半支蓮組培苗根系對鹽脅迫生理響應(yīng)機(jī)制

陳彥旭，趙 胡，馮姍姍

（阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037）

土壤鹽漬化不僅能夠引發(fā)農(nóng)作物減產(chǎn)、死亡，而且對生態(tài)環(huán)境和社會(huì)經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展也有著廣泛影響[1-2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國鹽漬化土地面積約近1億hm2，并隨著我國城市和工業(yè)化的發(fā)展，土地鹽漬化的面積仍在繼續(xù)擴(kuò)大[3]。隨著這一局勢的發(fā)展，越來越多的植物在生長過程中都將受到鹽漬化脅迫。例如，NaCl對荊芥種子萌發(fā)有明顯抑制作用[4]；鹽脅迫能夠引起丙二醛（malondialdehyde，MDA）在梔子幼苗中積累，降低植物體內(nèi)超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、過氧化物酶（peroxidase isoenzymes，POD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）三種酶的活性等[5]。因此，篩選、培育耐鹽植物品種，研究觀賞植物的耐鹽生理機(jī)制及其耐鹽能力，對挖掘和利用耐鹽的觀賞植物資源、綠化鹽漬土壤、改良鹽漬土壤環(huán)境具有重要意義。

半支蓮（Portulaca grandiflora Hook）屬于馬齒莧科，是一年生肉質(zhì)草本花卉，別稱松葉牡丹、太陽花、洋馬齒莧（植物學(xué)大辭典），民間俗稱“死不了”。半支蓮莖干低矮，葉片細(xì)小，呈三角狀卵形，花瓣顏色鮮麗，向頂重瓣而生，生性強(qiáng)健，易栽耐活，密集叢生花期又長，既可作為地被植物，也可作為花壇、花境植物廣泛應(yīng)用于城市綠化中[6]。另外，半支蓮可全草入藥，具有重要藥用價(jià)值。

關(guān)于半支蓮的研究集中在半支蓮的栽培及配方施肥、藥用保健成分分析、半支蓮組織培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)調(diào)控的研究[7-9]。但對其耐鹽生理機(jī)制未見相關(guān)報(bào)道。為此，本文以半支蓮?fù)庵搀w為試材，研究不同濃度NaCl對半支蓮組培苗根系生長、根系抗氧化能力以及脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響，旨在為半支蓮抗鹽性、耐鹽閾值確定、合理利用半支蓮改良鹽漬土壤環(huán)境提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及鹽脅迫處理

采集生長健壯的半支蓮莖段，用流水沖洗0.5 h后，在無菌操作室里用70%酒精浸30 s后，以濃度為0.1%升汞+吐溫80消毒7 min，用無菌水沖洗5～7遍，以除去殘余的升汞。在超凈工作臺(tái)上選取處理后半支蓮莖段將其接種到MS+1.0mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽增殖誘導(dǎo)。2周后，剪下不定芽并接種到MS培養(yǎng)基+0.1 mg/L NAA誘導(dǎo)不定芽生根，4周后，形成半支蓮無菌苗。半支蓮無菌苗誘導(dǎo)培養(yǎng)條件為25℃恒溫，光照時(shí)間 16 h/d，光照強(qiáng)度為 80 μmol·m-2·s-1，室內(nèi)濕度保持在50%～60%條件下進(jìn)行。挑選健壯且生長一致無菌苗，從根基部剪切后分別接入含有 50、100、150、200 和 250 mmol/L 系列 Na-Cl濃度的生根培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/L NAA）中進(jìn)行鹽脅迫處理，以不加NaCl培養(yǎng)基為對照，每個(gè)濃度做5次重復(fù)處理。培養(yǎng)條件與半支蓮無菌苗培養(yǎng)條件相同，于植物組織培養(yǎng)室培養(yǎng)30 d后調(diào)查組培苗的生長狀況并測定根系生理指標(biāo)。

1.2 觀測指標(biāo)及方法

1.2.1 根系生長指標(biāo)測定

根系生物量測定：從對照組和各處理組中選取大小一致的植株，流水緩沖洗掉根系表面瓊脂，用濾紙吸干植株表面水分，用直尺測量對照和各處理組培苗根系長度，計(jì)算各鹽處理根系長度的平均值；然后將其置于105℃干燥箱中進(jìn)行殺青，再于80℃烘干至恒重后分別稱干重，根系生物量以單株苗根系重量表示。

1.2.2 酶液提取

取0.5 g根系加入1 mL預(yù)冷的含1%聚乙烯吡咯烷酮、1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）的50 mmol/L磷酸緩沖液（PBS,pH7.8）中，冰浴研磨，15 000 r/min離心20 min，取上清液備用。以上操作均在4℃進(jìn)行。

