基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)苧麻根治療自然流產(chǎn)的作用機(jī)制

趙彩霞，張芬芬，程夢(mèng)迪，王 榮

（阜陽師范大學(xué) 胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 阜陽 236037）

近年來，在社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)壓力增加、生活環(huán)境污染、生活習(xí)慣改變、晚婚晚育等多種因素的影響下，自然流產(chǎn)的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年遞增的趨勢(shì)。自然流產(chǎn)不僅嚴(yán)重影響孕產(chǎn)婦的身心健康[1]，還會(huì)給家庭帶來深重創(chuàng)痛，嚴(yán)重影響家庭和睦，同時(shí)也會(huì)給社會(huì)穩(wěn)定帶來不安定的因素。因此，對(duì)于自然流產(chǎn)的發(fā)生及其機(jī)制的研究不僅對(duì)于維持女性健康妊娠極其重要，還具有積極的臨床意義和社會(huì)意義。中藥苧麻根為蕁麻科植物苧麻Boehmeria nivea（L.）Gaud.的根，有止血、安胎、清熱、利尿的功效[2]。臨床上，苧麻根以單味藥或復(fù)方入藥可治療多種疾病，如苧麻根對(duì)于妊娠胎動(dòng)、子宮出血、習(xí)慣性流產(chǎn)等具有顯著療效[3]，它是中醫(yī)治療這類疾病的常用藥。在我國民間常用苧麻原麻煮水供孕婦服用，以實(shí)現(xiàn)對(duì)自然流產(chǎn)的防治效果。由此推測(cè)，苧麻根治療自然流產(chǎn)不僅效果顯著，且用藥安全性也比較高[4]。雖然苧麻根入方劑治療各種流產(chǎn)由來已久，但這方面的研究甚少，且苧麻根治療流產(chǎn)的藥效成分及作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究擬通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析方法，來預(yù)測(cè)苧麻根治療流產(chǎn)的活性成分，相關(guān)的潛在蛋白靶點(diǎn)及其涉及的信號(hào)通路，并通過構(gòu)建苧麻根治療自然流產(chǎn)的活性成分-蛋白靶點(diǎn)-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)圖并對(duì)其可視化，以期為中藥多靶點(diǎn)治療疾病的機(jī)制提供方法學(xué)參考，并為進(jìn)一步研究苧麻根治療自然流產(chǎn)的作用機(jī)制提供思路。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 化學(xué)成分的收集及候選活性成分的篩選

使用 TCMSP平臺(tái)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php），并結(jié)合化學(xué)專業(yè)數(shù)據(jù)庫及BATMAN數(shù)據(jù)庫[5]收集已發(fā)現(xiàn)的苧麻根的所有化學(xué)成分；利用TCMSP數(shù)據(jù)庫計(jì)算這些化學(xué)成分的ADME（absorption、distribution、metabolism、excretion）值（指藥物在人體循環(huán)系統(tǒng)的吸收情況，并以ADME藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)評(píng)價(jià)藥物的口服吸收活性。），并對(duì)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）、類藥指數(shù)（drug-like index，DL）值進(jìn)行評(píng)估，選取 OB≥30%，DL≥0.18的化合物作為苧麻根候選活性成分[6]；并利用Pubchem數(shù)據(jù)庫[7]對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確認(rèn)，最后將其3D結(jié)構(gòu)保存為sdf格式。

1.2 保胎潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

利用Swiss TargetPrediction及STITCH數(shù)據(jù)庫[8]對(duì)苧麻根候選化合物潛在蛋白靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，然后將得到的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入到UniProt數(shù)據(jù)庫[9]中，篩選得到物種為人的相應(yīng)的基因靶點(diǎn)。然后利用 DiGSeE、GeneCards[10]、TTD 等數(shù)據(jù)庫[11]搜索已報(bào)道的與流產(chǎn)相關(guān)的基因，并搜索文獻(xiàn)驗(yàn)證，最后與苧麻根候選活性成分潛在的基因靶點(diǎn)匹配，得到苧麻根候選活性成分的保胎潛在靶點(diǎn)。

