民族藥九頭獅子草治療細菌性陰道炎有效部位的篩選研究

范菊娣 錢志瑤 龍義國 覃容貴

1 貴州醫(yī)科大學藥學院(貴陽 550025)2 貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院(貴陽 550025)3 貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院病理科(貴陽 55004)

民族藥九頭獅子草為爵床科植物九頭獅子草[Peristrophejaponica(Thunb.) Bremek.]全草，主產(chǎn)于貴州，已收載于2003年版《貴州省中藥、民族藥質量標準》，且民間廣為栽培、應用，其味辛、性涼，主治祛風、清熱、化痰、解毒等，用于治療風熱咳嗽、小兒驚風、喉痛、疔毒、乳癰，而當與其它藥物配伍使用，則可治療肺熱咳嗽、虛熱咳嗽、小兒吐奶并泄青、男子尿結、咽喉腫痛、痔瘡、蛇咬傷、黑皰疔、婦女白帶、經(jīng)漏等[1- 3]。九頭獅子草長期以來在貴州省苗族、布依族民間用來治療小兒高熱、小兒驚風等，尤以治療臨床原因不明、抗生素類藥物無顯效的高熱效果較好，本課題組發(fā)現(xiàn)石油醚部位及水部位為九頭獅子草解熱有效部位[4]。同時，九頭獅子草藥用方法在福建、浙江、川藏等地民間的草藥書上也均有收載。

貴州省黔東南苗族侗族自治地區(qū)，九頭獅子草常被世居苗族婦女用于治療婦科泌尿系統(tǒng)的感染，是苗家人房前屋后皆有種植的家庭常備草藥，故有“婦人生病，開門采之”之說。貴州省以九頭獅子草為主藥生產(chǎn)的用于治療婦科陰道感染不適癥狀以及日常保潔的苗草護陰液也已上市，但其藥用有效部位尚未明確。九頭獅子草用于治療婦科炎癥，療效良好，為推廣其臨床應用，前期研究已明確了九頭獅子草抗菌、止癢和抗炎的作用[5]，在此基礎上，本文對其治療細菌性陰道炎的有效部位進行篩選研究。

1 材料與方法

1.1 動物

昆明種小鼠，清潔級，雌性，體質量20～25 g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，合格證號：SYXK(黔)2002- 0001。本實驗涉及動物試驗程序和內(nèi)容已通過本校醫(yī)學倫理委員會審核并批準。

1.2 藥品與試劑

九頭獅子草干燥藥材，購自貴陽市萬東藥材市場，經(jīng)貴州醫(yī)科大學藥學院中藥學教研室覃容貴教授鑒定為正品，藥材標本保留于貴州醫(yī)科大學中藥、民族藥標本館。苯甲酸雌二醇注射液(上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號120703)；婦科千金片(株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號20120413)。金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、大腸桿菌(ATCC25922)，由貴州醫(yī)科大學微生物學教研室提供。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，上海康瑞生物科技有限公司，批號120221；營養(yǎng)瓊脂，上海盛思生化科技有限公司，批號121118；沙氏瓊脂培養(yǎng)基，上?？婆d商貿(mào)有限公司，批號：120921；液體沙氏培養(yǎng)基，北京朋利馳科技有限公司，批號：121124。

1.3 儀器與設備

旋轉蒸發(fā)儀，W3-100SP；數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，303A-型；電熱恒溫箱，WSZ-134- 75；不銹鋼手提式壓力蒸汽滅菌器，YXQ-SG46- 280SA；超凈工作臺，SW-CJ-1F；光學顯微鏡，CX31- 32C02。

1.4 水提液與不同極性部位的制備

九頭獅子草臨床用藥采用水煮湯藥，因此制備水提液作為比較，分析各不同極性部位治療小鼠陰道炎的作用。取干燥九頭獅子草適量，剪碎，以20倍量蒸餾水回流提取2次，各2 h，靜置過濾，合并濾液，水浴濃縮至稠膏。取干燥九頭獅子草適量剪碎，以20倍量70%乙醇回流提取2次，各2 h，靜置過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至無醇味[6]。依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，萃取液減壓濃縮得稠浸膏，回收有機溶劑，記為石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏和正丁醇部位浸膏，剩余溶液濃縮得乙醇浸膏。