1.2.3 可溶性蛋白含量測定

采用Bradford（1976）[10]法進(jìn)行蛋白含量檢測，以考馬斯亮藍(lán)G-250作為顯色劑，在595 nm處用分光光度計(jì)測定OD值，蛋白含量以mg/g表示。

1.2.4 根系游離脯氨酸含量測定

分別稱取5組不同濃度Nacl處理后的半支蓮根系樣品0.5 g，加入3%磺基水楊酸2 mL進(jìn)行充分研磨，沸水浴 10 min，15 000 r·min-1離心 15 min后，取上清液0.25 mL，加入3%磺基水楊酸0.75 mL，1 mL冰醋酸和2.5%茚三酮2 mL，95℃水浴1 h，然后用4 mL甲苯萃取，以甲苯溶液為空白對照，測OD520，脯氨酸含量以mg/g表示[11]。

1.2.5 抗氧化酶活性測定

SOD活性測定采用氮藍(lán)四唑（NBT）法，以抑制NBT光化還原50%作為一個(gè)酶活性單位。選擇愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行POD活性測定，以每分鐘內(nèi)A470變化0.01的酶量為1個(gè)酶活性單位（U），以U/mg(protein)表示；過氧化氫酶（catalase,CAT）活性測定采用紫外吸收法，以每min內(nèi)A240減少0.1的酶量為1個(gè)酶活性單位（U），以U/mg(protein)表示[12]。

1.2.6 根系MDA含量測定

丙二醛（MDA）含量的測定采用李合生等的硫代巴比妥酸法，MDA含量以μmol/g表示[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫對半支蓮組培苗根系生長及植株表型的影響

隨著鹽脅迫濃度的增加，半支蓮組培苗的長勢減弱。由圖1可見，對照組根系生長濃密，根系發(fā)達(dá)，而鹽脅迫處理組培苗根系生長較對照組比較減弱，根系生長逐漸稀疏，表明隨著鹽脅迫濃度加大組培苗發(fā)根數(shù)目減少。

圖1 鹽脅迫對半支蓮組培苗生長的影響

由圖2可知，與對照組相比，50 mmol/L鹽脅迫下，半支蓮組培苗根系長度和生物量受抑制不明顯（p＞0.05）；而 100～250 mmol/L 鹽脅迫下，其生長明顯受抑制，其根系長度和單株根系生物量比對照降低40.1%～79.7%和39.4%～96.6%，鹽脅迫濃度與其根系長度和單株根系生物量呈高度負(fù)相關(guān)（R=-0.992 6，-0.977 3）。從莖的分支情況看，高濃度鹽分脅迫抑制半支蓮組培苗莖的分支。

圖2 鹽脅迫對半支蓮組培苗生長的影響

從圖1可以看出，對照組莖分支較多，莖干粗壯，表現(xiàn)出莖葉旺盛生長態(tài)勢，隨著鹽脅迫濃度加大，莖干生長減慢、分支減少、莖部色素積累在一定濃度范圍內(nèi)呈增加趨勢。當(dāng)鹽處理濃度為100、150 mmol/L時(shí)，與對照組相比莖部色素積累最為顯著，之后當(dāng)鹽濃度進(jìn)一步增高時(shí)，莖部色素的沉積又呈減少趨勢。

2.2 在鹽脅迫下可溶性蛋白和脯氨酸含量的變化

從圖3可以看出，當(dāng)鹽脅迫濃度為0～150 mmol/L時(shí)，蛋白含量顯著增加，如鹽濃度為50、100和150 mmol/L時(shí)，蛋白含量與對照組相比分別提高了44.6%、153.6%和400.2%。當(dāng)鹽濃度為200～250 mmol/L，根系中蛋白含量雖有下降趨勢，但與對照組相比，明顯偏高，增高幅度分別為285.8%和190.3%。由圖4可知，各組經(jīng)過鹽脅迫后的處理組中脯氨酸含量均高于對照組，這種趨勢與可溶性蛋白含量相類似。其增加的幅度依次為42.8%、99.6%、392.6%、235.8%和185.8%。當(dāng)鹽濃度達(dá)到150 mmol/L時(shí)，根系脯氨酸含量達(dá)到最大，為4.20 mg/g，之后鹽處理濃度進(jìn)一步升高，脯氨酸含量開始下降，但仍然顯著高于對照組。