1.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建候選蛋白網(wǎng)絡(luò)互作圖，并對(duì)網(wǎng)絡(luò)的度（degree）進(jìn)行分析。

1.4 靶點(diǎn)的生物過程分析和代謝通路分析

使用 DAVID[12]，設(shè)定閾值p＜0.05，得到 GO（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）分析結(jié)果。

1.5 候選活性成分-保胎靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

使用Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建苧麻根候選活性成分-蛋白靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)以實(shí)現(xiàn)苧麻根治療自然流產(chǎn)的作用機(jī)制的可視化。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 苧麻根候選活性成分的獲取

收集到的已被發(fā)現(xiàn)的苧麻根化學(xué)成分共有27種，結(jié)果見表1。

表1 苧麻根化學(xué)成分

由表1根據(jù)OB值和DL值篩選得到苧麻根治療自然流產(chǎn)的活性成分有5種，分別是槲皮素、（+）-兒茶素、丁子香萜、β-谷甾醇和常春藤甙。

2.2 苧麻根治療自然流產(chǎn)的潛在靶點(diǎn)的預(yù)測(cè)

預(yù)測(cè)到苧麻根治療自然流產(chǎn)的相關(guān)基因靶點(diǎn)見表2和圖1。

表2 已報(bào)道的苧麻根與自然流產(chǎn)相關(guān)的基因

圖1 苧麻根候選活性成分潛在靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)圖

表2顯示，設(shè)置0.7的高置信度得到苧麻根候選活性成分治療自然流產(chǎn)的基因靶點(diǎn)共18個(gè)，包括凝血因子 II（F2）、白介素 6（IL-6）、缺氧誘導(dǎo)因子 1α亞基（HIF1A）和血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，THBD）等。圖1表示苧麻根候選活性成分的所有潛在基因靶點(diǎn)之間的互作網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)到苧麻根候選活性成分的潛在基因靶點(diǎn)共有183個(gè)，苧麻根候選活性成分治療自然流產(chǎn)的基因靶點(diǎn)在圖1中紅色標(biāo)示。

2.3 KEGG和GO分析

KEGG信號(hào)通路分析和GO功能分析結(jié)果見表3和圖2。

表3 苧麻根候選活性成分治療自然流產(chǎn)的信號(hào)通路

KEGG分析結(jié)果表明，苧麻根治療自然流產(chǎn)的相關(guān)信號(hào)通路主要有7條：糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、瘧疾、用于IgA生成的腸道免疫網(wǎng)絡(luò)、HIF-1信號(hào)通路、同種異體移植物排斥、補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)以及NF-κB信號(hào)通路。

圖2 苧麻根治療自然流產(chǎn)的相關(guān)基因靶點(diǎn)的KEGG分析和GO分析

2.4 苧麻根治療自然流產(chǎn)的候選活性成分-蛋白靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)

苧麻根治療自然流產(chǎn)的活性成分-蛋白靶點(diǎn)-信號(hào)通路的網(wǎng)絡(luò)圖見表4和圖3。

圖3中黃色節(jié)點(diǎn)代表苧麻根治療自然流產(chǎn)相關(guān)的5種候選活性成分，紅色節(jié)點(diǎn)代表18個(gè)苧麻根保胎潛在蛋白靶點(diǎn)，藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表苧麻根治療自然流產(chǎn)可能涉及的7條信號(hào)通路，邊代表它們之間的相互關(guān)聯(lián)。從圖中可以看出，槲皮素治療自然流產(chǎn)的潛在蛋白靶點(diǎn)最多，包括表4中除PRGR和P12R之外的16個(gè)靶點(diǎn)。從圖中可看出同一活性成分可對(duì)應(yīng)于不同的靶點(diǎn)，同一靶點(diǎn)也可對(duì)應(yīng)于不同的活性成分，這充分體現(xiàn)了苧麻根治療自然流產(chǎn)多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。

