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    清熱涼血解毒方對(duì)大鼠痔術(shù)后創(chuàng)面愈合及炎癥因子表達(dá)的影響?

    2020-06-15 02:08:54王振彪彭俊付
    中國(guó)中醫(yī)急癥 2020年5期
    關(guān)鍵詞:方中涼血肛周

    劉 超 王振彪 王 垚 彭俊付 王 銳

    (1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院,北京100038;2.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京懷柔醫(yī)院,北京 101400;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院,北京 100700)

    痔是肛腸外科常見(jiàn)多發(fā)疾病,主要以手術(shù)治療為主,術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)機(jī)制復(fù)雜,手術(shù)創(chuàng)傷其鄰近組織的牽拉擠壓等導(dǎo)致肛門水腫、疼痛、創(chuàng)面感染等,嚴(yán)重影響患者的預(yù)后和生活質(zhì)量。如何減少痔術(shù)后創(chuàng)面疼痛,加速創(chuàng)面愈合為臨床亟待解決的問(wèn)題[1-3]?,F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)炎癥因子和炎癥細(xì)胞對(duì)炎癥過(guò)程具有決定作用,血清腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)和白介素-8(IL-8)等與脂多糖協(xié)同,刺激、激活更多炎癥介質(zhì)的表達(dá),從而放大和加重炎癥反應(yīng)[4-5]。炎癥因子能對(duì)痔血管壁及血管內(nèi)皮能造成氧化損傷,被氧化損傷的血管壁又不斷產(chǎn)生炎癥因子。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)可增加血管的通透性,減輕受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞引起的功能障礙,加速受損的血管內(nèi)皮細(xì)胞愈合,促進(jìn)新生血管愈合。前列腺素E2(PGE2)是疼痛和炎癥的重要因子,在體內(nèi)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能,參與炎癥反應(yīng)各階段[6-7]。

    中醫(yī)認(rèn)為,痔瘡病因主要為先天不足,臟腑本虛,飲食不節(jié),過(guò)食辛辣之物等導(dǎo)致血管弛緩、經(jīng)脈瘀滯,痔術(shù)后創(chuàng)面多為濕邪所困,氣血運(yùn)行不暢,虛實(shí)夾雜,使得創(chuàng)面愈合更加緩慢,治宜清利濕熱,祛瘀活血止痛,消水腫促生肌[8-9]。清熱涼血解毒方為北京世紀(jì)壇醫(yī)院肛腸科經(jīng)驗(yàn)方,對(duì)痔術(shù)后創(chuàng)面具有較好的治療作用,但其作用機(jī)制尚不明確。因此,本研究通過(guò)干預(yù)大鼠痔術(shù)后創(chuàng)面感染模型,旨在探討清熱涼血解毒方對(duì)大鼠痔術(shù)后創(chuàng)面愈合的作用及對(duì)相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)SD大鼠,雌雄各半,8周齡,體質(zhì)量(200±20)g,購(gòu)于浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào):SCXK(浙)2014-0001。動(dòng)物室溫飼養(yǎng),自然采光,自由飲水,適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

    1.2 試藥與儀器 清熱涼血解毒方,組成:黃連12 g,黃柏20 g,梔子10 g,生大黃15 g,苦參15 g,地榆10 g,白芍 20 g,秦皮 15 g,白頭翁 10 g,延胡索 20 g,茵陳10 g,紫草10 g。上述中藥飲片由北京世紀(jì)壇醫(yī)院中藥房提供,藥材加水煎煮2次,分別濃縮至1 mL含0.5、1、1.5 g原藥材的藥液,作為清熱涼血解毒方低、中、高劑量。冰醋酸、水合氯醛,購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;HE染色試劑盒購(gòu)于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司(批號(hào)分別為:AS1055A、AS1055B),TNF-α、IL-6和IL-8試劑盒購(gòu)于碧云天生物科技有限公司(批號(hào)分別為:J190064、J190127和J190376),PGE2和VEGF單抗購(gòu)于武漢阿斯本生物技術(shù)有限公司(批號(hào)分別為bs-7402R和bs-0167R);二抗(河北博海生物工程開發(fā)有限公司,批號(hào):20190424)。手術(shù)器械,蘇州六六視覺(jué)醫(yī)療設(shè)備公司生產(chǎn);BX60顯微鏡,日本Olympus Optical公司生產(chǎn);切片機(jī),德國(guó)萊卡公司;ELx800酶標(biāo)儀,美國(guó)伯騰儀器有限公司。