圖3 鹽脅迫對半支蓮組培苗根系可溶性蛋白含量影響

圖4 鹽脅迫對半支蓮組培苗根系脯氨酸含量影響

2.3 抗氧化酶活性在鹽脅迫后樣品根系中的變化

與對照組相比，鹽脅迫下半支蓮組培苗根系SOD呈先上升后下降趨勢如圖5。當(dāng)鹽濃度為0～100 mmol/L時(shí)，SOD活性逐漸增加，如鹽濃度為50和100 mmol/L時(shí)，SOD活性逐漸增加，且為對照組的1.26～2.36倍；當(dāng)鹽濃度為150 mmol/L時(shí)，SOD活性仍高于對照組36.7%，但低于50～100 mmol/L鹽脅迫濃度處理；而當(dāng)鹽濃度為200和250 mmol/L時(shí)，SOD活性為對照組的62.20%和17.61%。從圖6中能夠看出：POD活性在鹽脅迫的根系樣品中呈現(xiàn)出先增后將的趨勢，當(dāng)鹽濃度為50和100 mmol/L時(shí)，POD活性為對照組的1.47～1.68倍，POD活性在這一區(qū)間呈上升趨勢，并且在100 mmol/L時(shí)POD活性最高；而當(dāng)鹽脅迫濃度為200和250 mmol/L時(shí)，其POD活性與對照組相比下降14.74%和38.88%如圖6。

圖5 鹽脅迫對半支蓮組培苗根系SOD活性的影響

圖6 鹽脅迫對半支蓮組培苗根系POD活性的影響

由圖7中顯現(xiàn)出的趨勢來看，CAT活性與鹽脅迫濃度相互關(guān)聯(lián)整體上也是呈先上升后下降趨勢。在100 mmol/L時(shí)，CAT活性達(dá)到最大，比對照組提高了60.11%，隨著鹽脅迫濃度的增加，CAT活性開始呈現(xiàn)下降走勢，但是在150 mmol/L時(shí)，CAT活性仍明顯高于對照組，鹽脅迫濃度進(jìn)一步增加都200和250 mmol/L時(shí)，其活性下降到對照組的80.20%和66.71%。

圖7 鹽脅迫對半支蓮組培苗根系CAT活性的影響

2.4 半支蓮組培苗根系MDA含量在鹽脅迫后的變化

丙二醛是膜質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物，植物體內(nèi)含量的變化趨勢在一定程度上能夠映射出植物在逆境脅迫后的損傷程度，其含量的多少代表了細(xì)胞膜脂過氧化水平，反應(yīng)了植物受脅迫程度的大小。與對照相比，鹽脅迫下半支蓮組培苗根系MDA含量呈明顯上升趨勢如圖8。鹽濃度為50 mmol/L時(shí)，MDA含量與對照組相比存在不顯著差異（p＞0.05）；在 100～250 mmol/L 鹽脅迫下，其MDA含量是對照組2.58～7.10倍。

圖8 鹽脅迫對半支蓮組培苗根系丙二醛含量的影響

3 討論

鹽分能夠在一定范圍內(nèi)通過影響組織器官間養(yǎng)分的輸送從而抑制個(gè)體植株形態(tài)的正常生長發(fā)育，其中根系是直接接觸土壤鹽漬環(huán)境的部位，也是植物對鹽漬響應(yīng)最敏感的器官[14]。本試驗(yàn)中半支蓮組培苗根系長度和根系生物量均隨著培養(yǎng)基鹽濃度的增加而下降，且與根系的生長指標(biāo)呈明顯的負(fù)相關(guān)性，這一結(jié)果表明根系的生長狀況能很好指示環(huán)境鹽分含量。從半支蓮組培苗莖色素分布來看，隨著鹽濃度的增加莖色澤加深。前期研究表明半支蓮細(xì)胞色素成分為甜菜紅素，活性氧作為植物體內(nèi)信號分子在誘導(dǎo)甜菜紅素的生物合成中起關(guān)鍵的調(diào)控作用[9]。在一定范圍鹽脅迫下，半支蓮莖干甜菜紅素合成增加，可能的機(jī)制是鹽脅迫誘導(dǎo)根系產(chǎn)生活性氧并將活性氧信號傳遞到莖干，誘導(dǎo)莖干合成甜菜紅素；另一方面甜菜紅素具有清除植物體活性氧功能，半支蓮在鹽脅迫下甜菜紅素合成增加用以清除活性氧，這是半支蓮對環(huán)境鹽脅迫的一種生理保護(hù)機(jī)制[15-16]。

