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    豬TNNC1基因和TNNC2基因在 肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)研究

    2020-06-12 11:45:17楊冠青劉娟楊陽蔡春波趙燕郭曉紅曹果清
    國外畜牧學(xué)·豬與禽 2020年5期
    關(guān)鍵詞:基因表達(dá)骨骼肌

    楊冠青 劉娟 楊陽 蔡春波 趙燕 郭曉紅 曹果清

    摘? 要:為了探明肌鈣蛋白不同亞型在肌纖維增殖與類型轉(zhuǎn)變上的作用和分子機(jī)理,本研究采用熒光定量PCR技術(shù)檢測了TNNC1基因和TNNC2基因在25日齡、70日齡和150日齡三個生長階段的大白豬和山西黑豬的背最長肌、腰肌和股肌中的表達(dá)變化。結(jié)果表明:這兩種基因在大白豬和山西黑豬的三種肌肉組織中均有表達(dá),但存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異。TNNC1基因在大白豬的背最長肌和腰肌中的表達(dá)存在相似的變化趨勢。在大白豬上,TNNC1基因在25日齡時的背最長肌和腰肌中表達(dá)量最高,在150日齡時的表達(dá)量降到最低水平;在山西黑豬上,TNNC1基因在25日齡時的股肌組織中表達(dá)量較低,而在70日齡時的腰肌、70日齡時的股肌組織、150日齡時的股肌組織中表達(dá)量最高。在大白豬上,TNNC2基因在25日齡時的背最長肌和150日齡時的股肌中表達(dá)量較高;在山西黑豬上,TNNC2基因在70日齡時的腰肌和股肌中表達(dá)量較高。說明TNNC1基因與TNNC2基因在肌纖維發(fā)育與分化過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用,可作為檢測肌纖維類型的分子標(biāo)記,為探索豬的肌肉發(fā)育和改善肉品質(zhì)的研究提供理論參考。

    關(guān)鍵詞:豬;肌鈣蛋白C亞型1;肌鈣蛋白C亞型2;骨骼肌;基因表達(dá)

    肉豬生產(chǎn)是我國畜牧業(yè)的中堅(jiān)產(chǎn)業(yè),加快肉豬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展對推進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展、增加農(nóng)民收入以及推動社會進(jìn)步有著重要的影響。我國的肉豬出欄量居世界之首,但生豬生產(chǎn)力還處于比較低的水平。近年來,隨著人們生活水平的不斷提高,消費(fèi)者對豬肉的品質(zhì)及風(fēng)味的要求也越來越高。畜禽肉品質(zhì)的評價指標(biāo)包括嫩度、色澤、風(fēng)味及多汁性等。消費(fèi)者一直把嫩度作為肉質(zhì)評價最主要的指標(biāo)[1]。嫩度以切割肌纖維阻力的大小來判斷。影響肉質(zhì)嫩度的因素有很多,如肌纖維的直徑、肉品質(zhì)、飼喂方式、胴體的儲存方式以及胴體不同部位的組織等[2-3]。

    肌鈣蛋白(Troponin,Tn)為鈣離子結(jié)合蛋白多基因家族的成員,在細(xì)胞器轉(zhuǎn)運(yùn)和肌肉收縮等多個細(xì)胞進(jìn)程中都起著關(guān)鍵作用。肌鈣蛋白能夠抑制Ca2+濃度,與肌球蛋白共同調(diào)節(jié)鈣離子對肌動蛋白ATP酶的活性。肌鈣蛋白有3個亞單位,即肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I以及肌鈣蛋白T[4]。脊椎動物有兩種亞型的肌鈣蛋白:慢收縮亞型[Troponin C type 1 (slow),TNNC1]和快收縮亞型[Troponin C type 2 (fast),TNNC2][5]。TNNC2表達(dá)于快收縮骨骼肌,而TNNC1表達(dá)于慢收縮骨骼肌和心肌[6]。TNNC2被鈣離子激活于N-末端的低親和力鈣離子結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和高親和力鈣離子結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ,而TNNC1僅在高親和力的鈣離子結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ處與鈣離子結(jié)合[7]。田興國通過RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)TNNC2基因僅在豬的骨骼?。ㄈ珉哦^肌、股四頭肌和背最長?。┲斜磉_(dá),在其他組織中不表達(dá)或者低水平表達(dá),該基因?qū)趋兰〉纳L、成肌細(xì)胞的分化以及肌肉的收縮起著重要的作用[8]。

