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    探針導向重組酶介導等溫擴增法檢測MTB rpoB基因突變的應(yīng)用價值

    2020-06-13 03:41:06李鑫娜申辛欣王瑞白段素霞張瑞卿王瑞歡白雪丁凡國豪王金榮高源陳子巍馬學軍
    中國防癆雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:突變型探針質(zhì)粒

    李鑫娜 申辛欣 王瑞白 段素霞 張瑞卿 王瑞歡 白雪丁 凡國豪 王金榮 高源 陳子巍 馬學軍

    利福平作為一線抗結(jié)核藥物,主要通過與細菌的RNA聚合酶的β亞單位結(jié)合,干擾細菌的RNA轉(zhuǎn)錄,從而發(fā)揮殺菌作用。編碼RNA聚合酶β亞單位的基因(rpoB基因)中有一段長81 bp的利福平耐藥決定區(qū)(rifampin resistance-determining region, RRDR;密碼子507~533,共27個氨基酸),超過95%的利福平耐藥MTB菌株在該區(qū)域內(nèi)發(fā)生突變,而密碼子516、526和531是最常見的突變位點[1]。

    目前,核酸檢測技術(shù)更迭迅速,使得MTB分子生物學藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)技術(shù)發(fā)展迅速,例如,聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法(PCR-SSCP)[2]、熒光定量PCR方法[3]、高分辨率熔解曲線法[4-5]、反向探針雜交方法[6]、基因芯片技術(shù)[7-8]等。這些方法和技術(shù)雖結(jié)果準確,但需要專業(yè)人員進行操作,且實驗對儀器設(shè)備依賴性較高,需要高精密儀器。重組酶介導等溫擴增法(recombinase aided amplification, RAA)是一種適合現(xiàn)場和基層的等溫核酸擴增方法。該方法操作簡便,可利用便攜式儀器快速進行病原微生物檢測[9-10]。筆者實驗室曾建立探針導向的重組酶介導的等溫擴增法(probe-directed recombinase amplification,PDRA),并成功應(yīng)用于5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)A1298C的單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點檢測[11]。本研究中,筆者擬探究采用PDRA方法檢測MTB的rpoB基因516位點突變的應(yīng)用價值。

    材料和方法

    1.菌株來源:6株MTB利福平耐藥菌株、35份MTB培養(yǎng)陽性的痰標本均來自中國疾病預防控制中心傳染病所結(jié)核病室。

    2.細菌基因組制備:采用十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)方法進行細菌基因組提取[12]。方法簡述如下:80 ℃滅活30 min,離心棄上清,菌體沉淀用400 μl TE緩沖液旋起,加入溶菌酶,37 ℃孵育16~20 h。加入10% 十二烷基硫酸鈉(SDS)/蛋白酶K混合液,65 ℃孵育10 min,加入氯化鈉(NaCl)和CTAB/NaCl混合液,65 ℃孵育10 min,加入氯仿/異戊醇混合液,離心并轉(zhuǎn)移上清,加入0.6倍體積異丙醇以沉淀DNA,-20 ℃放置30 min,離心棄上清,用1 ml 70%冰乙醇洗滌DNA沉淀;離心并且干燥,用TE緩沖液溶解DNA。

    3.標準質(zhì)粒制備:質(zhì)粒合成由北京擎科生物技術(shù)有限公司完成,包括1種野生型(TB-516-GAC,即TB-516-W)和3種516位點單點突變型(TB-516-GGC突變、TB-516-GTC突變、TB-516-TAC突變)。片段長度為960 bp的rpoB基因,其中包含81 bp 的RRDR決定區(qū)。

    4.儀器與試劑:RAA 熒光檢測儀QT-7200、RAA熒光基礎(chǔ)試劑盒均購自江蘇奇天基因生物科技有限公司,引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

