血必凈注射液對(duì)重癥急性胰腺炎大鼠腹內(nèi)壓的影響

羅鍵雄，何梓健，唐翔，陳偉明，陳泳華，黃耀星，蘇偉*

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬市一人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，廣東 廣州 510180；2.廣州市第一人民醫(yī)院南沙醫(yī)院消化內(nèi)科，廣東 廣州 511457)

重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)是臨床常見危重病，并發(fā)癥多，病死率高。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，胰酶原位激活并自身消化導(dǎo)致系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，從而繼發(fā)一系列器官功能損害，引起多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[1]。腹腔內(nèi)高壓(intra-abdominal hypertension，IAH)是SAP的常見并發(fā)癥之一，腹腔內(nèi)壓力(intra-abdominal pressure, IAP)持續(xù)升高可造成多器官功能損害，可導(dǎo)致腹腔間隔室綜合征(abdominal compartment syndrome, ACS)的發(fā)生，引起一系列臨床綜合征[2]。本研究以SAP大鼠動(dòng)物模型為研究對(duì)象，觀察SAP大鼠發(fā)病過程中IAP、腹水量、胰腺和小腸的病理改變，及血漿淀粉酶(AMS)、內(nèi)毒素(ET)、炎性細(xì)胞因子和二胺氧化酶(DAO)水平的變化，探討血必凈注射液早期干預(yù)對(duì)SAP大鼠對(duì)器官功能的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

SPF級(jí)成年SD大鼠15只，購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體質(zhì)量226～270 g，隨機(jī)分為對(duì)照組、SAP組和治療組，每組各5只。所有大鼠在造模前禁食12 h，可自由飲水。稱重后麻醉，使用2%戊巴比妥鈉(西安天茂化工有限公司)進(jìn)行腹腔注射麻醉(5 ml/kg)。成功麻醉后學(xué)以仰臥并固定四肢于操作臺(tái)，腹部去毛消毒，以上腹部正中切口2～3 cm進(jìn)腹，尋找十二指腸并提起膽胰管，無損傷血漿夾閉膽胰管末端，4號(hào)鈍性針頭穿透膽胰管乳頭對(duì)側(cè)的十二指腸壁，進(jìn)入膽胰管約5 mm，以無損傷血漿夾固定針頭。SAP組和治療組大鼠以0.2 ml/min的注射速度向膽胰管內(nèi)逆行注射4.5%?；悄懰徕c溶液(大連美侖公司，1 ml/kg)，保留3 min后松開無損傷血漿夾并抽出針頭，逐層縫合關(guān)腹。對(duì)照組大鼠以上述兩組相同的速度由膽胰管逆行注射相同劑量的0.9%氯化鈉溶液(廣東大冢制藥有限公司)。治療組大鼠造模后立即予腹腔注射血必凈注射液(天津紅日藥業(yè)股份有限公司，5 ml/kg)。最后，為各組大鼠皮下注射0.9%氯化鈉溶液(20 ml/kg)。造模成功24 h后檢測(cè)腹內(nèi)壓及腹水量，經(jīng)腹腔卻脈采血留取血液標(biāo)本，處死大鼠并留取小腸及胰腺組織備檢。血液標(biāo)本3 000 rpm(離心半徑10 cm)離心10 min，留取上清，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)錂z。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.2.1IAP的檢測(cè) 采用BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。大鼠麻醉后采用仰臥位，左下腹穿刺，穿刺針頭連接壓力換能器，以腋中線水平為零點(diǎn)，大鼠呼氣末、腹部肌肉無收縮時(shí)換能器所感受的壓力為腹內(nèi)壓。

1.2.2腹水量的檢測(cè) 沿著腹正中線剪開大鼠腹壁，觀察腹水顏色，稱取適量干棉球置入腹腔，用棉球吸凈腹水，取出后稱量棉球重量。腹水量=濕棉球重量-干棉球重量。

