響應(yīng)面優(yōu)化酶促水解鲅魚蛋白制備ACE 抑制肽的研究*

吳若晨 吳正浩 馮譯萱 梁曉麗 黃光榮*

（中國計量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310018）

高血壓是現(xiàn)代社會人們面臨的重要健康問題，據(jù)統(tǒng)計分析，2010 年—2012 年我國18 歲以上人口高血壓患病率約23%。研究表明，血壓水平和動脈硬化、中風(fēng)等心血管疾病有直接聯(lián)系。在人體中，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）水解血管緊張素Ⅰ羧基末端二肽His-Leu 產(chǎn)生血管緊張素Ⅱ，是已知的最容易引起血管收縮的物質(zhì)之一，而ACE 抑制肽與血管緊張素Ⅰ形成競爭性抑制，有助于維持血壓平穩(wěn)。海洋魚類蛋白擁有豐富的氨基酸結(jié)構(gòu)，是生物活性肽的巨大來源，開發(fā)利用海洋魚類蛋白中的ACE 抑制肽受到越來越多的關(guān)注。

鲅魚（Scomberomorus niphonius）學(xué)名為藍(lán)點馬鮫，屬于鱸形目鲅科，俗稱燕魚、青箭等，其可食用部分營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、維生素A 和多種礦物質(zhì)等。鲅魚種類較多，一些低值小鲅魚利用率較低，造成資源大量浪費。目前，由魚類蛋白制備ACE 抑制肽的常用方法是酶水解法和微生物發(fā)酵法。Zhang 等用中性蛋白酶水解水母性腺，獲得了一種IC50值為1 164.18 μmol/L 的SY 肽；Toopcham等用鹵代硝酸菌SK1-3-7 蛋白酶水解羅非魚肉糜獲得一種具有良好熱穩(wěn)定性與pH 穩(wěn)定性的ACE 抑制肽;Zhang 等將巴沙魚皮用蛋白酶水解，使用響應(yīng)面法建立數(shù)學(xué)模型優(yōu)化水解條件，發(fā)現(xiàn)水解產(chǎn)物具有較高的ACE 抑制活性。目前對以小鲅魚或其加工副產(chǎn)物為原料，制備抗氧化肽、抗菌肽等的研究較多，而關(guān)于鲅魚蛋白質(zhì)水解制備ACE 抑制肽的研究較少。本研究以低值小鲅魚為原料制備鲅魚蛋白酶解液，并對鲅魚蛋白酶解液的體外ACE 抑制率進(jìn)行研究，為低值小鲅魚的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

小鲅魚干，購自浙江省溫州洞頭區(qū)水產(chǎn)品市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料預(yù)處理

小鲅魚干，去頭、尾，于80 ℃烘干，粉碎過100 目篩，以石油醚為溶劑進(jìn)行回流脫脂，室溫?fù)]發(fā)石油醚后，再于80 ℃烘干，粉碎過100 目篩，所得鲅魚脫脂粉于玻璃瓶中低溫密封保存。

1.2.2 酶促水解基本工藝

稱取0.3 g 脫脂魚粉于錐形瓶中，加一定pH 值的Tris-HCl 緩沖液20 mL，搖勻后加一定量的蛋白酶，在恒溫振蕩水浴（200 r/min）中水解一定時間后，90 ℃水浴中滅酶10 min，冷卻離心（10 000 r/min，4 ℃，20 min），收集上清液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 蛋白酶篩選

參考苑園園等的方法，分別用堿性蛋白酶（50 ℃、pH 8.5）、風(fēng)味蛋白酶（50 ℃、pH 7.0）、胰蛋白酶（37 ℃、pH 8.0）作水解用酶，以水解度、ACE 抑制率為指標(biāo)，篩選出最適的蛋白酶。

1.2.4 單因素試驗

分別以水解溫度（30 ℃～60 ℃）、pH 值（7.0～9.5）、蛋白酶添加量（3 000 U/g～17 000 U/g魚粉質(zhì)量）、水解時間（1 h～5 h）、料液比（5 g/L～100 g/L）為單因素進(jìn)行水解試驗，測定水解度和ACE 抑制率。

1.2.5 酶解條件響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取水解時間、水解溫度、pH 值、酶添加量4 個因素進(jìn)一步優(yōu)化，以單因素試驗中較佳水平為中心點，ACE 抑制率為響應(yīng)值，利用CCD（Central Composite Design）進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計。四因素三水平編碼表如表1 所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平編碼值表

1.3 測定方法

1.3.1 蛋白質(zhì)含量測定

以BSA 為標(biāo)準(zhǔn)品用福林酚法測定可溶性蛋白質(zhì)的含量?？偟鞍踪|(zhì)含量測定采用堿溶法，即樣品先用2 mol/L NaOH 提取4 h 后采用福林酚法測定可溶性蛋白質(zhì)含量。

1.3.2 水解度測定

根據(jù)Pericin 等的方法測定三氯乙酸（TCA）可溶性多肽含量。以水解液中TCA 可溶性多肽占水解前總蛋白質(zhì)量的百分比來表示水解度（DH）。

1.3.3 ACE 抑制率測定

將樣品蛋白濃度調(diào)整到1.0 mg/mL，然后參照苑園園等的方法，以高效液相色譜法測定空白或添加了樣品溶液的ACE 水解HHL 三肽后釋放出的馬尿酸含量，計算出ACE 抑制率。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

所有試驗重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并采用Design Expert 10 和Origin 8.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶的篩選