    5.引物和探針設(shè)計:通過NCBI下載rpoB基因序列,在516位點附近設(shè)計探針和引物,避免出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)及形成引物二聚體。設(shè)計1條野生型探針、3條突變型探針、1條反向引物。探針長46~52個堿基,3′端采用C3-spacer阻斷,熒光基團和淬滅基團標記在中間相鄰近的T堿基上,突變點位于四氫呋喃(THF)的5′端。具體序列見表1。

    6.PDRA 擴增體系及條件:參照文獻[11],516位點常見突變包括3種類型(GGC、GTC、TAC),需配制4種反應(yīng)體系,分別檢測野生型及3種突變型。4種檢測體系的引物組成如下:TB-516-W檢測體系為P-W和R,TB-516-GGC檢測體系為P-GGC和R,TB-516-GTC檢測體系為P-GTC和R,TB-516-TAC檢測體系為P-TAC和R。以TB-516-W檢測體系為例,總體積50 μl,包括300 nmol/L正向探針(P-W),420 nmol/L反向引物(R)以及1×緩沖液。向裝有干粉的反應(yīng)管中加入上述混合液和2 μl模板DNA,并將2.5 μl醋酸鎂(280 mmol/L)加入管蓋內(nèi),蓋上管蓋,混勻離心使醋酸鎂進入擴增體系。其他檢測體系配制同上,只需進行探針替換即可。將上述反應(yīng)管放入QT-7200熒光檢測儀中,39 ℃反應(yīng)40 min,實時收集熒光。通過比較檢測樣品在4種反應(yīng)體系的擴增時間差異來判斷是否發(fā)生突變及突變類型。

    表1 PDRA方法的探針及引物

    注標注下劃線的堿基為516突變點

    圖1~4 PDRA方法特異度檢測。圖1為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝野生型質(zhì)粒情況,可見TB-516-W體系的陽性閾值時間早于其他體系。 圖2為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝 TB-516-GGC突變型質(zhì)粒情況,可見TB-516-GGC體系的陽性閾值時間早于其他體系的陽性閾值時間。圖3為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝 TB-516-GTC突變型質(zhì)粒情況,可見TB-516-GTC 體系的陽性閾值時間早于其他體系的陽性閾值時間。圖4為4種檢測體系分別擴增2×105拷貝 TB-516-TAC突變型質(zhì)粒情況,可見TB-516-TAC體系的陽性閾值時間明顯早于其他體系的陽性閾值時間

    圖5~8 PDRA方法敏感度檢測。圖5為TB-516-W體系檢測1010~103拷貝/μl野生型質(zhì)粒。圖6為TB-516-GGC體系檢測1010~103拷貝/μl TB-516-GGC突變型質(zhì)粒。圖7為TB-516-GTC體系檢測1010~103拷貝/μl TB-516-GTC突變型質(zhì)粒。圖8為TB-516-TAC體系檢測1010~103拷貝/μl TB-516-TAC突變型質(zhì)粒

    7.PDRA方法的特異度和敏感度檢測:4種類型的質(zhì)粒,包括一種野生型和3種突變型質(zhì)粒,作為模板進行特異度實驗;分別將質(zhì)粒10倍稀釋為1×1010~1×103拷貝/μl用以敏感度檢測實驗,以無核酶水作為陰性對照,重復3次獨立實驗并記錄實驗結(jié)果,以3次均可檢測出的最低拷貝數(shù)濃度作為檢測敏感度。

    8.方法測試:(1)菌株測試:對MTB利福平耐藥菌株,采用CTAB法提取基因組,經(jīng)PCR后進行測序[13],同時用本研究建立的檢測516位點的PDRA方法進行測試。(2)臨床標本測試:經(jīng)培養(yǎng)后的痰液臨床標本,采用CTAB法提取基因組,經(jīng)PCR后進行測序[13],并且進行516位點的PDRA方法測試。

