2型豬鏈球菌河南株的生物學(xué)特性研究

王治方，徐引弟，張青嫻，朱文豪，焦文強，李海利，許 峰，王克領(lǐng)，張 彬，婁治國

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南 鄭州 450002；2.河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南 鄭州 450002）

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌引起的一類急性、熱性傳染性疾病，屬于國家規(guī)定的二類動物傳染病，臨床上主要引起豬的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎等病癥，是世界范圍內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)最常見的細菌性疾病之一[1]。

豬鏈球菌血清型較多，基于豬鏈球菌莢膜多糖抗原的不同，豬鏈球菌一度被分為35個血清型，分別是1～34和1/2型。2005年，Hill等[2]進一步驗證，32型和34型并不是豬鏈球菌，豬鏈球菌劃分為 33個血清型（1/2型、1～31型、33型）；而有最新的研究報告指出，血清型20型、22型、26型和33型屬于其他新的物種，應(yīng)該從豬鏈球菌中分離出來[3]。因此，目前認(rèn)為豬鏈球菌有29個血清型，其中豬鏈球菌2型毒力最強、流行最廣，能夠引起人類的感染發(fā)病和死亡，是國內(nèi)防控豬鏈球菌病的主要血清型之一，在畜牧業(yè)和公共衛(wèi)生方面意義重大。

近年來，隨著我國養(yǎng)豬業(yè)集約、規(guī)模化的發(fā)展，豬鏈球菌病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢，而且經(jīng)常作為主要病原繼發(fā)于豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬圓環(huán)病毒病等病毒性疾病，給豬場臨床疾病診療控制帶來不小的困難，給養(yǎng)豬企業(yè)造成不小的經(jīng)濟損失。試驗于2019年5—8月在河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所動物傳染病研究室進行，通過對河南省豫東某規(guī)?；i場疑似豬鏈球菌病例采集病料，進行實驗室的分離純化、病原及血清型鑒定為2型豬鏈球菌，同時對該株豬鏈球菌做了動物試驗、藥敏試驗、毒力基因和耐藥基因檢測研究，旨在為2型豬鏈球菌病的防控提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 病料

2019年5月河南省豫東某規(guī)?；i場保育豬群發(fā)生呼吸困難、關(guān)節(jié)腫大，部分豬只有神經(jīng)癥狀的病例，剖檢瀕死期病豬，采集腦、肺臟、肝臟、血液和關(guān)節(jié)液等病料。

1.2 主要試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）和胰蛋白大豆肉湯（TSB）購自美國Difco公司；新生牛血清購自鄭州益康生物工程有限公司；革蘭氏染液試劑盒購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；抗生素藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司；微生物微量生化鑒定管購自杭州天和微生物試劑有限公司；微生物DNA提取試劑盒、DL 2 000 DNA Marker、Lording buffer、2×Taq Master Mix等均購自寶生物（大連）工程有限公司；相關(guān)引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 試驗動物

體重20 g左右的健康小白鼠5只，購自鄭州大學(xué)實驗動物中心。

2 方法

2.1 病原的分離、純化

無菌采集的腦、肺臟、肝臟、血液和關(guān)節(jié)液分別劃線接種于TSA平板（含5%的新生牛血清），放置于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18～24 h后，挑選可疑菌落純化、革蘭氏染色鏡檢。

2.2 可疑菌PCR檢測和血清型檢測鑒定

2.2.1 引物設(shè)計 通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）對純化好的可疑菌株進行鑒定和血清型分型鑒定。參照文獻[4-6]設(shè)計合成豬鏈球菌通用引物和33種血清型引物，引物序列和擴增片段長度見表1。

表1 豬鏈球菌PCR分型引物序列及相關(guān)信息

表1 豬鏈球菌PCR分型引物序列及相關(guān)信息（續(xù)）

2.2.2 PCR檢測鑒定 DNA提?。喝∩鲜鯰SB液體培養(yǎng)物1 mL于離心管中，10 000 r/min離心5 min，棄上清液收集菌體沉淀；按照DNA提取試劑盒說明書提取菌體DNA，以提取可疑菌的DNA為模板，進行PCR擴增鑒定。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 13 μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 8 μL，模板 DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72 ℃30 s，40個循環(huán)；72℃延伸5 min；4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

電泳：取10 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測，紫外透射分析儀觀察結(jié)果，比照DL 2 000 DNA Marker確定條帶大小。陽性PCR擴增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序，測序結(jié)果進行BLAST軟件比對。

2.3 毒力基因檢測

2.3.1 引物設(shè)計 參考文獻[7-9]設(shè)計合成了3對豬鏈球菌毒力基因（胞外因子epf基因、溶血素sly基因、溶菌酶釋放蛋白mrp基因）引物，各對引物序列和擴增片段長度見表2。

表2 毒力基因引物序列及相關(guān)信息

2.3.2 DNA提取及毒力基因檢測 DNA提取方法同上述2.2.2。

PCR 反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq Master Mix 13 μL，上、下游引物各 1 μL，ddH2O 8 μL，模板 DNA 2 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，進入循環(huán)：95℃1 min，57℃ 1 min，72℃ 30 s，共35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存?zhèn)溆?。電泳：?0 μL PCR擴增產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測，紫外透射分析儀觀察結(jié)果，比照DL 2 000 DNA Marker確定條帶大小。