1.5 劑量設定與樣品制備

水提液以人的臨床用量換算成的小鼠用量為基礎，人的臨床劑量為100 g/d，根據(jù)人與小鼠的每公斤體質量折算系數(shù)計算得到小鼠劑量。不同極性部位的劑量以人的臨床用量換算成的小鼠用量為基礎，結合各個部位得膏率，根據(jù)人與小鼠的每公斤體質量折算系數(shù)計算得到理論的小鼠用量，再參考預試驗結果進行調(diào)整。為了保證達到篩選藥效的目的，設定劑量在臨床用量的基礎上有所提高。樣品制備則分別取適量各不同極性部位浸膏，置于研缽中，少量乙醇潤濕，加0.5%羧甲基纖維素鈉，研磨均勻得混懸液，并配制成所需劑量，即得為石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和70%乙醇提取部位試驗樣品；水提液以蒸餾水配制成所需劑量樣品。以婦科千金片作陽性治療藥，同法用0.5%羧甲基纖維素鈉配成均勻混懸液[7]。

1.6 體外抑菌實驗

分別將金黃色葡萄球菌菌懸液、大腸埃希菌菌懸液于培養(yǎng)基平板上均勻涂抹，蓋好平皿置室溫干燥5 min備用。分別將直徑為5.0 mm的無菌紙片浸入已制備好的九頭獅子草石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和70%乙醇提取部位試驗樣品以及水提液樣品中作為藥敏紙片，同時設定空白對照。將含有不同提取液的藥敏紙片以及空白對照紙片均勻貼在已接種好的平板上，蓋好平皿，置37 ℃培養(yǎng)18～24 h觀察結果，測量抑菌圈。

1.7 九頭獅子草各部位對細菌性陰道炎模型小鼠的影響[8]

1.7.1 細菌性陰道炎模型制作 取健康雌性小鼠165只，于頸背部皮下注射0.05 mL苯甲酸雌二醇注射液，濃度為2 mg/mL，隔天1次，連續(xù)3次，于第6天將濃度為1×108cfu/mL的金黃色葡萄球菌懸液20 μL注入手術吸收性止血海綿中，再將其塞于小鼠陰道內(nèi)，作為造模組；另取25只小鼠，同法給予苯甲酸雌二醇注射液，于第6天將已注入20 μL生理鹽水的手術吸收性止血海綿塞于小鼠陰道內(nèi)，作為空白對照備選組[9]。大腸埃希菌陰道炎小鼠模型同法制作。于接種后的第4天取陰道分泌物涂片鏡檢，根據(jù)菌體特征觀察以確定是否感染成功，金黃色葡萄球菌排列成葡萄串狀，菌體光滑、隆起，無芽胞、莢膜；大腸埃希菌則為無芽孢的直桿菌。

1.7.2 陰道分泌物鏡檢[10]分別從造模組中隨機挑選出140只感染成功的小鼠，每組20只，分成7組，標記為模型陽性對照組、石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、正丁醇部位組、70%乙醇部位組、水提組和婦科千金片治療對照組，從空白對照備選組中隨機挑選陰道分泌物鏡檢為陰性的小鼠20只作為空白對照組。各組小鼠分別按劑量等容積不等濃度灌胃給藥2 mL/100 g，模型陽性對照組及空白對照組灌胃給予同體積蒸餾水，連續(xù)10 d，每天1次，于停藥后第1、4天無菌棉簽取陰道分泌物涂片，革蘭氏染色鏡檢，2次鏡檢結果均為金黃色葡萄球菌，大腸埃希菌陰性者為轉陰，計算轉陰率。

