堿-酶結(jié)合法水解鉻革屑及響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究

丁紹蘭， 劉艷華, 龔貴金

(1.陜西科技大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.江西正合環(huán)保集團(tuán)， 江西 南昌 330000)

0 引言

近年來(lái)，中國(guó)作為最大的皮革制造國(guó)，每年都會(huì)產(chǎn)生超過(guò)70萬(wàn)噸的固體廢棄物[1].制革過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量副產(chǎn)品和廢物，僅有20%的原料皮被轉(zhuǎn)化成商業(yè)皮革，而剩余的固體廢棄物中90%為膠原蛋白[2,3].這不僅浪費(fèi)了蛋白資源，還對(duì)環(huán)境造成了危害.

環(huán)境污染成為全球皮革工業(yè)亟待解決的問(wèn)題[4].傳統(tǒng)的皮革固體廢棄物處理方式如焚燒、填埋等不僅無(wú)法解決鉻離子的污染，而且可能會(huì)對(duì)環(huán)境造成二次污染[5].因此，在發(fā)展制革清潔生產(chǎn)技術(shù)的同時(shí)，也要進(jìn)行資源化的利用.常見的鉻革屑處理方法有堿法處理、酸法處理、酶法處理、氧化法處理、配合法處理等[6].不同的處理方法有其各自的優(yōu)缺點(diǎn)：堿水解需要在較高的溫度和/或壓力下使用NaOH等堿性物質(zhì)進(jìn)行水解[7]；酸水解會(huì)對(duì)設(shè)備造成腐蝕而無(wú)法進(jìn)行推廣；酶水解具有較高的專一性，反應(yīng)時(shí)間短且反應(yīng)條件溫和，但酶對(duì)鉻的耐受能力差，且處理費(fèi)用較高[8].

原來(lái)對(duì)鉻革屑的研究主要集中在鉻回收及鉻鞣劑的制備上[9].近幾年，膠原多肽的提取及應(yīng)用的研究也越來(lái)越多[10]，主要表現(xiàn)在加脂劑、涂飾劑、農(nóng)業(yè)肥料上的應(yīng)用.本課題通過(guò)利用一種較好的鉻革屑水解工藝提取膠原蛋白，并應(yīng)用于厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣.

本文首先通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)氧化鈣堿處理以及中性蛋白酶處理步驟中各項(xiàng)參數(shù)(投加量、時(shí)間、溫度)進(jìn)行優(yōu)化，確定較佳的參數(shù)；再通過(guò)正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法研究各因素對(duì)鉻革屑水解率影響的顯著性以及各因素之間的相互作用，優(yōu)化出鉻革屑?jí)A-酶結(jié)合水解法的最佳方案，為鉻革屑資源化提供一定理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品和儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)藥品

實(shí)驗(yàn)所需藥品如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)藥品

藥品名稱生產(chǎn)廠家鉻革屑晉江秋夏皮革制造廠氧化鈣天津市天力化學(xué)試劑有限公司中性蛋白酶北京奧博星生物技術(shù)有限公司硫酸西安化學(xué)試劑廠氫氧化鈉天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司硼酸天津市天力化學(xué)試劑有限公司硫酸銅天津市天力化學(xué)試劑有限公司硫酸鉀天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司甲基紅-亞甲基藍(lán)天津市天力化學(xué)試劑有限公司

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

THZ-82恒溫水浴振蕩箱，國(guó)華企業(yè)；101-1AB型電熱鼓風(fēng)干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)，中科中佳科學(xué)儀器有限公司；BS 224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；ICP-AES，電感耦合等離子發(fā)射光譜，美國(guó)THEM有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 鉻革屑的預(yù)處理

將從皮革廠取得的藍(lán)濕皮塊在102±2 ℃烘干2 h，用剪刀剪碎成小塊，置于4 ℃冰箱以備用.

1.2.2 實(shí)驗(yàn)測(cè)定方法

膠原蛋白提取率采用重量分析法進(jìn)行計(jì)算[11]；用ICP-AES法測(cè)定水解液中鉻含量[12]；根據(jù)水解前后鉻含量變化計(jì)算脫鉻率.