選擇常見的3 種蛋白酶對脫脂鲅魚粉進(jìn)行酶促水解，測定其水解度和ACE 抑制率，結(jié)果如圖1所示。從圖1 可以看出，胰蛋白酶和堿性蛋白酶水解后均有較高的ACE 抑制率，但是堿性蛋白酶比胰蛋白酶水解時的水解度更高，因此選擇堿性蛋白酶為最佳水解用蛋白酶。

圖1 不同蛋白酶對鲅魚蛋白質(zhì)水解的影響

2.2 單因素試驗

在其他條件固定的情況下，分別研究了料液比、酶添加量、水解溫度、pH 值和水解時間對鲅魚蛋白質(zhì)酶促水解過程的影響，測定水解液的ACE抑制率和水解度，結(jié)果如圖2～圖6 所示。

圖2 料液比對鲅魚蛋白質(zhì)水解的影響

圖3 加酶量對鲅魚蛋白質(zhì)水解的影響

由圖2 可知，水解度先隨料液比上升而上升，當(dāng)料液比在10 g/L 時水解度高于其他水平，此后水解度降低，ACE 抑制率則大致呈現(xiàn)隨料液比增大而逐步上升的趨勢。由圖3 可知，水解度隨酶添加量先增加后下降，在9 000 U/g 時最高，而水解液ACE 抑制率則在酶添加量為5 000 U/g 時最高。

圖4 溫度對鲅魚蛋白質(zhì)水解的影響

由圖4 可知，水解度在水解溫度為40 ℃時最高，但水解液ACE 抑制率在50 ℃時最高。

圖5 pH 對鲅魚蛋白質(zhì)水解的影響

由圖5 可知，水解度在pH 8.5 表現(xiàn)出較高值，這是堿性蛋白酶的特點，但水解液ACE 抑制率卻并未出現(xiàn)有規(guī)律的變化，在pH 9.0 時表現(xiàn)出最大相對抗凝血活性。

圖6 水解時間對鲅魚蛋白質(zhì)水解的影響

從圖6 可知，水解時間越長，水解液ACE 抑制率越高，但在4 h 后開始下降，水解度也隨著水解時間增加而增加，但在4 h 后逐漸減小。因此，通過單因素試驗確定下一步響應(yīng)面優(yōu)化水解條件的因素為堿性蛋白酶添加量、水解溫度、水解時間和pH 值，其中心點分別為9 000 U/g、50 ℃、4 h 和8.5。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果可知，影響鲅魚蛋白質(zhì)水解制備ACE 抑制肽的主要因素有：pH 值、酶添加量、水解時間和水解溫度。因此，選擇這4 個影響因素進(jìn)行響應(yīng)面中心組合設(shè)計進(jìn)行優(yōu)化，響應(yīng)面試驗結(jié)果見表2，方差分析表見表3。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

表3 響應(yīng)面試驗方差分析

對響應(yīng)面試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，得到的二次多項式方程：

Y=+42.00+0.40A+2.89B-0.20C+5.99D+1.98AB-0.66AC-0.71AD+0.24BC+0.42BD+1.71CD-3.01A2-0.95B2-1.95C2-3.14D2。其中，Y 為ACE 抑制率（%），A 為pH，B 為水解溫度（℃），C 為水解時間（h），D 為酶添加量（U/g）。由表3 可知，該模型顯著（F=9.75，P＜0.0001）。模型的決定系數(shù)R2為0.9010，說明該模型擬合度較好，是相對可靠的。4 個因素的顯著性影響大小依次為：酶添加量>水解溫度>pH 值>水解時間。其中酶添加量、水解溫度表現(xiàn)顯著，因此可看出酶添加量、水解溫度對于水解液ACE 抑制率的影響較大。

根據(jù)表3 中的交叉因素分析表明，pH 值與水解溫度、水解時間與酶添加量的交互作用比較明顯（P<0.1），其交互作用如圖7 和圖8 所示，可直觀反映pH 值與溫度、酶添加量與反應(yīng)時間相互作用對ACE 抑制率的影響。網(wǎng)狀圖形上部空間曲面的陡峭程度反映的是此自變量因素對ACE 抑制率這一響應(yīng)值的影響程度，位于圖像下部等值線圖的橢圓離心率則反映了因素互相作用的效果大小。各曲面頂點是影響酶解效果各作用因素的最佳條件。用Design Expert 10 軟件預(yù)測得到的最優(yōu)水解條件為：堿性蛋白酶添加量9 981 U/g，水解溫度55 ℃，水解時間4.27 h，水解pH 值9.0，此時ACE 抑制率可達(dá)到46.02%。在該條件下重復(fù)3 次驗證試驗，測得水解液的ACE 抑制率為45.5%，與預(yù)測值較為相近。

圖7 pH 值與水解溫度的相互作用

圖8 水解時間與酶添加量的相互作用

3 結(jié)論

鲅魚是我國產(chǎn)量較高的海洋低值魚類，本研究以海洋低值小鲅魚為原料，脫脂后選用堿性蛋白酶水解，獲得具有較高ACE 抑制率的水解液，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化得到最佳水解條件為：堿性蛋白酶添加量9 981 U/g，水解溫度55 ℃，水解時間4.27 h，水解pH 值9.0，此時，ACE 抑制率可達(dá)45.5%。研究結(jié)果初步表明，海洋低值小鲅魚可以作為降血壓保健食品的功效性基料。