漆酶/天然介體系統(tǒng)對(duì)堿木質(zhì)素粒徑和官能團(tuán)變化的影響?

唐雨楠 馬爾妮

（北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

木質(zhì)素是自然界中唯一可提供芳環(huán)、含量?jī)H次于纖維素的天然高聚物，全球每年生物合成新增量約為6×1014t[1]，具有來(lái)源廣泛、儲(chǔ)量豐富、資源可再生的特點(diǎn)。它包含芳香基、羥基、羰基、甲氧基、羧基、共軛雙鍵等活性官能團(tuán)，因而可以進(jìn)行羥甲基化、烷基化和去烷基化、酚化、酰化、酯化、氫解等多種反應(yīng)[2]，進(jìn)而有望實(shí)現(xiàn)在材料、化學(xué)、環(huán)境、能源等諸多領(lǐng)域的利用。近年來(lái)，在木材研究領(lǐng)域，人們應(yīng)用木質(zhì)素作為膠黏劑[3]，一些學(xué)者嘗試將木質(zhì)素作為木質(zhì)材料的改性劑。Gordobil等[4]以酯化木質(zhì)素浸注木材單板，提升其疏水性和疏油性。Zhou等[5]以工業(yè)堿木質(zhì)素浸注速生材，降低其吸水性、吸濕性，減小尺寸變形。然而相對(duì)于木材中的孔隙直徑，木質(zhì)素的粒徑較大，不利于深入木材內(nèi)部。為更好地滲透木材，增強(qiáng)改性效果，需要降解木質(zhì)素以減小粒徑，同時(shí)盡量保留活性官能團(tuán)。

在木質(zhì)素降解中，常見(jiàn)方法包括酸堿催化水解、醇解、氧化降解、還原降解和熱解等[6]。但這些方法所用能耗較大、污染較重，生物降解因其環(huán)境友好性而備受關(guān)注[7]。同時(shí)，生物降解具有底物專一、條件溫和、反應(yīng)效率高、易于控制等優(yōu)點(diǎn)。生物降解主要依靠微生物所分泌的酶。漆酶是三種經(jīng)典木質(zhì)素降解酶之一，以氧氣為最終電子受體，還原產(chǎn)物為水，是一種綠色環(huán)保的生物催化劑[8]。然而，漆酶氧化還原電勢(shì)較低，僅能降解木質(zhì)素中占10%～20%的酚類結(jié)構(gòu)單元[9-10]；另一方面，漆酶單一作用可能導(dǎo)致木質(zhì)素聚合[9,11-12]。

在漆酶/介體系統(tǒng)的研究中發(fā)現(xiàn)，在介體幫助下，漆酶可氧化占木質(zhì)素80%～90%的非酚類結(jié)構(gòu)單元。同時(shí)，介體可抑制木質(zhì)素的聚合作用，從而實(shí)現(xiàn)其全組分的顯著降解[13]。相較于合成介體，天然介體來(lái)源廣、成本低、毒性小、輔助漆酶催化效率高、不易使漆酶失活[14]。Yao等[15]研究表明：漆酶/天然介體系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)堿木質(zhì)素的高效降解和木質(zhì)素表面酚基的顯著富集。

本研究利用漆酶/香草醛天然介體系統(tǒng)處理工業(yè)堿木質(zhì)素，考察木質(zhì)素的粒徑和官能團(tuán)變化，在此基礎(chǔ)上探究漆酶/介體系統(tǒng)處理堿木質(zhì)素的優(yōu)化條件，為進(jìn)一步利用木質(zhì)素改性木材提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

漆酶（EC1.10.3.2，粉體），購(gòu)于南京都萊生物技術(shù)有限公司；ABTS[2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽]，純度98%，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；香草醛（C8H8O3）和1,4-二氧六環(huán)（C4H8O2），分析純，購(gòu)于上海麥克林生化科技有限公司；工業(yè)堿木質(zhì)素，由常州山峰化工有限公司提供；檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙酸和乙酸鈉，分析純，購(gòu)自北京化工廠。