1.2.3 堿處理和酶處理水解鉻革屑單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

(1)堿處理的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

取若干250 mL錐形瓶，分別加入5 g預(yù)處理后的鉻革屑和100 mL蒸餾水.稱取一定量的CaO(0%、0.5%、1%、2%、4%、6%、8%)，在一定溫度下(40 ℃、60 ℃、80 ℃、90 ℃)，反應(yīng)一定時(shí)間后(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)，調(diào)節(jié)pH為7后加入3%中性蛋白酶，在40 ℃、150 r/min下恒溫水浴振蕩反應(yīng)1 h，在8 000 r/min離心15 min.取上清液計(jì)算堿處理水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率，并選出堿水解鉻革屑的最佳反應(yīng)條件.

(2)酶處理的單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

取若干250 mL錐形瓶，分別加入5 g預(yù)處理后的鉻革屑和100 mL蒸餾水.然后加入2% CaO，在80 ℃、150 r/min下恒溫水浴振蕩反應(yīng)3 h后，調(diào)節(jié)pH為7，稱取一定量的中性蛋白酶(0%、0.5%、1%、2%、3%、5%、7%)，在一定溫度下(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃)，反應(yīng)一定時(shí)間后(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h、6 h)，在8 000 r/min離心15 min.取上清液計(jì)算酶處理水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率，并選出酶水解鉻革屑的最佳反應(yīng)條件.

1.2.4 正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化堿-酶結(jié)合水解鉻革屑的工藝條件

以L16(35)分別對(duì)堿處理和酶處理進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交分布如表2和表3所示.由正交優(yōu)化得到最佳正交方案，實(shí)施正交方案.運(yùn)用Box-Behnken模型進(jìn)行設(shè)計(jì)試驗(yàn)，并將擬合的結(jié)果與優(yōu)化前的參數(shù)進(jìn)行比較.

表2 堿處理正交試驗(yàn)因素水平表

水平因素CaO投加量(A)/%CaO反應(yīng)時(shí)間(B)/hCaO反應(yīng)溫度(C)/℃111702238033590

表3 酶處理正交試驗(yàn)因素水平表

水平因素酶投加量(E)/%酶反應(yīng)時(shí)間(F)/h酶反應(yīng)溫度(G)/℃111702238033590

2 結(jié)果與討論

2.1 堿處理和酶處理單因素參數(shù)確定

2.1.1 CaO投加量對(duì)鉻革屑水解的影響

不同投加量CaO水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率如圖1所示.從圖1可以看出，膠原蛋白提取率隨著CaO投加量增加而增加.當(dāng)CaO用量為2%時(shí)，提取率達(dá)到了79.79%，當(dāng)投加量處于2%～8%時(shí)，提取率逐漸趨于穩(wěn)定.這是由于膠原蛋白提取率受反應(yīng)體系中OH-濃度的影響，而CaO溶于水電離出的OH-有一定限度.當(dāng)CaO用量過(guò)高時(shí)，一部分Ca(OH)2生成白色沉淀，反應(yīng)體系中OH-濃度不再增加，因此膠原蛋白提取率逐漸穩(wěn)定[13].

從圖1還可以看出，脫鉻率隨著CaO投加量的增加先增大后趨于穩(wěn)定.當(dāng)CaO投加量為2%時(shí)，脫鉻率相對(duì)較高，達(dá)到89.32%，當(dāng)CaO投加量為6%～8%時(shí)，脫鉻率基本穩(wěn)定.過(guò)高CaO的投加不僅使系統(tǒng)灰分增加，而且浪費(fèi)材料，因此確定2%CaO為最佳的投加量.

圖1 CaO投加量對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

此外，如圖1所示，單獨(dú)蛋白酶水解的膠原蛋白提取率和脫鉻率分別為74.82%和75.36%.隨著CaO投加量的增加膠原蛋白提取率也增加，當(dāng)投加量為8%，膠原蛋白提取率達(dá)到最大85.32%，比單獨(dú)酶處理提取率提高了10.5%.此時(shí)，脫鉻率也達(dá)到最大，為98.82%，比單獨(dú)蛋白酶水解的脫鉻率大幅提高了23.46%，這表明相比于單獨(dú)的酶處理，堿-酶結(jié)合處理法明顯提高了鉻革屑的水解效率.

