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    強心一號復(fù)方對膿毒癥小鼠心肌細胞凋亡的影響?

    2020-06-15 02:08:32王雪蕊徐霄龍哈雁翔郭玉紅劉清泉
    中國中醫(yī)急癥 2020年5期
    關(guān)鍵詞:強心陽性細胞膿毒癥

    王雪蕊 徐霄龍 黃 坡 哈雁翔 張 瑞 郭玉紅 劉清泉 △

    (1.首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院,北京 100010;2.中醫(yī)感染性疾病基礎(chǔ)研究北京市重點實驗室,北京 100010;3.北京市中醫(yī)研究所,北京 100010)

    膿毒癥是指宿主應(yīng)對微生物感染的應(yīng)答反應(yīng)失調(diào)進而導(dǎo)致的危及生命的多器官功能障礙[1]。膿毒癥是重癥監(jiān)護病房(ICU)內(nèi)死亡的主要原因,約占ICU死亡率的10%~50%[2]。膿毒癥心功能不全是膿毒癥的嚴重并發(fā)癥,其發(fā)生率為40%~50%,病死率高達70%~90%,與未合并心功能障礙的膿毒癥患者相比,此類患者病死率增加20%[3]。膿毒癥心功能不全屬于可逆性的心臟損傷,因此早期對其進行干預(yù)治療對于降低膿毒癥的病死率具有重要的意義[4]。課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗,總結(jié)出益氣溫陽、活血利水的中藥復(fù)方強心一號,發(fā)現(xiàn)其對于膿毒癥患者心臟功能具有改善作用。前期基礎(chǔ)研究也證實,該復(fù)方顯著降低盲腸結(jié)扎打孔(CLP)膿毒癥小鼠的死亡率,并顯著改善其射血分數(shù)和縮短分數(shù)等心功能指標[5]。本研究旨從心肌細胞凋亡和心臟凋亡相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)的角度,探討強心一號復(fù)方對膿毒癥小鼠的心臟保護機制。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 選用C57BL/6J北京小鼠,雄性,10周齡,體質(zhì)量20~23 g,均為SPF級飼養(yǎng),購自北京華阜康生物科技股份有限公司,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2014-0004,使用許可證號:SCXK(京)2015-0023,由北京中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)研究所按純系動物要求專人飼養(yǎng)。各組小鼠自由進水進食,保持室溫恒定,實驗方案通過北京市中醫(yī)研究所動物倫理委員會認可,實驗過程中對動物的處置符合有關(guān)善待實驗動物的規(guī)定。

    1.2 實驗藥物 參照《中華人民共和國藥典》,所有藥物由首都醫(yī)科大學附屬北京中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供。強心一號復(fù)方組成:水紅花籽30 g,黃芪30 g,茯苓20 g,丹參20 g,五味子10 g。按原方比例,110 g藥材加水400 mL浸泡30 min,沸騰后煎煮30 min,濃縮至110 mL,以質(zhì)量濃度1 g/mL作為實驗用藥劑量,并放于冰箱4℃冷藏備用。

    1.3 儀器和試劑 光學顯微鏡(BX51型,日本Olympus),臺式離心機(Allegra X-30R 型,美國 BECKMAN),酶標儀(ELx808型,美國Biotek),Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Odyssey CLX,美國Odyssey)。WGA 工作液(批號L4895,美國Sigma),TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(ab206386,美國abcam),BCA蛋白測定試劑盒(23225,美國Thermo),蛋白酶抑制劑(78429,美國Thermo),戊巴比妥鈉(批號57-33-0,上海榕柏生物技術(shù)有限公司),抗B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)抗體(ab182858,美國abcam),抗Bcl-2相關(guān) X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)抗體(ab32503,美國abcam),抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase3)抗體(ab13847,美國abcam),抗裂解的caspase3(Cleaved caspase3)抗體(ab2302,美國abcam),抗GAPDH抗體(TA309157,北京中杉金橋)。