    1.3 模型制備 將50只雄性SD大鼠分為空白對(duì)照組、模型組及清熱涼血解毒方低、中、高劑量組,每組10只。除空白對(duì)照組外,其余大鼠采用肛周局部注射冰醋酸法建立痔術(shù)后創(chuàng)面感染模型[10]。碘伏棉球消毒大鼠肛周皮膚,75%冰醋酸扇形注射于大鼠肛門外周皮下,注射后局部按摩肛周,使藥液充分彌散。注射后24 h觀察肛門局部潰瘍、紅腫、炎性滲出等。造模成功標(biāo)準(zhǔn)為肛門局部紅腫隆起≥1mm,超過(guò)潰瘍面,炎癥滲出多,潰瘍面>0.3 cm2。

    1.4 給藥方法 于造模成功后第2天進(jìn)行藥物治療??瞻讓?duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃,清熱涼血解毒方低、中、高劑量組分給予0.5、1、1.5 g/mL的清熱涼血解毒方灌胃,劑量均為10 mL/kg,每日1次,連續(xù)給藥7 d。

    1.5 標(biāo)本采集與檢測(cè) 1)肛周水腫程度和創(chuàng)面面積檢測(cè)。末次給藥后,測(cè)量肛周創(chuàng)面的潰瘍面積大小及水腫的程度,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分。無(wú)水腫為0分,勉強(qiáng)可見(jiàn)為1分,邊緣高于皮膚為2分,明顯腫脹為3分。2)炎癥因子檢測(cè)。10%水合氯醛1 mL/100 g麻醉處死各組大鼠前,眼球取血,離心,取上清,采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定血清TNF-α、IL-6和IL-8水平,嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。3)肛周組織HE染色。于末次給藥24 h后,10%水合氯醛1 mL/100 g水合氯醛麻醉處死各組大鼠,取肛周組織,生理鹽水清洗后,固定48 h后,二甲苯脫脂,酒精脫水,石蠟包埋,切片,乙醇水化,蘇木精染色,1%鹽酸乙醇溶液分化,自來(lái)水沖洗返藍(lán),浸入伊紅染液,梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠進(jìn)行封片,顯微鏡下觀察。4)免疫組化檢測(cè)VEGF和PGE2。取上述病理切片,充分脫蠟,1%甲醇雙氧水處理、抗原修復(fù)液修復(fù)、封閉、添加VEGF和PGE2一抗,二抗;鏈霉卵白素工作液處理,DAB顯色,蘇木素復(fù)染,封片,光學(xué)顯微鏡下選5個(gè)視野觀察。陽(yáng)性表達(dá)為棕黃色,蛋白表達(dá)量積分光密度(IOD)表示。

    1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以()表示,采用t檢驗(yàn)比較組內(nèi)和組間差異;計(jì)數(shù)資料以百分率(%)表示,應(yīng)用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠肛周水腫程度評(píng)分和創(chuàng)面面積比較見(jiàn)表1。與空白對(duì)照組比較,模型組肛周水腫程度評(píng)分和創(chuàng)面面積顯著高于空白對(duì)照組,清熱涼血解毒方各劑量組水腫程度評(píng)分和創(chuàng)面面積顯著低于模型組,且中、高劑量組低于低劑量組(P<0.05),但清熱涼血解毒方中劑量組和高劑量組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

    表1 各組大鼠肛周水腫程度評(píng)分和創(chuàng)面面積比較(±s)

    表1 各組大鼠肛周水腫程度評(píng)分和創(chuàng)面面積比較(±s)

    與空白對(duì)照組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05;與清熱涼血解毒方低劑量組比較,△P<0.05。下同

    組別空白對(duì)照組模型組清熱涼血解毒方低劑量組清熱涼血解毒方中劑量組清熱涼血解毒方高劑量組n 10 10 10 10 10水腫程度評(píng)分(分)0.15±0.03 2.31±0.37*1.86±0.34*#1.02±0.27*#△0.93±0.31*#△創(chuàng)面面積(cm2)0.11±0.02 3.12±0.43*2.11±0.38*#1.32±0.29*#△1.17±0.33*#△