1.2 設(shè)備

電子分析天平，AUX220，日本SHIMADZU公司；電熱恒溫水浴鍋，單列二孔DZKW-D-2，北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì),U-3900,日本Hitachi公司；多點(diǎn)磁力攪拌器，RO15，德國(guó)IKA公司；循環(huán)水真空泵，SHZ-III，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，101-2AB，天津市泰斯特儀器有限公司；激光粒度分析儀，Mastersizer 2000，英國(guó)Malvern Panalytical公司；傅里葉變換紅外光譜儀,Nicolet 6700,美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 漆酶活性測(cè)定

本研究以常用的ABTS法測(cè)定漆酶活性[16-17]，參考國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)（Enzyme Committee，EC）和其他相關(guān)研究的定義[17-18]，將最適條件（pH和溫度）下1 min內(nèi)轉(zhuǎn)化1μmol ABTS的酶量稱為漆酶的1 個(gè)酶活力單位U，即μmol/min；將每克漆酶所具有的酶活力定義為比酶活U/g。因此，測(cè)定所用漆酶的活性前，確定其最適條件，具體方法[18]如下：

分別配制1 mmol/L的ABTS溶液、0.000 2g/mL漆酶溶液和檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液。以1∶1∶3的體積比混合以上三者，作為標(biāo)準(zhǔn)樣品。以等體積蒸餾水替代漆酶溶液，作為對(duì)照樣品。置于水浴中反應(yīng)，冰浴結(jié)束反應(yīng)，使用分光光度計(jì)測(cè)定樣品在λ=420 nm處的吸光度。

首先，以緩沖液pH為自變量，在40 ℃下反應(yīng)5 min，選擇最適pH。然后，以反應(yīng)溫度為自變量，在pH=4 下反應(yīng)5 min，選擇最適溫度。最后，以ABTS溶液濃度為自變量，在最適pH和溫度下反應(yīng)30 min[18]，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合定義可得所用漆酶的比酶活。計(jì)算公式[18]如下：

其中，反應(yīng)液中ABTS自由基濃度c根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性擬合方程計(jì)算得出。

求得的比酶活數(shù)據(jù)用于木質(zhì)素處理中的酶量控制，同時(shí)便于比較研究。

1.3.2 堿木質(zhì)素處理

稱取一定質(zhì)量的漆酶于燒杯，按水:漆酶=100 mL:1g的比例加入去離子水[18]，磁力攪拌2 h。稱取一定質(zhì)量的干燥堿木質(zhì)素置于燒杯中。根據(jù)木質(zhì)素用量，按0.4%（w/w）、25 mL/g、1 mL/g的比例依次加入香草醛、乙酸-乙酸鈉緩沖溶液、二氧六環(huán)。按對(duì)應(yīng)酶量[（U/g），即漆酶溶液濃度（U/mL）/反應(yīng)體系中木質(zhì)素濃度（g/mL）]加入漆酶溶液，開(kāi)啟反應(yīng)。液面下方通空氣以提供漆酶所需氧氣，同時(shí)實(shí)現(xiàn)氣流攪拌，反應(yīng)一定時(shí)間。冰浴終止反應(yīng)，反應(yīng)液真空抽濾，濾渣置于60 ℃烘箱充分干燥，即得到LMS處理后的堿木質(zhì)素。

采用單一變量法研究時(shí)間、pH、溫度、酶量4 個(gè)因素對(duì)木質(zhì)素粒徑的影響，各因素的對(duì)應(yīng)水平見(jiàn)表1。其中LMS處理后的木質(zhì)素稱為處理組，其他操作一致、僅未添加漆酶得到的木質(zhì)素稱為對(duì)照組，未經(jīng)處理的木質(zhì)素為未處理組。

表1 各組木質(zhì)素的反應(yīng)條件 Tab.1 The reaction parameters of lignin in different groups

1.3.3 粒徑分析

使用激光粒度儀檢測(cè)LMS處理前后木質(zhì)素的粒徑。首先通過(guò)超聲使木質(zhì)素在水中充分分散，得到待測(cè)樣品；然后選擇分散劑和樣品的折光率分別為1.330 和1.530，控制樣品遮光率為10%～20%。之后檢測(cè)樣品在0.02～2 000 μm范圍內(nèi)的粒徑分布，同一樣品結(jié)果恒定后導(dǎo)出。