1.7.3 陰道組織病理學分析[11]頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠陰道組織，10%中性甲醛溶液進行固定，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色后進行病理組織學檢查，對小鼠陰道黏膜的病理組織改變進行劃分等級，等級劃分分為0-III級：0級為黏膜上皮光滑，組織無壞死脫落，黏膜下無出血、充血、水腫、炎細胞浸潤現(xiàn)象，且陰道內(nèi)無炎性滲出物；I級為黏膜上皮無壞死脫落；黏膜下有水腫、充血現(xiàn)象，陰道內(nèi)無炎性滲出物；II級為黏膜上皮組織有灶性壞死脫落，黏膜下出現(xiàn)點狀出血、水腫、充血，有少量炎細胞浸潤，陰道內(nèi)有少量炎性滲出物；III級為黏膜上皮出現(xiàn)壞死脫落，黏膜下表現(xiàn)為片狀出血、水腫、充血、炎細胞浸潤，且陰道內(nèi)有大量炎性滲出物。

1.7.4 小鼠陰道黏膜組織病理學檢查 頸椎脫臼處死小鼠，取陰道組織，用10%的福爾馬林溶液固定，進行石蠟包埋、切片，進行HE染色，顯微鏡下觀察并拍照。

1.8 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行數(shù)據(jù)處理[12]，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體外抑菌的測定

分別對九頭獅子草各提取部位樣品的平板培養(yǎng)抑菌實驗進行抑菌圈的測量，結果顯示，在九頭獅子草提取液對金黃色葡萄球菌的抑制實驗中，結果顯示，以水提液和石油醚部位的抑菌圈較大，平均值分別為13.50 mm、13.00 mm，抑菌圈的大小依次為：水提液(13.50 mm)>石油醚部位(13.00 mm)>70%乙醇部位組(10.00 mm)>正丁醇部位組(9.00 mm)≥乙酸乙酯部位組(7.50 mm)。在九頭獅子草提取液對大腸埃希菌的抑制實驗中，結果顯示，同樣以水提液和石油醚部位的抑菌圈較大，平均值分別為15.50 mm、14.25 mm，抑菌圈的大小依次為：水提液(15.50 mm)>石油醚部位(14.25 mm)>70%乙醇部位組(12.00 mm)>正丁醇部位組(9.75 mm)≥乙酸乙酯部位組(9.25 mm)。

2.2 九頭獅子草各部位對細菌性陰道炎模型小鼠的影響

小鼠陰道內(nèi)金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌的數(shù)量明顯增加，是導致細菌性陰道炎發(fā)病的原因之一[13]。通過對小鼠進行細菌性陰道炎模型的制作，菌種包括金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌，接種培養(yǎng)后，觀察小鼠陰道內(nèi)分泌物，觀察發(fā)現(xiàn)，小鼠陰道內(nèi)分泌物增加，金黃色葡萄球菌與大腸埃希菌的菌落生長密集。將九頭獅子草各部位提取液作用于各造模成功的小鼠陰道內(nèi)，第1、4天用無菌棉簽取小鼠陰道分泌物涂片，革蘭氏染色鏡檢，觀察用藥后小鼠陰道炎的治愈情況并計算轉陰率。通過鏡檢各實驗組金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的生長情況，計算轉陰率，結果見表1，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。統(tǒng)計分析可知，細菌性陰道炎小鼠各給藥組的細菌轉陰率與模型陽性對照組相比，差異較大，即九頭獅子草水提液、70%乙醇以及石油醚、乙酸乙酯、正丁醇部位提取液對小鼠細菌性陰道炎有一定的治療作用，其中水提組、70%乙醇部位組以及石油醚部位組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，水提組治療作用最好，其次依次為石油醚組部位、70%乙醇組部位。同時，九頭獅子草各部位提取物對大腸埃希菌所引起的陰道炎的治愈效果略高于對金黃色葡萄球菌所引起的陰道炎。