    1.4 分組與造模 采取隨機數(shù)字表法將動物分為對照組、模型組、強心組,每組12只。模型組、強心組小鼠進行CLP造模。模型制備方法:1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠,固定,消毒,于腹中線開口,輕柔取出盲腸,結(jié)扎1/2長度盲腸,使用5 mL注射器針頭于結(jié)扎段貫穿盲腸1次。對照組小鼠麻醉后進行假手術(shù)操作,不進行結(jié)扎和穿刺。術(shù)畢小鼠背部皮下注射生理鹽水2 mL防治休克。

    1.5 干預(yù)方法 強心組于造模后2 h給予1 g/kg強心一號復(fù)方灌胃,灌胃體積1 mL。模型組與假手術(shù)組于造模術(shù)后2 h給予1 mL生理鹽水灌胃。各組均每日干預(yù)1次,持續(xù)48 h。

    1.6 標本采集與檢測 1)膿毒癥小鼠臨床評分。CLP術(shù)后6 h及24 h,根據(jù)SHIRPA協(xié)議[6-7],基于以下參數(shù)對膿毒癥小鼠進行臨床評分測定。每一項參數(shù)如有變化得1分,最多12分。觀察參數(shù)包括腹部扭動,立毛,糞便變化(如腹瀉),流淚,瞼閉合,運動活性低,體溫低(低于35℃計1分),反射性逃避觸摸,自發(fā)活動變化,握力降低和呼吸頻率變化(換氣過度)。2)心臟組織病理切片制備及染色。各組小鼠CLP術(shù)后48 h進行麻醉,用含有肝素的0.9%氯化鈉注射液灌注心臟,剪下心臟組織,4%多聚甲醛中固定過夜,然后進行常規(guī)脫水包埋制作石蠟切片。3)采用WGA染色檢測心肌細胞面積。切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟至水,檸檬酸抗原修復(fù)90 s,PBS緩沖液洗3遍,用血清封閉液室溫封閉30 min,WGA工作液10 μg/mL 37℃孵育60 min,PBS緩沖液洗3遍,DAPI封片。使用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進行病理圖像采集,使用NIS Br 4.0軟件對心肌細胞面積進行數(shù)據(jù)分析。4)心臟組織TUNEL細胞凋亡測定。根據(jù)試劑盒說明書,將石蠟切片脫蠟至水。由20 μg/mL蛋白酶K溶液通透,室溫孵育8~10 min,PBS泡洗。3%過氧化氫溶液室溫孵育20 min后PBS泡洗。制備rTdT孵育緩沖液并進行室溫孵育60 min后終止反應(yīng)。配制Streptavidin-HRP工作液和DAB顯色液進行顯色,可見TUNEL染色陽性(棕色)的凋亡細胞。采用Nikon ECLIPSE 90i顯微鏡進行切片觀察,NIS Br 4.0軟件對陽性細胞百分比進行統(tǒng)計。5)Western blotting法檢測。各組小鼠取心臟組織勻漿后,使用蛋白提取試劑盒提取總蛋白,BCA法檢測總蛋白的濃度。配制凝膠,進行SDS-PAGE電泳,電轉(zhuǎn),血清封閉等步驟。加入Bcl-2抗體、Bax抗體、Caspase3抗體、Cleaved caspase3抗體、GAPDH一抗(1∶1 000)孵育,4℃過夜。第2天室溫平衡,TBST洗滌后加入對應(yīng)熒光二抗孵育。采用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)對硝酸纖維膜上的蛋白進行量化測定,Bcl-2和Bax以GAPDH作為參比蛋白,Cleaved caspase3以Caspase3作為參比蛋白,Image J對灰度進行分析統(tǒng)計。

    1.7 統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)以()表示,組間比較采用單因素方差分析,并用Turkey法(方差齊時)或Dunnett′s T3(方差不齊時)作組間多重比較。當檢驗變量不服從正態(tài)分布時,采用非參數(shù)統(tǒng)計中的Kruskal-Wallis檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組小鼠臨床評分比較 見表1。與對照組相比,模型組6 h和24 h的臨床評分值均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,強心組的臨床評分在24 h顯著下調(diào)(P<0.05),6 h時無顯著差異。提示強心一號復(fù)方對CLP術(shù)后小鼠的大體狀態(tài)具有一定改善作用。