1.3.4 紅外光譜分析

使用紅外光譜儀檢測(cè)處理前后木質(zhì)素的官能團(tuán)。將適量樣品置于樣品臺(tái)的金剛石ATR附件上，選擇分辨率為4 cm-1，每個(gè)樣品在4 000～400 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描32 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 漆酶活性

試驗(yàn)控制單一變量，分別得到樣品吸光度隨pH、溫度變化的曲線如圖1 所示。吸光度值越大，說(shuō)明被轉(zhuǎn)化的ABTS量越多，即該因素水平下漆酶的活性越高。因此，分別選定漆酶的最適pH為4，最適溫度為40 ℃。

圖1 ABTS自由基的吸光度曲線Fig.1 The absorbance curves of ABTS radicals

在上述最適條件下實(shí)驗(yàn)，繪制得到樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2 所示。其中線性擬合方程為：

式中：A——ABTS自由基吸光度；

c——ABTS自由基濃度，mmol/L。

R2=0.980 18，說(shuō)明擬合程度良好。將最適條件下所得樣品的吸光度A=1.40 代入式（2）得到反應(yīng)液中ABTS自由基濃度，再將相關(guān)數(shù)據(jù)代入式（1），最終求得所用漆酶的比酶活為2 096.3 U/g。

圖2 ABTS自由基的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of ABTS radicals

2.2 粒徑分析

對(duì)處理前后堿木質(zhì)素的粒徑大小及分布情況進(jìn)行分析，不同處理?xiàng)l件下堿木質(zhì)素的平均粒徑如圖3 所示。其中，未處理組和對(duì)照組的平均粒徑分別為5.821μm和9.312 μm。

圖3 不同處理?xiàng)l件下堿木質(zhì)素的粒徑Fig.3 The particle sizes of alkali lignin under different treatment parameters

由圖3 可知，LMS處理對(duì)木質(zhì)素粒徑的總體變化。整體而言，處理組樣品的平均粒徑全部小于對(duì)照組，80%小于未處理組；最小達(dá)到4.733 μm，比對(duì)照組木質(zhì)素的平均粒徑減小了49.17%，比未處理組減小了18.69%。該結(jié)果也在一定程度上說(shuō)明LMS對(duì)木質(zhì)素具有降解作用，這與以往研究中的結(jié)論相一致[19]。

比較同一變量?jī)?nèi)各梯度對(duì)應(yīng)木質(zhì)素的粒徑結(jié)果，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間為3 h、pH為3.5、溫度為35℃、酶量為3U/g的木質(zhì)素平均粒徑最小。由此將以上條件作為漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理堿木質(zhì)素的優(yōu)化參數(shù)。

考慮到時(shí)間、pH兩個(gè)變量下粒徑結(jié)果的組間差異較大，說(shuō)明在本研究選定的梯度下，反應(yīng)時(shí)間和pH是堿木質(zhì)素粒徑降低程度的主要影響因素。

上述試驗(yàn)結(jié)果表明：漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理可以減小木質(zhì)素的粒徑。然而，比較未處理組和對(duì)照組木質(zhì)素的平均粒徑，發(fā)現(xiàn)后者的平均粒徑反而增大。由此可見(jiàn)，僅介體處理可能造成木質(zhì)素的聚合，即LMS中漆酶以外的物質(zhì)可能導(dǎo)致木質(zhì)素出現(xiàn)團(tuán)聚。

通過(guò)圖4 中二者的粒徑分布情況，可以觀察到對(duì)照組雖然峰底寬與未處理組基本相等，但是相比于未處理組的峰高更低、偏度更大（負(fù)偏態(tài)）、峰度更小，說(shuō)明LMS中漆酶之外的物質(zhì)或試驗(yàn)方法使木質(zhì)素的粒徑分布的集中程度降低，木質(zhì)素以大顆粒為主。

出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象可能是因?yàn)椋撼闉V取濾渣的操作無(wú)法回收部分可溶于濾液的、降解程度較高的小粒徑木質(zhì)素；常規(guī)干燥過(guò)程中木質(zhì)素易出現(xiàn)氫鍵結(jié)合（類似于纖維角質(zhì)化[20-21]）；反應(yīng)體系中的介質(zhì)可能改變木質(zhì)素的表面性質(zhì)，使其彼此間易發(fā)生靜電吸引。