2.4 致病性試驗

挑選純化好的單個菌落接種于TSB（含5%的新生牛血清）液體培養(yǎng)基中，放置于培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)18 h后，計數(shù)并用生理鹽水稀釋菌數(shù)約為1×108CFU/mL，腹腔注射小白鼠3只，0.2 mL/只，作為試驗組；同時準(zhǔn)備小白鼠2只腹腔注射生理鹽水0.2 mL/只，作為空白對照組。接種后觀察記錄每組發(fā)病情況，并對發(fā)病小鼠進行細菌分離鑒定。

2.5 藥物敏感性試驗

藥敏試驗采用瓊脂擴散法（K-B法）[10-12]。挑取已純化過的TSA平板上若干單個菌落，置于0.9%滅菌生理鹽水中，制成菌懸液，濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬ū壬珒x比色），取200 μL用滅菌棉拭子均勻涂抹于TSA平板（含5%的新生牛血清）上，涂抹4個平板。挑取臨床上常用的抗生素藥敏片，用滅菌鑷子把藥敏片均勻貼在涂有菌液的平板上，于37℃培養(yǎng)24 h，取出觀察記錄藥敏片抑菌圈直徑，判斷標(biāo)準(zhǔn)參照美國臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會（NCCLS）2005版。

2.6 耐藥基因檢測

2.6.1 引物設(shè)計 參考文獻[13-15]，設(shè)計5大類24個耐藥基因包括β-內(nèi)酰胺類（blaTEM、blaOXA-1、blaCTX-M-2、blaSHV、blaIMP-1、blaDHA-1）、氨基糖甙類[aadA1、aadA2、strA、strB、aadB、aacC2、aac(3)-IV、aphA1]、四環(huán)素類[tet(A)、tet(B)、tet(C)、tet(D)、tet(G)]、喹諾酮類（gyrA、parC） 和磺胺類（sul1、sul2、sul3）基因的引物，用于本菌株的耐藥基因的檢測擴增，5大類24對耐藥基因引物序列及相關(guān)信息見表3。

2.6.2 耐藥基因PCR擴增 模板DNA的提取方法同上述2.2.2。用表3中24對耐藥基因的引物進行擴增檢測。

反應(yīng)體系為 25 μL：2×Taq Mix 12.5 μL，10 μM/L 上下游引物各 1 μL，模板 DNA 1 μL，加ddH2O 至25 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性 5 min，進入循環(huán)：95℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共 35個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物4℃保存。取10 μL擴增產(chǎn)物電泳，紫外光下觀察結(jié)果，陽性產(chǎn)物測序。

表3 不同種類抗生素耐藥基因的引物序列及相關(guān)信息

3 結(jié)果

3.1 細菌分離培養(yǎng)純化

在接種病死豬腦組織的TSA平板（含5%的新生牛血清）上，形成均一的表面光滑濕潤、邊緣整齊、圓形的半透明、略帶藍色熒光的小菌落；其他樣品接種的TSA平板（含5%的新生牛血清）上未見可疑細菌生長。挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢為革蘭氏陽性，菌體呈球形或卵圓形，呈單個、成對或短鏈存在（圖1）。

3.2 菌株鑒定和血清型檢測

通過用豬鏈球菌通用引物對分離菌株進行PCR鑒定，結(jié)果分離菌株和豬鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株均在500～750 bp之間的689 bp出現(xiàn)目的條帶（圖2），與預(yù)期片段一致。

通過用33對豬鏈球菌血清型引物對分離菌株進行血清型分型鑒定，結(jié)果分離菌株在豬鏈球菌2型引物擴增陽性，出現(xiàn)目的條帶557 bp（圖3、圖4），測序與豬鏈球菌LSM102株（GenBank No.:CP016175.1）99%同源，證明所分離菌株為血清型2型豬鏈球菌。

3.3 毒力基因

用3對毒力基因引物對分離菌株進行PCR擴增檢測，結(jié)果分別擴增出626 bp、885 bp、1 502 bp大小3個片段，結(jié)果見圖5，證明該豬鏈球菌分離菌株攜帶有胞外因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）和溶血素（sly）毒力基因。

3.4 致病性試驗結(jié)果

在攻毒15 h后，試驗組3只小白鼠相繼發(fā)病，先后出現(xiàn)轉(zhuǎn)圈、共濟失調(diào)及抽搐等癥狀，攻毒24 h后試驗組3只小白鼠相繼死亡，立即剖檢用心血、肝臟觸片，革蘭氏染色鏡檢，均發(fā)現(xiàn)有革蘭氏陽性球菌，呈單個、短鏈狀排列。同時無菌采集試驗組死亡小白鼠的心血、肝臟接種TSA平板（含5%的新生牛血清，1/10萬的NAD），37℃培養(yǎng)18 h后，經(jīng)鑒定，均獲得和接種菌株相一致的單一細菌。攻毒48 h后，對照組健康，未見任何臨床癥狀。