    2.2 各組大鼠肛周組織HE染色比較 見(jiàn)圖1??瞻讓?duì)照組肛周組織正常,細(xì)胞排列有序,細(xì)胞輪廓清晰、結(jié)構(gòu)完整,無(wú)水。與空白對(duì)照組比較,模型組肛周組織間隙疏松水腫,鱗狀上皮大片狀壞死,固有層大量淤血,可見(jiàn)大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜下層局部纖維斷裂,小靜脈擴(kuò)張,有毛細(xì)血管增生。清熱涼血解毒方各劑量組間隙疏松水腫不明顯,少量鱗狀上皮壞死,少量中性粒細(xì)胞,毛細(xì)血管增生不明顯。

    圖1 各組大鼠肛周組織病理學(xué)觀察(HE染色,400倍)

    2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比較見(jiàn)表2。與空白對(duì)照組比較,模型組外周血TNF-α、IL-6和IL-8水平顯著升高,清熱涼血解毒方低、中、高劑量組外周血各指標(biāo)顯著低于模型組,且清熱涼血解毒方中、高劑量組顯著低于清熱涼血解毒方低劑量組(P<0.05)。但清熱涼血解毒方中劑量組和高劑量組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)。

    表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比較(±s)

    表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-8水平比較(±s)

    組別空白對(duì)照組模型組清熱涼血解毒方低劑量組清熱涼血解毒方中劑量組清熱涼血解毒方高劑量組n 10 10 10 10 10 TNF-α(ng/mL)28.17±3.91 211.41±14.62*153.47±12.67*#101.19±10.39*#△95.76±11.1*#△IL-6(pg/mL)13.65±1.86 99.65±10.07*72.34±8.12*#50.37±6.54*#△57.59±7.26*#△IL-8(pg/mL)11.47±2.12 123.51±9.67*80.62±8.35*#58.14±7.75*#△55.63±8.03*#△

    2.4 各組大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比較 見(jiàn)表3,圖2。與空白對(duì)照組比較,模型組VEGF和PGE2水平顯著升高,清熱涼血解毒方各劑量組VEGF和PGE2水平顯著低于模型組,且清熱涼血解毒方中、高劑量組VEGF和PGE2顯著低于清熱涼血解毒方低劑量組(P<0.05)。但清熱涼血解毒方中劑量組和高劑量組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

    表3 各組大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比較(IOD,±s)

    表3 各組大鼠肛周VEGF和PGE2蛋白水平比較(IOD,±s)

    組別空白對(duì)照組模型組清熱涼血解毒方低劑量組清熱涼血解毒方中劑量組清熱涼血解毒方高劑量組n 10 10 10 10 10 VEGF 0.25±0.04 1.73±0.14*1.01±0.12*#0.68±0.11*#△0.65±0.13*#△PGE2 0.31±0.07 1.96±0.16*1.12±0.13*#0.81±0.12*#△0.79±0.11*#△

    圖2 各組大鼠肛周VEGF、PGE2蛋白免疫組化表達(dá)(DAB,40倍)