1.2.3血漿AMS、ET、炎性細(xì)胞因子及DAO水平的檢測(cè) 采用全自動(dòng)生物化學(xué)分析儀(奧林巴斯 AU5400，日本) 檢測(cè)AMS；采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)ET、TNF-α、IL-1β、IL-6和DAO的水平，試劑盒購(gòu)自Elabscience公司。

1.2.4胰腺組織及小腸組織病理學(xué)檢查 取大鼠胰腺及小腸組織行4%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水石蠟包埋，切片后行蘇木精-伊紅(HE)染色，然后以盲選法選擇玻片并請(qǐng)兩位病理學(xué)專業(yè)醫(yī)師在光鏡下閱片，胰腺組織病理改變根據(jù) Schmidt等[3]標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，小腸黏膜病理改變根據(jù)Chiu’s標(biāo)準(zhǔn)[4]評(píng)分。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠一般情況、胰腺組織病理評(píng)分及血漿AMS水平比較結(jié)果

對(duì)照組、SAP組、治療組體質(zhì)量分別為(253.60±14.67) g、(245.60±13.44) g、(246.40±8.35)g，3組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模24 h后各組大鼠均無死亡。對(duì)照組大鼠一般情況良好，活動(dòng)敏捷，胰腺組織可見輕微間質(zhì)水腫及局部輕度的炎癥浸潤(rùn)(圖1-A)；SAP組大鼠精神不振，腹脹和呼吸急促較明顯，胰腺組織可見明顯間質(zhì)水腫，伴嚴(yán)重出血及血漿炎癥浸潤(rùn)，大量腺泡細(xì)胞壞死(圖1-B)；治療組大鼠一般情況尚可，腹脹不明顯，胰腺組織可見間質(zhì)水腫，伴有局灶性炎癥浸潤(rùn)(圖1-C)。

圖1 3組大鼠胰腺組織病理改變(HE染色×100)

與對(duì)照組比較，SAP組和治療組胰腺病理評(píng)分、血漿AMS水平明顯升高(P<0.05)，提示SAP模型造模成功。與SAP組比較，治療組胰腺病理評(píng)分、血漿AMS水平明顯下降(P<0.05)，提示血必凈注射液早期干預(yù)SAP大鼠可有效減輕胰腺組織損傷。見表1。

表1 3組大鼠胰腺組織病理評(píng)分及血漿AMS水平的比較

注：t1值：對(duì)照組vsSAP組；t2值：對(duì)照組vs治療組；t3值：SAP組vs治療組

2.2 3組大鼠IAP及腹水量比較結(jié)果

與對(duì)照組比較，SAP組IAP、腹水量明顯升高(P<0.05)，而治療組則無明顯差異(P>0.05)，提示SAP大鼠早期可出現(xiàn)腹腔積液及IAH。與SAP組比較，治療組IAP及腹水量明顯下降(P<0.05)，提示血必凈注射液早期干預(yù)SAP大鼠可有效降低IAP及減少腹水形成。見表2。

表2 3組大鼠IAP及腹水量的比較

注：t1或U1值：對(duì)照組vsSAP組；t2值：對(duì)照組vs治療組；t3或U3值：SAP組vs治療組

2.3 3組大鼠小腸黏膜病理評(píng)分、血漿ET及DAO水平比較結(jié)果

對(duì)照組小腸黏膜可見絨毛完整，僅有輕度水腫(圖2-A)；SAP組小腸黏膜可見絨毛不完整，絨毛上皮水腫明顯，伴有脫落及潰瘍形成，固有層炎癥性細(xì)胞浸潤(rùn)，毛細(xì)血漿內(nèi)紅細(xì)胞積聚(圖2-B)；治療組小腸黏膜可見絨毛基本完整，局部中度水腫(圖2-C)。

圖2 3組大鼠小腸黏膜病理改變(HE染色 × 100)