    新山西黑豬是由馬身豬、內(nèi)江豬、巴克夏豬和杜洛克豬經(jīng)復(fù)雜的雜交選育而育成的品種,與大白豬、長白豬和杜洛克豬等國外品種相比,具有產(chǎn)仔數(shù)多、肉品質(zhì)好以及抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。本研究選擇25日齡、70日齡和150日齡三個不同生長階段的大白豬和山西黑豬為研究對象,采用qPCR技術(shù)分析TNNC1基因和TNNC2基因在兩個豬種的肌肉組織中的表達(dá)差異,為研究豬肌肉發(fā)育的分子機(jī)理提供理論參考。

    1? 材料

    1.1 試驗(yàn)動物

    本研究以大白豬和新山西黑豬為試驗(yàn)動物,試驗(yàn)豬統(tǒng)一飼養(yǎng)于山西省鄉(xiāng)寧縣永新康生態(tài)養(yǎng)殖有限公司。

    1.2 主要試驗(yàn)儀器

    Mx 7500P 實(shí)時熒光定量PCR儀(美國Stratagene公司),PCR擴(kuò)增儀(型號:AB9902,美國BIO-RAD公司),超凈工作臺(型號:BCM-1000,蘇州安泰公司),ND-1000微量核酸蛋白測定儀(美國),MLS-3020高溫全自動蒸汽滅菌器(型號:MLS-3020,日本三洋公司),HERMLET 10型勻漿機(jī)(美國),微型臺式冷凍離心機(jī)(型號:Z233MK-2,德國);DYY-6C型電泳儀(北京),凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司),制冰機(jī)(型號:SIM-F124,日本三洋公司),超低溫冰箱(型號:FOMA700,美國)。

    1.3 主要試驗(yàn)試劑

    Trizol(美國);cDNA第一鏈合成試劑盒:PrimeScript? RT-PCR Kit(Takara公司);實(shí)時熒光定量PCR試劑盒:SYBR? PremixEx Taq? II Kit(日本Takara公司)。乙醇和異戊醇等常規(guī)生化試劑均為分析純。

    2? 方法

    2.1 樣本采集

    分別在試驗(yàn)豬25日齡(斷奶)、70日齡(保育期結(jié)束)和150日齡(快速生長期)各屠宰4頭豬(公豬和母豬各2頭),摘取背最長肌、腰肌和股肌的肌肉組織,放入液氮中保存待用。

    2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

    根據(jù)NCBI genbank中豬TNNC1基因和TNNC2基因的mRNA信息,以18S為內(nèi)參基因,應(yīng)用Primer 5以及Oligo等軟件設(shè)計(jì)引物,引物委托上海生物工程有限公司合成。引物序列見表1。

    2.3 qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化

    根據(jù)SYBR? PrimeScript? RT-PCR Kit試劑盒說明書建議的反應(yīng)條件,以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA進(jìn)行常規(guī)梯度PCR擴(kuò)增,分別篩選內(nèi)參基因和目的基因引物的最佳退火溫度和cDNA模板濃度,確定引物退火溫度后進(jìn)行實(shí)時PCR檢測相應(yīng)引物擴(kuò)增熔解曲線、目的基因和內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率。

    2.4 數(shù)據(jù)處理

    將RT-PCR所得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入到EXCEL表格中,采用2-ΔΔCt法計(jì)算每個基因的相對表達(dá)量,使用SPSS 統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析,同一品種不同組織或不同時間點(diǎn)之間的基因表達(dá)差異采用單因素方差分析,選用鄧肯法進(jìn)行多重比較;不同品種同一組織的基因表達(dá)變化采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行。使用GraphPad軟件繪制圖表。

    3? 結(jié)果

    3.1 實(shí)時熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳檢測

    對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后,電泳圖中的條帶整齊,無拖尾現(xiàn)象,長度符合,證明所提取的RNA具有高度的完整性與穩(wěn)定性,可用于后續(xù)的試驗(yàn)操作,結(jié)果如圖1所示。