2.1.2 CaO反應(yīng)時(shí)間對(duì)鉻革屑水解的影響

CaO反應(yīng)時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響如圖2所示.從圖2可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，膠原蛋白提取率先增加后降低.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為4 h時(shí)，提取率達(dá)到最大，為78.11%，但此時(shí)水解液中鉻含量最高.

由圖2還可以看出，脫鉻率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而總體呈下降趨勢(shì).當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為3 h時(shí)，膠原蛋白提取率為74.9%，脫鉻率達(dá)到96.07%，鉻含量最低，為3.686 mg/L.這是由于鉻的沉淀與pH(OH-濃度)有很大的關(guān)系.反應(yīng)初始，體系中OH-濃度較高，Cr(Ⅲ)與OH-絡(luò)合生成Cr (OH)3被沉淀，水解液中鉻含量逐漸降低.但隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，Cr(Ⅲ)與OH-反應(yīng)趨于平衡，Cr(OH)3部分轉(zhuǎn)化Cr3+和CrO2-于水解液中相對(duì)穩(wěn)定[14].反應(yīng)3 h與4 h的提取率相比，僅降低了3.21%，幅度很小.因此確定反應(yīng)時(shí)間3 h為CaO水解最佳時(shí)間.

圖2 CaO反應(yīng)時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.1.3 CaO反應(yīng)溫度對(duì)鉻革屑水解的影響

不同溫度下，CaO水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率如圖3所示.從圖3可以看出，在一定范圍內(nèi)，隨著反應(yīng)體系溫度的升高膠原蛋白提取率迅速增加.當(dāng)反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到最大，92.98%.反應(yīng)體系溫度大于80 ℃時(shí)，提取率逐漸降低.由圖3還可以看出，脫鉻率隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸降低，當(dāng)反應(yīng)溫度為40 ℃時(shí)，水解液中鉻含量最低，但此時(shí)膠原蛋白提取率很差，這是由于低溫條件下分子運(yùn)動(dòng)緩慢，不利于反應(yīng)進(jìn)行.當(dāng)溫度超過(guò)60 ℃后，脫鉻率趨于穩(wěn)定并稍有減少，可見反應(yīng)過(guò)高不利于水解反應(yīng).因此確定80 ℃為最佳反應(yīng)溫度.

圖3 CaO反應(yīng)溫度對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.1.4 酶投加量對(duì)鉻革屑水解的影響

蛋白酶投加量水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率如圖4所示.從圖4可以看出，隨著蛋白酶投加量的增大，膠原蛋白提取率增加后趨于穩(wěn)定，而脫鉻率總體呈減小趨勢(shì).當(dāng)?shù)鞍酌赣昧?%時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到92.98%，脫鉻率達(dá)到88.58%，此時(shí)水解液中鉻含量為10.47 mg/L，與蛋白酶用量5%相比，提取率僅相差0.112%，但鉻含量約為前者的3倍.因此確定酶量3%是最佳蛋白酶投加量.

圖4 蛋白酶投加量對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

此外，當(dāng)?shù)鞍酌赣昧?%時(shí)，水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率均較低，分別為56.9%和81.4%，與投加量3%的水解結(jié)果相比，提取率和脫鉻率分別增加了36.08%和7.18%.由于CaO單獨(dú)水解鉻革屑時(shí)，利用OH-與鉻離子的配合能力大于膠原羧基離子[15].但隨著蛋白酶的添加，蛋白酶對(duì)革屑蛋白質(zhì)進(jìn)行高效、專一水解作用，從而使得膠原蛋白提取率大幅度的提高.因此，相比于單獨(dú)堿處理，堿-酶結(jié)合水解法可顯著提高鉻革屑的水解效果.

2.1.5 酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)鉻革屑水解的影響

蛋白酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響如圖5所示.從圖5可以看出，隨著蛋白酶反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng)，膠原蛋白提取率先增加后降低.當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為1 h時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到最大，水解液中氮含量為3 493 mg/L.由圖5還可知，脫鉻率隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)變化幅度不大，水解液中鉻含量在9.705～22.755 mg/L變化，可見酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)脫鉻率影響不明顯，因此選擇1 h作為最佳蛋白酶反應(yīng)時(shí)間.