與對(duì)照組比較，SAP組小腸病理評(píng)分、血漿ET及DAO水平明顯升高(P<0.05)，而治療組小腸病理評(píng)分及血漿DAO水平也明顯升高(P<0.05)，提示SAP大鼠在發(fā)病早期已出現(xiàn)腸黏膜損傷和腸黏膜屏障功能障礙。與SAP組比較，治療組小腸病理評(píng)分、血漿ET及DAO水平明顯下降(P<0.05)，提示血必凈注射液早期干預(yù)SAP大鼠可減輕腸黏膜損傷，改善腸黏膜屏障功能障礙。見表3。

2.4 3組大鼠血漿炎性細(xì)胞因子水平比較結(jié)果

與對(duì)照組比較，SAP組血漿IL-1β及IL-6水平明顯升高(P<0.05)，而治療組血漿TNF-α及IL-6水平也明顯升高(P<0.05)，提示SAP大鼠在發(fā)病早期已出現(xiàn)血漿炎性細(xì)胞因子水平明顯升高。與SAP組比較，治療組血漿TNF-α、IL-1β及IL-6水平明顯下降(P<0.05)，提示血必凈注射液早期干預(yù)SAP大鼠可有效降低血漿炎性細(xì)胞因子水平。見表4。

表3 3組大鼠小腸黏膜病理評(píng)分、血漿ET及DAO水平的比較

注：t1值：對(duì)照組vsSAP組；t2值：對(duì)照組vs治療組；t3值：SAP組vs治療組

表4 3組大鼠血漿炎性細(xì)胞因子水平的比較

注：t1值：對(duì)照組vs SAP組；t2或U2值：對(duì)照組vs治療組；；t3或U3值值：SAP組vs治療組

3 討論

SAP起病急，進(jìn)展快，死亡率可達(dá)14%～30%[5]，其發(fā)病過程與機(jī)體炎癥反應(yīng)高度相關(guān)。在SAP早期，受損的胰腺腺泡細(xì)胞可分泌IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子，并募集與活化外周血單核細(xì)胞，促進(jìn)其合成及分泌更多的炎性細(xì)胞因子，形成瀑布式反應(yīng)，導(dǎo)致SIRS的發(fā)生，造成多臟器功能受損，而腸道則是常見的受累器官之一。包括SIRS在內(nèi)的各種因素誘發(fā)腸黏膜屏障功能障礙，引起腸道細(xì)菌異位及內(nèi)毒素入血，造成內(nèi)源性膿毒癥，進(jìn)一步加重器官功能損害，最終發(fā)展為MODS[1,6]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，SAP組大鼠精神萎靡，氣促及腹脹明顯，胰腺組織病理檢查出現(xiàn)明顯的充血水腫、出血與壞死，胰腺組織病理評(píng)分、血漿AMS、IL-1β及IL-6水平明顯升高，提示造模24 h后，大鼠胰腺組織已經(jīng)出現(xiàn)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，受損的胰腺細(xì)胞刺激與活化免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞，最終導(dǎo)致血漿IL-1β及IL-6等炎性細(xì)胞因子水平明顯升高。