    3 討 論

    痔的發(fā)病主要有直腸海綿體學(xué)說(shuō)、肛墊移位學(xué)說(shuō)、竇狀靜脈擴(kuò)張學(xué)說(shuō)等,與飲食、生活、孕產(chǎn)、工作、年齡等因素密切相關(guān)[11-12]。痔易反復(fù)發(fā)作,藥物治療效果欠佳,嚴(yán)重影響生活質(zhì)量,手術(shù)治療為最終選擇,但因肛周內(nèi)外括約肌分布著豐富的神經(jīng),痛覺(jué)非常敏感,手術(shù)創(chuàng)傷、術(shù)后排便用力等會(huì)刺激肛門神經(jīng)感受器,導(dǎo)致括約肌痙攣、收縮,局部循環(huán)障礙,肛緣血管滲透壓增加,引起肛門疼痛水腫,術(shù)后創(chuàng)面難以愈合[13]。痔術(shù)后局部組織損傷,升高的巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng),引起白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及TNF-α、IL-6和IL-8水平升高,激活更多炎癥介質(zhì)的表達(dá),加重癥反應(yīng),導(dǎo)致術(shù)后創(chuàng)面難以愈合[14]。術(shù)后創(chuàng)面愈合須經(jīng)過(guò)創(chuàng)面滲出期、肉芽生長(zhǎng)期和上皮細(xì)胞生長(zhǎng)期,炎性滲出階段產(chǎn)生各種機(jī)體修復(fù)因子,加速肉芽生長(zhǎng)。最強(qiáng)促血管生長(zhǎng)因子VEGF,可通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞增殖,使肉芽組織加速生長(zhǎng),改善局部血流量,促進(jìn)細(xì)胞增生和血管再生[15]。PGE2主要參與發(fā)熱、炎癥反應(yīng)、疼痛感知等生理及病理生理過(guò)程,在炎癥反應(yīng)各階段進(jìn)行炎癥調(diào)控,對(duì)痔大鼠模型肛周潰瘍炎癥有明顯的抑制作用[16]。因此,本研究從VEGF和PGE2水平變化探討清熱涼血解毒方對(duì)大鼠痔術(shù)后創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。

    痔病是中醫(yī)學(xué)中最早記載的疾病之一。濕熱蘊(yùn)結(jié),臟腑本虛,加之外感六淫、七情內(nèi)傷等引起的臟腑失調(diào)是導(dǎo)致痔病的主要原因?;颊呔植渴軗p,氣血阻滯,經(jīng)絡(luò)不暢,感染邪毒,加之濕邪困阻,氣血瘀滯更甚,導(dǎo)致術(shù)后創(chuàng)面愈合緩慢[17]。中醫(yī)藥既可以促進(jìn)創(chuàng)傷后組織修復(fù),減輕組織炎癥反應(yīng),又可以減少毛細(xì)血管的通透性,從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)來(lái)發(fā)揮作用[18]。清熱涼血解毒方中黃連、黃柏、梔子清熱燥濕、瀉火解毒;生大黃瀉下攻積、清熱瀉火、涼血解毒;苦參清熱燥濕、祛風(fēng)殺蟲、瀉火解毒;地榆清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血、逐瘀斂瘡;白芍行氣止痛消腫;秦皮清熱燥濕、收澀止??;白頭翁清熱解毒、涼血止?。谎雍骰钛?、理氣止痛;茵陳清熱利濕;紫草清熱解毒,涼血消腫。全方諸藥配合,共奏清熱涼血、燥濕解毒功效。清熱涼血解毒方對(duì)痔術(shù)后創(chuàng)面具有較好的治療作用,但其作用機(jī)制尚不明確。

    本研究發(fā)現(xiàn),清熱涼血解毒方各劑量組水腫程度評(píng)分和創(chuàng)面面積顯著低于模型組,說(shuō)明本方可改善肛周組織病理結(jié)構(gòu)。清熱涼血解毒方各劑量組TNF-α、IL-6、IL-8水平和VEGF、PGE2水平顯著低于模型組,且清熱涼血解毒方中、高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組。這些效果可能與以下作用有關(guān):方中黃連抑制體內(nèi)多種細(xì)菌,抵抗體內(nèi)內(nèi)毒素釋放;黃柏有抗真菌和病毒的作用,還可抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)和細(xì)胞免疫反應(yīng);梔子內(nèi)環(huán)烯醚萜類化合物可抗炎、抗氧化、利尿、解熱、鎮(zhèn)痛等,大黃酸、大黃素等通過(guò)游離蒽醌及其苷類調(diào)節(jié)TNF-α、血清淀粉酶等達(dá)到抗炎、抗菌抗病毒作用;苦參堿、槐果堿等發(fā)揮抗炎、抗病原微生物、降低毛細(xì)血管通透性等作用,并可促進(jìn)血管新生,改善創(chuàng)面微循環(huán);地榆有抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗炎消腫、修護(hù)受損皮膚等作用[19-22]。

    綜上所述,清熱涼血解毒方可有效促進(jìn)大鼠痔術(shù)后創(chuàng)面愈合,改善肛周組織,降低炎癥反應(yīng),其機(jī)制可能與降低VEGF和PGE2水平有關(guān)。

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