且尼氏小體隨神經(jīng)元的丟失而減少;CA1 區(qū)Aβ 蛋白表達(dá)增加,表明去卵巢所致學(xué)習(xí)記憶障礙小鼠造模成功.與模型組相比,二至丸高、低劑量組小鼠進(jìn)入有效臂所需的總時間明顯下降,且小鼠正確交替率明顯提高(P<0.05)。在形態(tài)學(xué)觀察中,經(jīng)二至丸給藥干預(yù)后的小鼠,在海馬CA1 區(qū)神經(jīng)元形態(tài)比較完整,排列比較整齊,核仁較少發(fā)生固縮現(xiàn)象,神經(jīng)元細(xì)胞較為完整且尼式體數(shù)量較多。Aβ 免疫組化實驗結(jié)果顯示二至丸高、低劑量組Aβ 陽性細(xì)胞數(shù)顯著減少,胞漿和突起著色較淺。以上結(jié)果提示二至丸能夠改善去卵巢AD 小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力,可能與其神經(jīng)元保護(hù)作用和減少Aβ 沉積有關(guān)。其作用機(jī)制還待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

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