圖3 苧麻根治療自然流產(chǎn)的活性成分-蛋白靶點(diǎn)-信號(hào)通路圖

3 討論

對(duì)于藥物的研發(fā)和機(jī)制的研究不能僅從“單基因-單靶點(diǎn)-單疾病”的“還原論”思維模式進(jìn)行線性研究，更需要借鑒中醫(yī)藥的診療思路，從整體出發(fā)，從“多基因-多靶點(diǎn)-復(fù)雜疾病”模式著眼，尋求新的研究途徑[13]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)疾病的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)長(zhǎng)期、復(fù)雜的動(dòng)態(tài)過程，并認(rèn)為疾病的本質(zhì)是復(fù)雜生物網(wǎng)絡(luò)的失衡，中醫(yī)藥的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下構(gòu)建“系統(tǒng)”對(duì)“系統(tǒng)”的研究體系，很好的體現(xiàn)了中藥整體性觀念，即單味中藥各化學(xué)組分之間以及中藥與中藥之間治療疾病的協(xié)同作用。

自然流產(chǎn)的發(fā)病原因十分復(fù)雜，包括遺傳因素、解剖因素、內(nèi)分泌因素、感染因素、環(huán)境因素、免疫因素、血栓前狀態(tài)以及母體的全身性疾病等[14]，而前人的研究表明，苧麻根可以治療多種原因引起的流產(chǎn)，例如，苧麻根不僅適用于因血熱或跌打損傷、血瘀等引起的胎動(dòng)不安，還可用于一些病原體引起的胎產(chǎn)諸癥[15]。根據(jù)本研究預(yù)測(cè)到的苧麻根候選活性成分保胎主要涉及的7條信號(hào)通路來看，符合臨床上和報(bào)道中苧麻根可以治療多種原因所致流產(chǎn)的特點(diǎn)。例如，糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路是妊娠期糖尿病發(fā)病機(jī)制的起始和關(guān)鍵[16]；瘧疾信號(hào)通路與感染所致流產(chǎn)聯(lián)系緊密[17]；同種異體移植物排斥信號(hào)通路是免疫因素引起的自然流產(chǎn)、反復(fù)自然流產(chǎn)的發(fā)生的重要作用機(jī)制之一。另外，本研究預(yù)測(cè)到，在苧麻根中槲皮素對(duì)應(yīng)的治療自然流產(chǎn)的靶點(diǎn)最多，槲皮素是一種常見的黃酮類化合物，廣泛存在于多種蔬菜、水果等植物性食物中，它能夠穿過胎盤屏障，在胎兒體內(nèi)積聚。根據(jù)前人的研究，苧麻根中主要含有蒽醌、黃酮、有機(jī)酸類等成分，其原植物提取物具有抗氧化、止血、抗菌等作用[18]，其中，苧麻根黃酮苷對(duì)妊娠子宮具有抑制作用[19]，這提示槲皮素在苧麻根治療自然流產(chǎn)中具有重要作用，但并非此單一成分單獨(dú)發(fā)揮治療作用。