    表1 各組小鼠臨床評分比較(分,±s)

    表1 各組小鼠臨床評分比較(分,±s)

    與對照組比較,?P<0.05;與模型組比較,#P<0.05。下同

    組別對照組模型組強心組24 h 0.0±0.2 7.0±1.2*5.0±1.5#6 h 0.0±0.5 6.0±3.0*5.0±3.0

    2.2 各組小鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)比較 見圖1,表2。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組心肌細胞排列規(guī)律,大小一致。與對照組相比,模型組小鼠心肌細胞面積顯著增大(P<0.05),排列不規(guī)律。與模型組相比,強心組心肌細胞面積顯著下降(P<0.05)。說明強心一號復(fù)方對膿毒癥小鼠心肌細胞代償性肥大具有一定改善作用。

    圖1 各組小鼠心肌細胞結(jié)構(gòu)(WGA染色,400倍)

    表2 各組小鼠心肌細胞面積比較(μm2,±s)

    表2 各組小鼠心肌細胞面積比較(μm2,±s)

    項目心肌細胞面積對照組263.74±9.47模型組429.23±10.65*強心組298.53±16.72#

    2.2 各組小鼠心肌細胞凋亡比較 見圖2,表3。采用TUNEL染色評價CLP術(shù)后48 h對照組、模型組、強心組小鼠心臟組織凋亡情況,并統(tǒng)計各組TUNEL陽性細胞的百分比。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組心臟組織幾乎沒有凋亡細胞。與對照組相比,模型組小鼠心肌細胞凋亡顯著增多(P<0.05)。與模型組相比,強心組心肌細胞凋亡顯著減少(P<0.05)。說明強心一號復(fù)方對膿毒癥術(shù)后小鼠心臟組織的凋亡具有改善作用。

    圖2 各組小鼠心臟組織凋亡情況(TUNEL染色,100倍)

    表3 各組小鼠心臟TUNEL陽性細胞數(shù)比較(%,±s)

    表3 各組小鼠心臟TUNEL陽性細胞數(shù)比較(%,±s)

    項目心臟TUNEL陽性細胞對照組0.268±0.098模型組4.387±0.676*強心組0.960±0.327#

    2.3 各組小鼠心臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達的比較 見表4。與對照組相比,模型組小鼠心臟組織促凋亡蛋白Cleaved Caspase3的蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05),Bcl-2和Bax蛋白表達變化無顯著性差異。與模型組相比,強心組心臟組織中Bcl-2蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.05),Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達顯著下調(diào)(P<0.05)。提示強心一號復(fù)方對CLP術(shù)后心臟組織凋亡相關(guān)蛋白的表達具有調(diào)節(jié)作用。

    表4 各組小鼠心臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達的比較(±s)

    表4 各組小鼠心臟組織凋亡相關(guān)蛋白表達的比較(±s)

    組別Bcl-2/GAPDH Bax/GAPDH Cleaved Caspase3/Caspase3對照組模型組強心組1.044±0.024 0.883±0.080 1.990±0.206#1.024±0.036 1.082±0.078 0.426±0.042#1.030±0.035 2.072±0.112*0.624±0.127#