與模型陽性對照組比較，各給藥組的陰道組織病理情況均有所改善。水提組20例黏膜上皮光滑，無壞死脫落，黏膜下無充血、水腫、出血、炎細胞浸潤，陰道內(nèi)無炎性滲出物；8例黏膜下充血，8例黏膜下水腫；4例有少量炎細胞浸潤。石油醚部位組16例黏膜上皮光滑，無壞死脫落，黏膜下無充血、水腫、出血、炎細胞浸潤，陰道內(nèi)無炎性滲出物；8例黏膜下充血，12例黏膜下水腫；4例有少量點狀出血。70%乙醇部位組12例黏膜上皮光滑，無壞死脫落，黏膜下無充血、水腫、出血、炎細胞浸潤，陰道內(nèi)無炎性滲出物；8例黏膜下充血，8例黏膜下水腫；8例有少量炎細胞浸潤，4例有點狀出血。乙酸乙酯部位組和正丁醇部位組病變情況有所改善，但效果不如以上各組顯著(見表2)。

表1 九頭獅子草各部位提取物對細菌性陰道炎模型小鼠的影響

表2 九頭獅子草各部位提取物對細菌性陰道炎模型小鼠陰道病理組織影響

2.3 對小鼠陰道黏膜炎癥的病理學形態(tài)影響

鏡下正常小鼠陰道壁組織結構清楚，黏膜被覆鱗狀上皮完整，未見糜爛及中性粒細胞浸潤，黏膜下層血管輕度擴張充血，伴個別炎細胞浸潤；模型對照組陰道壁組織結構清楚，黏膜被覆鱗狀上皮重度糜爛，伴較多中性粒細胞浸潤，黏膜下層血管中度擴張充血，伴較多炎細胞浸潤。其他有效部位組陰道病變有所減輕，與婦科千金片治療組比較，石油醚組和70%乙醇部位組效果相當。見圖1。

3 討 論

陰道炎是陰道黏膜及黏膜下結締組織的炎癥，常見的有細菌性陰道病、滴蟲性陰道炎、霉菌性陰道炎、老年性陰道炎等?，F(xiàn)代藥理實驗證明，很多中藥單味試劑都具有較強的殺滅和抑制滴蟲、真菌，以及消炎和調(diào)整陰道內(nèi)環(huán)境的作用[14]，同時還能避免大量抗生素的使用所引起的正常菌群失調(diào)。

在貴州省民間，九頭獅子草用于治療婦科炎癥，療效良好，本研究結果也表明，九頭獅子草水提液、石油醚部位及70%乙醇部位提取液對細菌性陰道炎均有較好的治療作用，但石油醚部位及70%乙醇部位提取液作用弱于水提液，正丁醇部位及乙酸乙酯部位作用不明顯，因此判斷九頭獅子草治療陰道炎的有效部位主要為石油醚部位及70%乙醇提取部位，石油醚部位作用強于70%乙醇提取部位。

前期研究結果表明，九頭獅子草對金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌有不同程度的抑制作用[15]，可降低右旋糖酐所致小鼠的瘙癢次數(shù)及瘙癢持續(xù)總時間，并提高磷酸組胺所致豚鼠的致癢閾，具有顯著的止癢作用[16]；也能降低二甲苯所致的小鼠耳廓腫脹度，提高腫脹抑制率，降低新鮮雞蛋清所致的小鼠足跖腫脹度，提高腫脹抑制率，還能顯著降低炎性足PGE2含量，提高PGE2抑制率，具有顯著的抗炎作用[17]，說明九頭獅子草既有抑菌、抗炎、止癢的作用，同時能提高陰道炎動物動物模型病原菌轉陰率和陰道黏膜炎癥的治愈程度，這對各種原因引起的陰道炎來說可以達到標本兼治療的效果，值得在臨床進行推廣應用。

圖1 九頭獅子草各組分對小鼠陰道炎其組織病理學的影響 (HE，×200)A.模型對照組；B.空白對照組；C.婦科千金片治療對照組；D.正丁醇組；E.乙酸乙酯組；F.石油醚組；G.水提組；H.70%醇提組