細(xì)胞在鹽脅迫下可以通過積累一些物質(zhì)，如可溶性蛋白、脯氨酸等來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境間的水分平衡，通過適量調(diào)節(jié)內(nèi)環(huán)境中的滲透壓來達(dá)到保護(hù)細(xì)胞內(nèi)參與重要代謝活動(dòng)的酶類活性，從而在一定程度上使植物適應(yīng)鹽脅迫[17]。半支蓮組培苗根系中可溶性蛋白和脯氨酸含量與對照組相比，在一定范圍內(nèi)鹽濃度增加，其含量也增加，而當(dāng)鹽濃度增加到一定濃度后，這兩種物質(zhì)的含量則出現(xiàn)下降趨勢，但整體來看，含量仍明顯高于對照組。這一現(xiàn)象能夠反映出植物本身能夠在一定范圍內(nèi)調(diào)動(dòng)自身某些內(nèi)在物質(zhì)提高含量如可溶性蛋白來調(diào)節(jié)植物在受到外界環(huán)境因子脅迫時(shí)引發(fā)的內(nèi)環(huán)境滲透力改變所帶來的損傷，從而提高自身抗脅迫能力，但是一旦超過植物本身耐受力后就會(huì)對體內(nèi)某些重要活性物質(zhì)造成損害。有研究者認(rèn)為，植物在逆境條件下體內(nèi)某些正常蛋白合成往往受到抑制，同時(shí)誘導(dǎo)出一些新的蛋白或使原有蛋白含量明顯增加[18]。脯氨酸作為可迅速被植物利用的碳源和氮源，其代謝過程是C/N代謝和滲透調(diào)節(jié)的樞紐，脯氨酸積累可反映一定范圍內(nèi)鹽脅迫對植物的傷害程度，但是鹽脅迫強(qiáng)度過高也必然會(huì)影響其代謝過程[19]。

植物應(yīng)對外界逆境攻擊時(shí)，首先是植物的細(xì)胞膜遭到破壞。這一點(diǎn)在本試驗(yàn)的結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)，因受培養(yǎng)基中Nacl濃度的影響，半支蓮組培苗的根系細(xì)胞膜出現(xiàn)了不同程度的損傷。MDA含量的高低與植物受逆境傷害程度以及植物衰老息息相關(guān)[20]。在一定的脅迫強(qiáng)度內(nèi)，細(xì)胞的各種保護(hù)機(jī)制使MDA積累量有所增加，但維持在一定的水平，一旦超過植物細(xì)胞的承受能力時(shí)，細(xì)胞內(nèi)水平衡打破，汁液流出，出現(xiàn)代謝失調(diào)，自由基大量積累，膜脂過氧化程度加劇，從而引發(fā)MDA含量迅速升高，本試驗(yàn)也得到了相似的結(jié)論[21]。植物在鹽脅迫為了植物細(xì)胞在受到鹽脅迫時(shí)能夠保持正常的生長代謝活動(dòng)，植物本身首先會(huì)調(diào)動(dòng)體內(nèi)保護(hù)性酶(SOD、POD和CAT)，使其相互協(xié)調(diào)以降低體內(nèi)氧自由基水平，從而使體內(nèi)正常生長代謝得以維持[22]。這一點(diǎn)在半支蓮組培苗受到鹽脅迫后的SOD、POD和CAT活性酶的變化趨勢中（先升高后降低）能夠得到很好的印證，并且對三種酶活性檢測時(shí)也發(fā)現(xiàn)在同一鹽濃度（100 mmol/L）時(shí)，三種酶活均達(dá)到最高值，從而反映出在低鹽脅迫下各種抗氧化酶共同作用清除活性氧，而鹽脅迫濃度增高后三種酶活性均有所下降，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化程度加劇，最終導(dǎo)致植物生長抑制。

4 小結(jié)

綜合以上分析可知，鹽脅迫下半支蓮組培苗具有一定的耐鹽能力。在較低濃度鹽脅迫下，植株通過提高體內(nèi)抗氧化保護(hù)系統(tǒng)以及積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)并積累甜菜紅素共同抵御鹽分脅迫，但是當(dāng)鹽脅迫濃度，超出抗氧化系統(tǒng)可承受范圍后，鹽脅迫對植株的傷害也隨之加重，植株生長受阻，此時(shí)半支蓮根系仍會(huì)積累可溶性蛋白、脯氨酸和色素，用以減輕鹽分對其傷害。因此，可溶性蛋白和脯氨酸可作為半支蓮主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)大量積累，適當(dāng)提高半支蓮組培苗的耐鹽性。結(jié)合滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)與抗氧化酶系對鹽脅迫響應(yīng)的生理特性，以及綜合各項(xiàng)生理指標(biāo)的檢測結(jié)果，初步認(rèn)為半支蓮組培苗對鹽脅迫的耐性閾值范圍為100～150 mmol/L。