圖5 蛋白酶反應(yīng)時(shí)間對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.1.6 酶反應(yīng)溫度對(duì)鉻革屑水解的影響

蛋白酶反應(yīng)溫度對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響如圖6所示.從圖6可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增加，膠原蛋白提取率先增加后減小并趨于平緩.反應(yīng)溫度40 ℃時(shí)，提取率最大，達(dá)到88.39%.溫度過(guò)低時(shí)，酶活性不足，不利于酶水解反應(yīng)，溫度過(guò)高時(shí)，蛋白酶失活，酶水解作用減慢甚至停止，從而膠原蛋白提取率逐漸下降.從圖6還可以看出，脫鉻率隨著反應(yīng)溫度的增加而基本不變，說(shuō)明酶水解溫度對(duì)水解液中鉻含量影響不大，在40 ℃時(shí)，鉻含量稍低，因此確定40 ℃為酶水解的最佳溫度.

圖6 蛋白酶反應(yīng)溫度對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的影響

2.2 正交試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法分析優(yōu)化

Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果如表4所示.

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 CaO投加量與CaO反應(yīng)時(shí)間交互作用的分析與優(yōu)化

CaO投加量、CaO反應(yīng)時(shí)間及其交互作用對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應(yīng)曲面如圖7所示.從圖7(a)可以看出，對(duì)于膠原蛋白提取率來(lái)說(shuō)，兩者(AB)交互作用極顯著(P<0.000 1).在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)CaO投加量和CaO反應(yīng)時(shí)間分別處于1.5%～2%和2～4 h時(shí)，對(duì)水解效率有較大影響.

從圖7(b)可以看出，對(duì)于脫鉻率來(lái)說(shuō)，兩者(AB)交互作用不顯著(P=0.883 6).在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，CaO投加量和CaO反應(yīng)時(shí)間分別在2%～2.5%和2～4 h時(shí)，此時(shí)脫鉻率在試驗(yàn)中達(dá)到最大值.

2.2.2 CaO投加量與CaO反應(yīng)溫度交互作用的分析與優(yōu)化

CaO投加量、CaO反應(yīng)溫度及其交互作用對(duì)水解鉻革屑的膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應(yīng)曲面如圖8所示.從圖8(a)可以看出，對(duì)于膠原蛋白提取率來(lái)說(shuō)，兩者(AC)交互作用極顯著(P<0.000 1)，在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)CaO投加量和CaO反應(yīng)溫度分別處于1.5%～2.5%和75 ℃～85 ℃時(shí)，膠原蛋白提取率在試驗(yàn)水平中達(dá)到最大值.

從圖8(b)可以看出，對(duì)于脫鉻率來(lái)說(shuō)，兩者(AC)交互作用不顯著(P=0.877 1)，當(dāng)CaO反應(yīng)溫度為80 ℃時(shí)，脫鉻率在試驗(yàn)內(nèi)達(dá)到最大值.當(dāng)溫度處于70 ℃～80 ℃時(shí)，脫鉻率不斷增大，隨著溫度的繼續(xù)升高，脫鉻率逐漸降低.在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)CaO投加量和CaO反應(yīng)溫度分別處于1.5%～3%和75 ℃～85 ℃時(shí)，脫鉻率在試驗(yàn)內(nèi)達(dá)到最大值.

2.2.3 CaO反應(yīng)時(shí)間與CaO反應(yīng)溫度交互作用的分析與優(yōu)化

CaO反應(yīng)時(shí)間、CaO反應(yīng)溫度及其交互作用對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應(yīng)曲面如圖9所示.由圖9(a)可見，對(duì)于膠原蛋白提取率，兩者(BC)交互作用極顯著(P<0.000 1).在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)CaO反應(yīng)時(shí)間和CaO反應(yīng)溫度分別處于2.5～5.5 h和70 ℃～85 ℃時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到最大值.