    3 討 論

    膿毒癥心功能障礙可歸屬于中醫(yī)學“心水”“喘證”“水腫”等范疇[8]。此類患者心氣陽虛,兼具水飲及血瘀等邪實互擾,多為本虛標實、虛實夾雜證,病位涉及肺、脾、肝、腎諸臟的功能失調(diào),治宜益氣溫陽、活血利水。強心一號配方是本團隊根據(jù)本院國家級名老中醫(yī)黃麗娟教授多年中西醫(yī)結(jié)合防治心血管病的臨床觀察,在結(jié)合古代文獻及中醫(yī)經(jīng)典理論的指導(dǎo)下形成的有效方劑。方中黃芪補氣升陽、益衛(wèi)固表、利水消腫,補而不滯,為君藥;茯苓、丹參、水紅花籽可健脾、利水、滲濕、活血,為臣藥;五味子養(yǎng)陰收斂,可收斂心氣,防止益氣溫陽藥辛溫傷陰散氣,為佐使藥。前期基礎(chǔ)實驗證實該方能顯著降低膿毒癥小鼠死亡率,對心臟射血分數(shù)和縮短分數(shù)等心功能指標也有顯著的改善作用[5]。本研究根據(jù)SHIRPA協(xié)議對CLP術(shù)后小鼠進行臨床評分測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)與模型組相比,強心一號對CLP術(shù)后24 h小鼠的臨床評分具有顯著的改善作用,進一步證明了該復(fù)方對于膿毒癥小鼠的療效。

    膿毒癥患者出現(xiàn)的心功能障礙屬于可逆性的,患者早期出現(xiàn)血流動力學變化,心室收縮、舒張能力輕微改變,隨著病情的發(fā)展,到后期出現(xiàn)心輸出力和容量反應(yīng)性下降、心肌收縮能力下降、射血功能減退等,并可見以左心室為主的心室擴張重構(gòu)[3,9-10]。由于心肌收縮力的改變,心肌細胞會出現(xiàn)代償性的心肌肥大,從而維持心功能。本研究發(fā)現(xiàn)CLP術(shù)后心肌細胞出現(xiàn)代償性肥大,與模型組相比強心一號復(fù)方可顯著降低心肌細胞面積,說明該復(fù)方對于CLP術(shù)后心臟重構(gòu)具有一定改善作用。

    細胞凋亡是膿毒癥發(fā)生器官功能損傷的主要病理機制之一[11-12],膿毒癥發(fā)生時心肌細胞內(nèi)凋亡相關(guān)信號通路激活,包括由Caspase-9激活介導(dǎo)的內(nèi)源性細胞凋亡途徑、Caspase-8激活介導(dǎo)的外源性細胞凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等激活的凋亡相關(guān)途徑[13-14]。Caspase-3是細胞凋亡的執(zhí)行者,是外源性凋亡途徑、線粒體凋亡途徑、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途徑的交匯點[15]。其活化形式是Cleaved Caspase-3,可通過識別和切割抗凋亡蛋白氨基酸序列、水解DNA核酸內(nèi)切酶抑制因子,增強DNA內(nèi)切酶的活性從而促進細胞凋亡的發(fā)生[16]。Bcl-2家族主要包括抗凋亡基因(如Bcl-2、Bcl-xl等)和促凋亡基因(如Bax、Bid等),主要激活線粒體凋亡途徑[17]。其中Bcl-2和Bax和作為Bcl-2基因家族的代表成員,通過影響線粒體跨膜電位的穩(wěn)定性和線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放,介導(dǎo)凋亡的發(fā)生[18]。本研究發(fā)現(xiàn),與對照組相比模型組心臟組織TUNEL陽性細胞數(shù)量顯著增加,Cleaved Caspase3表達顯著上調(diào),說明膿毒癥可促進心肌細胞凋亡的發(fā)生。強心一號復(fù)方可顯著下調(diào)心臟組織TUNEL陽性細胞的數(shù)量,上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達,同時下調(diào)Bax和Cleaved Caspase3的表達,說明強心一號復(fù)方對膿毒癥的心臟保護作用可能與調(diào)節(jié)心肌細胞凋亡和心臟凋亡相關(guān)蛋白的表達有關(guān)。

    綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)強心一號復(fù)方可顯著改善CLP小鼠術(shù)后的臨床評分,改善心肌代償性肥大和凋亡情況,其機制可能與上調(diào)Bcl-2、下調(diào)Bax和Cleaved Caspase3蛋白表達有關(guān)。

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