    結(jié) 果

    1.PDRA方法特異度:通過4種檢測體系分別檢測4種不同類型的質(zhì)粒,只有檢測探針與檢測模板完全匹配的檢測體系,陽性閾值時間最早,相對熒光強度值最高;而其他擴增體系的陽性閾值時間滯后或者熒光值低。圖1~4顯示了4種檢測體系檢測2×105拷貝質(zhì)粒的情況。當檢測體系的探針與模板為相互對應(yīng)關(guān)系時,陽性閾值時間最早;當檢測體系的探針與模板不是對應(yīng)關(guān)系時,則表現(xiàn)為陽性閾值時間滯后。檢測體系TB-516-W、TB-516-GGC、TB-516-GTC和TB-516-TAC的陽性閾值時間差值分別為7.0、5.8、10.0、7.0 min。4種檢測體系穩(wěn)定,在檢測不同濃度的模板時,擁有相對穩(wěn)定的陽性閾值時間及時間差值。

    2.PDRA方法敏感度:4種檢測體系分別檢測對應(yīng)類型的質(zhì)粒DNA(1010~103拷貝/μl),從而確定PDRA方法的敏感度,如圖5~8所示,在40 min內(nèi),4種檢測體系的敏感度均可達到1000拷貝/μl。

    3.菌株測試結(jié)果:采用PDRA法及測序法檢測6株利福平耐藥MTB,6株MTB經(jīng)測序后發(fā)現(xiàn)有3株發(fā)生516位點突變,3株發(fā)生526位點突變,1株發(fā)生531位點突變,其中1株發(fā)生了雙位點突變(菌株T5),PDRA方法檢測各菌株516位點的結(jié)果與預期結(jié)果一致,可正確區(qū)分是否發(fā)生516位點突變,并且可確定516位點突變類型。具體表現(xiàn)為516位點突變的菌株,PDRA檢測結(jié)果顯示突變型體系陽性閾值時間早于野生型體系,而突變類型不同,則對應(yīng)體系的陽性閾值時間更早(圖9~11);而對于非516位點突變菌株,PDRA檢測結(jié)果顯示野生型體系的陽性閾值時間更早(圖12~14)。

    圖9~14 PDRA法及測序法檢測MTB菌株結(jié)果對比。圖9為MTB菌株HN05021(516-GGC突變)檢測結(jié)果。圖10為MTB菌株HeN05046(516-GTC突變)檢測結(jié)果。圖11為MTB菌株T5(516-TAC,526-GAC突變)檢測結(jié)果。圖12 為MTB菌株T7(516-W,526-TAC 突變)檢測結(jié)果。圖13為MTB菌株T4(516-W,526-CGC突變)檢測結(jié)果。圖14為MTB菌株FJ-14011(516-W,531-TTG突變)檢測結(jié)果

    4.臨床標本測試結(jié)果:35份痰標本,經(jīng)測序后確定有8份(22.9%)在rpoB基因RRDR決定區(qū)發(fā)現(xiàn)點突變,其中2份(5.7%)發(fā)現(xiàn)516位點突變(GGC、GTC),1份(2.9%)發(fā)現(xiàn)526位點突變,5份(14.3%)發(fā)現(xiàn)531位點突變。針對516位點的PDRA方法檢測標本的實驗結(jié)果與預期結(jié)果一致,可識別516位點有無突變,以及發(fā)生突變的類型。標本檢測結(jié)果示例見圖15~18,如圖15、16所示:2份516位點突變標本經(jīng)PDRA測試,表現(xiàn)為對應(yīng)的突變型體系陽性閾值時間早;如圖17、18所示: 531位點突變標本及野生型標本經(jīng)PDRA測試,表現(xiàn)為野生型體系的陽性閾值時間早。

    圖15~18 PDRA法及測序法檢測MTB培養(yǎng)陽性痰標本結(jié)果對比。圖15為標本181030(516-GGC突變)檢測情況。圖16為標本181076(516-GTC突變)檢測情況。圖17為標本181059(516-W,531-TTG突變)檢測情況。圖18為標本181034(野生型)檢測情況