    3.2 TNNC1基因在兩豬種肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)檢測結(jié)果

    圖2為TNNC1基因在三個不同日齡大白豬和山西黑豬中的表達(dá)趨勢檢測結(jié)果。試驗(yàn)中,以25日齡大白豬腰肌中TNNC1基因的表達(dá)值作為對照,采用2—ΔΔCt方法計(jì)算該基因在不同日齡的豬的三種肌肉組織中的相對表達(dá)量。

    圖2中“①圖”顯示了TNNC1基因在背最長肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知,TNNC1基因在大白豬背最長肌中的表達(dá)量隨豬日齡的增大呈下降趨勢,在山西黑豬中的表達(dá)量呈現(xiàn)較穩(wěn)定的趨勢。在大白豬上,TNNC1基因在25日齡的表達(dá)量極顯著高于70日齡和150日齡的,150日齡的表達(dá)量最低,極顯著低于70日齡的(P<0.01)。TNNC1基因在25日齡和70日齡的大白豬中的表達(dá)量極顯著高于山西黑豬的,但在150日齡,山西黑豬的表達(dá)量顯著高于大白豬的。

    圖2中“②圖”顯示了TNNC1基因在腰肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知,TNNC1基因在大白豬腰肌中的表達(dá)量隨豬日齡的增長呈下降趨勢,在山西黑豬上的表達(dá)趨勢為先增后減。在大白豬上,TNNC1基因的表達(dá)趨勢與背最長肌的表達(dá)趨勢一致,25日齡最高,70日齡次之,150日齡最低;在山西黑豬上,TNNC1基因在70日齡的表達(dá)量極顯著高于25日齡和150日齡的(P<0.01)。25日齡時,TNNC1基因在大白豬上的表達(dá)量顯著高于山西黑豬的;而在生長后期(70日齡和150日齡),該基因在山西黑豬上的表達(dá)量極顯著高于大白豬的(P<0.01)。

    圖2中“③圖”顯示了TNNC1基因在股肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知,在大白豬上,TNNC1基因在豬生長的中前期高水平表達(dá),150上日齡時的表達(dá)量極顯著下降;然而,在山西黑豬上,TNNC1基因的表達(dá)情況則相反,在豬生長前期(25日齡)表達(dá)量極顯著低于70日齡和? ? ? ? 150日齡時的。在三個采樣點(diǎn)比較兩個豬種的TNNC1基因的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn),試驗(yàn)豬? 25日齡時,該基因在山西黑豬上的表達(dá)量顯著低于在大白豬上的(P<0.01);70日齡時,該基因在兩豬種股肌中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05);150日齡時,該基因在山西黑豬上的表達(dá)量顯著高于在大白豬上的(P<0.05)。

    3.3 TNNC2基因在兩豬種肌肉組織中的發(fā)育性表達(dá)檢測結(jié)果

    圖3為TNNC2基因在三個不同日齡大白豬和山西黑豬的表達(dá)趨勢檢測結(jié)果。試驗(yàn)中,以25日齡大白豬腰肌中TNNC2基因的表達(dá)值作為對照,采用2—ΔΔCt方法計(jì)算該基因在不同日齡的豬的三種肌肉組織中的相對表達(dá)量。

    圖3中“①圖”顯示了TNNC2基因在豬背最長肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知,TNNC2基因在大白豬背最長肌中的表達(dá)量隨豬日齡的增長呈下降趨勢,在山西黑豬上的表達(dá)趨勢為生長前期(25日齡和70日齡)的表達(dá)量極顯著低于生長后期(150日齡)的。在大白豬上,TNNC2基因在25日齡時的表達(dá)量最高,極顯著高于70日齡和150日齡時的,其中150日齡時的表達(dá)量最低,且極顯著低于70日齡時的(P<0.01)。TNNC2基因在25日齡和70日齡時的大白豬的表達(dá)量極顯著高于山西黑豬的,但150日齡時在山西黑豬上的表達(dá)量高于大白豬的。