圖4 對(duì)照組與未處理組木質(zhì)素的粒徑分布比較Fig.4 Particle size distribution of control and untreated lignin

2.3 紅外光譜分析

為進(jìn)一步探討堿木質(zhì)素可能出現(xiàn)的化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，采用紅外光譜對(duì)木質(zhì)素處理前后的官能團(tuán)變化進(jìn)行檢測(cè)。由于漆酶不會(huì)破壞堿木質(zhì)素的苯環(huán)結(jié)構(gòu)[18,22]，因此選擇代表苯環(huán)骨架振動(dòng)的、吸收較為穩(wěn)定的1 508 cm-1處特征峰作為參照[18,23]，將其他波數(shù)下的透過(guò)率除以1 508 cm-1處的透過(guò)率，得到各處相對(duì)于參照峰的透過(guò)率并作圖。處理組最小粒徑木質(zhì)素與對(duì)照組、未處理組木質(zhì)素經(jīng)歸一化處理的紅外光譜結(jié)果如圖5 所示，堿木質(zhì)素紅外特征峰歸屬及三組木質(zhì)素的相對(duì)透過(guò)率見(jiàn)表2。

圖5 處理組最小粒徑木質(zhì)素與對(duì)照組、未處理組木質(zhì)素的紅外譜圖Fig.5 FT-IR spectra of lignin in treated, control and untreated groups

表2 堿木質(zhì)素的紅外特征峰歸屬及處理組最小粒徑木質(zhì)素與對(duì)照組、未處理組木質(zhì)素的相對(duì)透過(guò)率 Tab.2 The FT-IR absorption peak location and assignment of alkali lignin and relative transmittance in treated, control and untreated groups

整體而言，三組木質(zhì)素的紅外吸收譜線十分相似，說(shuō)明處理前后木質(zhì)素的官能團(tuán)種類基本未發(fā)生變化，這與其他研究中的結(jié)果一致[24-25]。但部分峰的吸收強(qiáng)度有一定差異。在波數(shù)3 338 cm-1附近的吸收峰由O—H伸縮振動(dòng)產(chǎn)生，該峰極寬且鈍，吸收較強(qiáng)，說(shuō)明有較多的分子間或分子內(nèi)氫鍵形成。

相比于未處理組，處理組在2 935、2 846 cm-1處的透過(guò)率增加，說(shuō)明—CH3、 —CH2—、—OCH3數(shù)量降低。對(duì)照組相對(duì)于未處理組的變化趨勢(shì)與處理組相對(duì)于未處理組的趨勢(shì)類似，但對(duì)照組在3 338、 2 935、 2 846 cm-1處透過(guò)率的增加更為顯著，即—OH、 —CH3、—CH2—、—OCH3數(shù)量的減少更為劇烈。因此，相較于僅介體處理，LMS處理可以更多地保留—OH、 —OCH3等活性官能團(tuán)。

3 結(jié)論

1）所用漆酶在pH=4、T=40℃的最適條件下與ABTS反應(yīng)，比酶活為2 096.3 U/g。采用漆酶/香草醛介體系統(tǒng)得到的堿木質(zhì)素最小平均粒徑為4.733 μm，與對(duì)照組相比降低49.17%。反應(yīng)中，時(shí)間、pH是主導(dǎo)因素。在本試驗(yàn)條件下確定的優(yōu)化參數(shù)為反應(yīng)時(shí)間3 h、pH3.5、溫度35℃、酶量3U/g。漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理可減小木質(zhì)素粒徑，但是僅介體處理可能使木質(zhì)素發(fā)生團(tuán)聚。

2）漆酶/香草醛介體系統(tǒng)處理后，堿木質(zhì)素的官能團(tuán)種類未發(fā)生明顯改變，但是羥基、甲基、亞甲基、甲氧基等官能團(tuán)的數(shù)量出現(xiàn)變化，LMS處理比僅介體處理更能保留堿木質(zhì)素的活性官能團(tuán)。

木質(zhì)素粒徑減小有助于深入木材內(nèi)部，而保留活性官能團(tuán)有助于與木材實(shí)現(xiàn)良好的結(jié)合，該研究結(jié)論對(duì)于拓寬木質(zhì)素的應(yīng)用范圍，提高木質(zhì)素和速生材資源的利用率有一定的參考意義。