    討 論

    本研究應(yīng)用PDRA法檢測MTB利福平耐藥基因rpoB基因的516突變位點,通過設(shè)計特異性探針識別單個堿基,利用單引物和單探針進行擴增,借助便攜熒光檢測儀判斷該位點是否發(fā)生突變。因rpoB基因516位點常出現(xiàn)3種突變類型(GGC、GTC、TAC),所以設(shè)計4條特異性探針(1條野生型探針和3條突變型探針)和1條共同的反向引物,建立4種平行檢測體系檢測模板,在恒溫39 ℃條件下反應(yīng)40 min,依據(jù)陽性閾值時間早晚進行516位點突變點識別。不同檢測體系在檢測相同模板時,陽性閾值時間不同,只有體系的探針與模板完全匹配時,其陽性閾值時間最早,相對熒光強度值最高;而體系的探針與模板不匹配時,則陽性閾值時間晚,熒光值低。通過4種體系檢測同一類型的重組質(zhì)粒,確定了該方法的特異度;通過系列稀釋的重組質(zhì)粒,確定了該方法的檢測敏感度為1000拷貝/μl。該方法與測序法同時檢測利福平耐藥菌株及痰標本, 所得結(jié)果一致。

    目前已有將RAA方法應(yīng)用于MTB和非結(jié)核分枝桿菌檢測的研究。陳淑丹等[14]應(yīng)用RAA方法檢測3種非結(jié)核分枝桿菌(海分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和堪薩斯分枝桿菌),檢測下限可達1000拷貝/μl質(zhì)粒DNA。陳斌等[15]應(yīng)用RAA方法檢測MTB,最低敏感度為0.043 ng/μl MTB基因組DNA,與其他呼吸道病原菌無交叉反應(yīng)。兩項研究側(cè)重于病原體的定性檢測,不涉及耐藥突變位點的檢測。而本研究的側(cè)重點是已知MTB感染的前提下,進行MTB利福平耐藥基因突變位點檢測。在PDRA檢測體系優(yōu)化過程中,筆者借鑒等位基因特異性PCR(AS-PCR)的3′端錯配原則,在探針的突變位點的5′方向加入人為錯配堿基,但檢測結(jié)果與預期相反,其區(qū)分度反而下降。分析可能的原因是RAA的擴增原理與PCR的擴增原理不同:RAA體系主要依賴重組酶與引物或探針形成核酸蛋白復合物,掃描模板,找到同源序列后可解開雙鏈,啟動延伸反應(yīng);而PCR則是通過溫度循環(huán)保證擴增反應(yīng)(變性-退火-延伸)順利進行。在RAA體系里,序列同源性是非常重要的,引入人為錯配堿基,降低了同源性比例,反而降低了探針的特異度。筆者曾嘗試加入甜菜堿來提高特異度,但實驗結(jié)果表明,加入甜菜堿后在某些檢測體系(TB-516-GTC)中表現(xiàn)為促進作用,而某些檢測體系(TB-516-GGC)則表現(xiàn)為抑制作用。這種拮抗作用的具體機制未明。為了保證檢測體系的一致性。本次研究選擇不加甜菜堿。

    綜上,本研究建立了一種檢測MTB利福平耐藥rpoB基因516突變位點的等溫核酸擴增方法,該方法具有以下特點:(1)39 ℃恒溫反應(yīng),無需精密PCR儀,只需一臺便攜式熒光檢測儀;(2)檢測快速,檢測可在40 min內(nèi)完成;(3)閉管操作,不易造成交叉污染;(4)檢測結(jié)果通過熒光曲線有無及陽性閾值時間進行判定,直觀易判斷。本研究作為一個初步研究,證明PDRA方法可以應(yīng)用于MTB利福平耐藥基因位點突變的檢測。但本研究也存在一些不足:造成利福平耐藥的常見rpoB基因突變類型有3種,包括531位點、526位點及516位點[1],而筆者本次研究只建立了針對516位點的PDRA檢測方法,后續(xù)還將進一步補充526、531位點的PDRA檢測方法,并收集更多的測試標本完成方法學評估。

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