    圖3中“②圖”顯示了TNNC2基因在豬腰肌中的相對表達(dá)檢測結(jié)果。由該圖可知,TNNC2基因在大白豬腰肌中的表達(dá)呈現(xiàn)比較穩(wěn)定的趨勢,在山西黑豬上的表達(dá)呈先增后減的趨勢。在大白豬上,TNNC2基因的表達(dá)量在25日齡時達(dá)到最高水平,在? ? ?70日齡和150日齡時較低;在山西黑豬上,TNNC2基因在70日齡時的表達(dá)量極顯著高于25日齡和150日齡時的(P<0.01)。25日齡時,TNNC2基因在大白豬上的表達(dá)量顯著高于在山西黑豬上的,而在豬生長中后期(70日齡和150日齡),TNNC2基因的表達(dá)情況轉(zhuǎn)變?yōu)樵谏轿骱谪i上的表達(dá)極顯著高于在大白豬上的(P<0.01)。

    圖3中“③圖”顯示了TNNC2基因在豬股肌中的相對表達(dá)量檢測結(jié)果。由該圖可知,在大白豬上,TNNC2基因在豬生長的中前期(25日齡和70日齡)呈現(xiàn)低水平表達(dá),而在150日齡時表達(dá)量極顯著升高;在山西黑豬上,該基因在豬生長前期? ? ? ? (25日齡)的表達(dá)量極顯著低于70日齡和150日齡時的。在三個采樣點(diǎn)比較TNNC2基因在兩個豬種上的表達(dá)量后發(fā)現(xiàn):25日齡時,該基因在大白豬上的表達(dá)量顯著高于在山西黑豬上的(P<0.01);而70日齡時,該基因在大白豬上的表達(dá)量極顯著低于在山西黑豬上的;150日齡時,該基因在大白豬和山西黑豬的股肌中的表達(dá)量無顯著差異(P>0.05)。

    4? 討論與結(jié)論

    早期研究表明TNNC1基因僅在心肌和慢收縮性的骨骼肌中表達(dá),而TNNC2基因只存在快速收縮性骨骼肌中[9]。但是,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TNNC1基因在不同豬種各年齡段的不同肌肉組織中均有表達(dá),但在腰肌中的表達(dá)量最高,股肌中的最低,說明腰肌含有較高水平的慢肌纖維,而股肌含有較小比例的慢肌纖維。Parmacek和Leiden的研究表明,豬TNNC1基因只在慢肌和心肌中表達(dá),不會在腦、肺、肝、腎或者睪丸中表達(dá)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)豬TNNC1基因在背最長肌、腰肌與股肌中的表達(dá)趨勢存在差異,表明TNNC1可作為檢測不同類型肌纖維的分子標(biāo)志。

    TNNC2基因能夠促進(jìn)豬的肌細(xì)胞分化和骨骼肌生長[6],被普遍認(rèn)為是肉質(zhì)性狀的潛在候選基因[11]。TNNC2基因的等位基因T能顯著影響豬肉的嫩度和大理石紋,建議將等位基因T作為選育的分子標(biāo)記應(yīng)用于豬的肉質(zhì)選育。由于TNNC2基因通常不在心室肌細(xì)胞中表達(dá),但在一些疾病中能夠檢測到該基因的異常表達(dá),因此可將TNNC2基因作為心臟疾病預(yù)測的標(biāo)記[12]。在無脊椎動物中,肌鈣蛋白在肝臟、胰臟、坐骨神經(jīng)、肺和眼等多個組織器官中均有表達(dá)[13]。對藍(lán)塘豬和杜洛克豬肌鈣蛋白C進(jìn)行半定量分析發(fā)現(xiàn)該基因只在眼肌、肱二頭肌和股四頭肌中表達(dá)[14]。在本研究中,TNNC2基因在豬的背最長肌、腰肌和股肌中均有表達(dá),而且在大白豬的背最長肌和山西黑豬的腰肌中表達(dá)量最高,這與田興國等的研究結(jié)果不一致[14]。

    本試驗(yàn)分析了TNNC1基因和TNNC2基因在不同日齡的大白豬和山西黑豬的三種肌肉組織中的表達(dá)差異,結(jié)果表明這兩個基因在不同肌肉中的表達(dá)量上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的極顯著差異,因此它們可作為檢測肌纖維類型的分子標(biāo)記,為探索豬的肌肉發(fā)育和改善肉品質(zhì)的研究提供理論參考。

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