由圖9(b)可見，對(duì)于脫鉻率，兩者(BC)交互作用顯著(P<0.011 6).當(dāng)CaO反應(yīng)時(shí)間和CaO反應(yīng)溫度分別處于1～4 h和80 ℃～85 ℃時(shí)，脫鉻率達(dá)到最大值.

(a)CaO反應(yīng)時(shí)間與CaO反應(yīng)溫度交互作用對(duì)膠原白提取率的響應(yīng)曲面

(b)CaO反應(yīng)時(shí)間與CaO反應(yīng)溫度交互作用對(duì)脫鉻率的響應(yīng)曲面圖9 CaO反應(yīng)時(shí)間與CaO反應(yīng)溫度交互作用對(duì)膠原蛋白提取率和脫鉻率的響應(yīng)曲面

2.2.4 酶投加量、酶反應(yīng)時(shí)間和酶反應(yīng)溫度交互作用的分析與優(yōu)化

酶投加量、酶反應(yīng)時(shí)間和酶反應(yīng)溫度及其交互作用對(duì)膠原蛋白提取率的響應(yīng)曲面如圖10所示.酶投加量和酶反應(yīng)時(shí)間交互作用(圖10(a)：EF，P=0.967 8)、酶反應(yīng)時(shí)間和酶反應(yīng)溫度交互作用(圖10(b)：FG，P=0.712 4)、酶投加量和酶反應(yīng)溫度交互作用(圖10(c)：EG，P=0.232 6)，均不顯著.

在試驗(yàn)水平范圍內(nèi)，當(dāng)酶投加量和酶反應(yīng)時(shí)間分別處于0.9%～1.3%和4～5 h時(shí)、酶反應(yīng)時(shí)間和酶反應(yīng)溫度分別處于4～5 h和35 ℃～45 ℃時(shí)、酶投加量和酶反應(yīng)溫度分別處于0.9%～1.1%和35 ℃～45 ℃時(shí)，膠原蛋白提取率達(dá)到最大值.對(duì)于脫鉻率來(lái)說(shuō)，酶投加量、酶反應(yīng)時(shí)間和酶反應(yīng)溫度之間沒有交互作用.

通過(guò)響應(yīng)曲面分析，確定堿-酶結(jié)合法水解鉻革屑最佳工藝條件，即為：CaO投加量2.1%、CaO反應(yīng)時(shí)間3.3 h、CaO反應(yīng)溫度79.7 ℃、酶投加量5.6%、酶反應(yīng)時(shí)間1.2 h、酶反應(yīng)溫度48.6 ℃.優(yōu)化后膠原蛋白提取率和脫鉻率分別達(dá)到99.14%和98.9%.

3 結(jié)論

(1)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)探究堿水解鉻革屑和酶處理鉻革屑的最佳工藝參數(shù)：堿水解鉻革屑最佳條件為CaO用量2%、CaO反應(yīng)時(shí)間3 h、CaO反應(yīng)溫度80 ℃，酶水解鉻革屑最佳參數(shù)為酶用量3%、酶反應(yīng)時(shí)間1 h、酶反應(yīng)溫度40 ℃.水解液中鉻含量最低達(dá)到3.686 mg/L.

(2)通過(guò)響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)確定鉻革屑水解的最佳工藝條件，即為：CaO投加量2.1%、CaO反應(yīng)時(shí)間3.3 h、CaO反應(yīng)溫度79.7 ℃、酶投加量5.6%、酶反應(yīng)時(shí)間1.2 h、酶反應(yīng)溫度48.6 ℃.優(yōu)化后膠原蛋白提取率和脫鉻率分別達(dá)到99.14%和98.9%，比優(yōu)化前分別增加了6.16%和2.83%.

(3)過(guò)響應(yīng)曲面優(yōu)化試驗(yàn)確定各因素之間的相互作用結(jié)果，結(jié)果表明：AB、AC、BC的交互作用對(duì)于膠原蛋白提取率有著顯著的影響，而EF、EG、FG的交互作用對(duì)水解效果影響不顯著，影響效果依次為FG>EG>EF.AB和AC之間的交互作用對(duì)水解脫鉻影響不明顯，但BC的交互作用對(duì)脫鉻效果有一定影響，酶水解對(duì)脫鉻效果沒有交互作用的影響