IAH與ACS是SAP常見并發(fā)癥之一，SAP患者IAH發(fā)病率可高達(dá)78%[7]，其發(fā)病機(jī)制與SAP發(fā)病過程中伴隨的SIRS密切相關(guān)[8]。在SAP發(fā)病過程中，胰腺組織腫脹或壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，以及胰周和后腹膜大量的炎性滲出造成胰包膜內(nèi)和后腹膜高壓。受損的腺泡細(xì)胞釋放大量損傷相關(guān)分子物質(zhì)和釋放消化酶，刺激免疫細(xì)胞及組織細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性細(xì)胞因子并作用于血漿內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血漿通透性增加，引起腹腔臟器及胃腸道充血水腫，使得胃腸蠕動(dòng)功能明顯下降，造成腸道內(nèi)積氣積液及腹腔內(nèi)大量滲出，誘發(fā)IAH[8-9]。而臨床研究也證實(shí)，SAP患者血IL-6和降鈣素原等炎癥指標(biāo)與IAP在病情發(fā)展時(shí)呈同趨勢(shì)升高，在治療后呈同趨勢(shì)下降，提示IAP與血漿炎性細(xì)胞因子水平存在相關(guān)性[10]。此外，有研究表明[11]，IAP持續(xù)升高可導(dǎo)致SAP患者腹腔灌注壓持續(xù)下降，加重腸道缺血缺氧和微循環(huán)障礙，進(jìn)一步加重腸黏膜屏障功能障礙。本研究結(jié)果還顯示，SAP組IAP、腹水量、小腸病理評(píng)分及血漿IL-1β、IL-6、ET及DAO水平均顯著高于對(duì)照組，提示SAP大鼠可能已經(jīng)同時(shí)存在SIRS、IAH和腸黏膜屏障功能障礙，后二者可能互為因果、相互促進(jìn)，血漿炎性細(xì)胞因子水平升高與IAH和腸黏膜屏障功能障礙密切相關(guān)。

血必凈注射液是主要以丹參、川芎、當(dāng)歸、紅花、赤芍等中藥提取物煉制而成的靜脈制劑，具有清熱解毒、扶正祛邪和活血化瘀等功效[12]。既往研究報(bào)道，早期應(yīng)用血必凈注射液治療可抑制炎性細(xì)胞因子的合成和釋放，降低血漿炎性細(xì)胞因子水平，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，同時(shí)可拮抗內(nèi)毒素并減少內(nèi)毒素在體內(nèi)積聚，降低循環(huán)氧自由基的總量[13]，還能保護(hù)血漿內(nèi)皮細(xì)胞，穩(wěn)定微循環(huán)[14]，維持正常的血漿滲透性，減少炎性滲出[15]。肖芳等[16]研究顯示，血必凈可下調(diào)血漿IL-6、TNF-α等炎性細(xì)胞因子及DAO水平，作者認(rèn)為血必凈可通過抑制炎性細(xì)胞因子釋放，保護(hù)腸黏膜屏障功能并促進(jìn)腹水吸收。在本研究中，治療組大鼠IAP、腹水量、胰腺和小腸病理評(píng)分以及血漿AMS、TNF-α、IL-1β、IL-6、ET和DAO水平均較SAP組顯著下降，提示血必凈注射液早期干預(yù)SAP大鼠可有效延緩IAH和IMBD的發(fā)生，究其原因，可能是血必凈注射液通過弱化機(jī)體炎癥反應(yīng)，減少了炎性細(xì)胞因子的生成及釋放，減輕了血漿內(nèi)皮損傷及其造成的毛細(xì)血漿滲漏綜合征，降低了炎癥反應(yīng)造成的腸黏膜組織損傷，從而達(dá)到保護(hù)腸黏膜屏障功能的效果。由此推測(cè)，血必凈注射液不僅能降低IAP和減少腹腔積液，還能改善腸黏膜屏障功能障礙，可能在SAP發(fā)病早期具有保護(hù)重要臟器功能及防治并發(fā)癥的治療效果。

綜上所述，SIRS在SAP大鼠IAH的發(fā)病過程中起著重要作用，并與腸黏膜屏障功能障礙密切相關(guān)。SAP發(fā)病早期應(yīng)用血必凈注射液不但能有效降低SAP大鼠的IAP和血漿炎性細(xì)胞因子水平，還能減少腹腔積液及延緩腸黏膜屏障功能障礙。但值得注意的是，雖然炎癥反應(yīng)在SAP并IAH的發(fā)病過程中起著重要作用，但血必凈注射液有效干預(yù)SAP并IAH的治療靶點(diǎn)尚未完全明確，尚有待進(jìn)一步研究。