表4中，本研究中預(yù)測(cè)到的苧麻根候選活性成分治療自然流產(chǎn)的蛋白靶點(diǎn)CD40配體與其受體相互作用，誘導(dǎo)多種類型細(xì)胞產(chǎn)生促炎因子，如白介素 1（IL-1）、白介素 2（IL-2）、干擾素 γ（IFN-γ）等，在誘發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[20]。妊娠是母胎免疫耐受的特定狀態(tài)，一旦母胎界面免疫耐受出現(xiàn)紊亂，則會(huì)導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局，最常見的表現(xiàn)就是自然流產(chǎn)的發(fā)生。由此可見，免疫應(yīng)答在苧麻根治療自然流產(chǎn)過程中的重要作用。在人類妊娠早期，預(yù)測(cè)到的苧麻根治療自然流產(chǎn)的蛋白靶點(diǎn)孕酮受體被卵巢妊娠黃體產(chǎn)生的孕酮激活后，能夠通過調(diào)節(jié)母體免疫系統(tǒng)，為著床過程準(zhǔn)備子宮內(nèi)膜，維持子宮內(nèi)妊娠囊[21]。苧麻根候選活性成分治療自然流產(chǎn)的蛋白靶點(diǎn)組織因子（Tissue factor，TF）是凝血過程中外源性途徑的啟動(dòng)因子[22]，而流產(chǎn)發(fā)生時(shí)常見癥狀之一便是孕體出現(xiàn)不同程度的陰道流血，因此凝血過程在苧麻根治療自然流產(chǎn)時(shí)也發(fā)揮極其重要的作用。在流產(chǎn)發(fā)生時(shí)，HIF-1A在血清和絨毛中的低表達(dá)可能使滋養(yǎng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為侵入型，致使血管生成不足而導(dǎo)致胚胎死亡[23]，由此可見，苧麻根可以通過提高HIF-1α的表達(dá)水平來維持正常妊娠；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)對(duì)胚胎著床、胎盤發(fā)育、胎兒生長(zhǎng)等各個(gè)方面具有重要作用[24]。研究顯示，反復(fù)自然流產(chǎn)患者會(huì)出現(xiàn)PGI2的明顯缺乏，其和血栓素（TXA2）之間的平衡對(duì)妊娠結(jié)局有重要影響[25]；血栓調(diào)節(jié)蛋白（thrombomodulin，TRBM）普遍存在于血管內(nèi)皮細(xì)胞的表面，通過與凝血酶結(jié)合和激活蛋白C系統(tǒng)從而發(fā)揮抗凝作用，正常妊娠婦女體內(nèi)存在著逐漸加重的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TRBM逐漸增多，其發(fā)揮抗凝作用來對(duì)抗此時(shí)機(jī)體的高凝狀態(tài)從而維持妊娠[26]；正常妊娠過程中，胎盤和蛻膜的凋亡和增殖處于一種平衡狀態(tài)，一旦出現(xiàn)異常凋亡，打破這種平衡狀態(tài)，就可能導(dǎo)致病理妊娠的發(fā)生，Bax與BCL2的比值增高在自然流產(chǎn)蛻膜和絨毛組織細(xì)胞過度凋亡的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[27]，另外有研究表明，乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，ACES）在凋亡過程中也會(huì)大量表達(dá)[28]；細(xì)胞色素P450(acetylcholinesterase，CYP)是一組由結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的基因超家族編碼的同工酶組成的超家族酶系。細(xì)胞色素P450的同工酶3A4（CP3A4）是人體最重要的藥物代謝酶，它是參與口服藥物首過效應(yīng)的最重要的單體酶[29]。由此可以看出，苧麻根治療自然流產(chǎn)是通過免疫、凝血、凋亡，神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控等幾個(gè)方面進(jìn)行的（表4）。

臨床上對(duì)于自然流產(chǎn)的治療，西醫(yī)主要選擇臥床休息，或者補(bǔ)充黃體酮等藥物來輔助治療，治療途徑較為單一，效果不佳且長(zhǎng)期使用有致畸等副作用[30]。而中醫(yī)則從通過辨證論治，使用中藥復(fù)方進(jìn)行保胎，從保胎優(yōu)生角度來看，效果明顯優(yōu)于黃體酮[30-32]。其中，中藥苧麻根既可以食用，也可以入藥用，可以預(yù)測(cè)其保胎安全性比較高，所以對(duì)其保胎作用進(jìn)行研究，對(duì)于苧麻根的綜合開發(fā)利用以及自然流產(chǎn)的有效治療具有重要意義。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)到苧麻根治療自然流產(chǎn)相關(guān)的物質(zhì)基礎(chǔ)與作用機(jī)制，能夠?qū)恼w上研究苧麻根治療自然流產(chǎn)的作用機(jī)制有一定的參考價(jià)值，但由于此方法存在數(shù)據(jù)可能不完整，以及產(chǎn)生這些數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)的可靠性等諸多問題，所以要最終揭示苧麻根治療自然流產(chǎn)的分子機(jī)制還需要通過大量的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4 小結(jié)

苧麻根對(duì)于多種原因所致自然流產(chǎn)具有很好的保胎作用，本研究預(yù)測(cè)了苧麻根治療自然流產(chǎn)的候選活性成分和相應(yīng)的保胎蛋白靶點(diǎn)，以及保胎所涉及的信號(hào)通路，較為全面直觀地解釋了苧麻根治療自然流產(chǎn)的藥效基礎(chǔ)和作用機(jī)制，這對(duì)于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證、臨床保胎用藥以及苧麻根相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)具有一定的參考價(jià)值。