3.5 藥敏結(jié)果

挑選5類18種抗生素對豬鏈球菌分離菌株作了藥物敏感性試驗，參照藥敏片說明書判斷敏感性，結(jié)果見表4。藥敏結(jié)果顯示，該株豬鏈球菌對β-內(nèi)酰胺類（頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素）、喹諾酮類（左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星）、磺胺類（復(fù)方新諾明）和氨基糖苷類的壯觀霉素敏感；對氨基糖苷類（卡那霉素、阿米卡星）、大環(huán)內(nèi)酯類（阿奇霉素、替米考星）和四環(huán)素類（強力霉素、四環(huán)素、土霉素）耐藥。

表4 藥敏試驗結(jié)果

3.6 耐藥基因檢測

用24對耐藥基因引物對該豬鏈球菌分離菌株進行耐藥基因擴增檢測，結(jié)果blaTEM和strB基因擴增出現(xiàn)目的條帶（857 bp和509 bp），與預(yù)期條帶大小一致（圖6），證明該豬鏈球菌分離株攜帶有β內(nèi)酰胺類耐藥基因blaTEM和氨基糖苷類耐藥基因strB。

4 討論

豬鏈球菌病仍是養(yǎng)豬行業(yè)的重要細菌性疾病，常常單獨發(fā)生或作為繼發(fā)病原繼發(fā)感染于病毒病之后，給養(yǎng)豬行業(yè)造成不小的經(jīng)濟損失。豬鏈球菌血清型較多，其中血清型1/2、1型、2型、7型、9型致病性較強[4，16]，臨床檢出率較高，常常引起豬的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及心內(nèi)膜炎等病癥，2型豬鏈球菌病更能引起人的感染發(fā)病或死亡。本試驗從病死豬腦組織中分離得到一株豬鏈球菌，通過血清型分型鑒定和測序比對，證實該臨床分離菌株為2型豬鏈球菌。

豬鏈球菌菌株的致病性強弱與其攜帶的毒力基因密切相關(guān)，一般把胞外因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）、溶血素（sly）作為豬鏈球菌毒力指示蛋白用來區(qū)分菌株毒力的強弱，epf+/mrp+/sly+常被認(rèn)為與高致病性菌株相關(guān)[3，17]。通過毒力基因檢測結(jié)果表明，該2型豬鏈球菌分離菌株同時攜帶胞外因子（epf）、溶菌酶釋放蛋白（mrp）和溶血素（sly）3種毒力基因，證明該菌株是高致病性菌株，致病性試驗結(jié)果再次印證了該菌株的毒力。

通過藥敏試驗結(jié)果表明，該株2型豬鏈球菌對頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林、氨芐西林、青霉素、復(fù)方新諾明、左氟沙星、氧氟沙星、恩諾沙星、環(huán)丙沙星、壯觀霉素敏感，而對卡那霉素、阿米卡星、阿奇霉素、替米考星、四環(huán)素、強力霉素、土霉素表現(xiàn)出高度耐藥，說明該株豬鏈球菌對大部分氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類藥物產(chǎn)生較為廣泛的耐藥性。與國內(nèi)的有關(guān)研究報道[18-19]，國內(nèi)豬鏈球菌對環(huán)丙沙星、阿奇霉素、四環(huán)素、磺胺類等藥物耐藥嚴(yán)重有一定不同。治療該株豬鏈球菌引發(fā)疾病首選藥物還是β-內(nèi)酰胺類藥物，考慮到臨床有腦炎神經(jīng)癥狀，應(yīng)當(dāng)配合磺胺類藥物聯(lián)合使用，該發(fā)病豬場臨床實踐用藥效果證實了聯(lián)合用藥效果。對該株豬鏈球菌進行24個耐藥基因檢測，只檢測出β-內(nèi)酰胺類的blaTEM基因和氨基糖苷類的strB基因，對比表型耐藥結(jié)果，再次說明耐藥菌株耐藥基因的檢測結(jié)果和表型耐藥結(jié)果的不一定符合性，進一步說明細菌耐藥性產(chǎn)生機理的復(fù)雜性，需要進一步進行深入研究和探索。

喝咖啡可延年益壽

【美聯(lián)社美國芝加哥7月2日電】新的研究顯示，咖啡可能有助于延長壽命，即使是那些每天飲用至少8杯的人也是如此。

在一項對英國近50萬名成年人進行的研究中發(fā)現(xiàn)，喝咖啡者的死亡風(fēng)險比堅決不喝者略低。

這種延年益壽的效果對于速溶、研磨和脫因的咖啡來說都有效。美國進行的研究也是相同效果。這是第一次有大型研究表明，即使對于那些有基因缺陷、影響到機體攝取咖啡因的人來說，喝咖啡也是有好處的。

總體而言，在為期10年的跟蹤研究中，喝咖啡者比堅決不喝者的死亡風(fēng)險低10%到15%。

并未參與這項研究的美國塔夫茨大學(xué)營養(yǎng)專家艾麗斯·利希滕斯坦說，這個結(jié)果并不能證明咖啡壺就是“不老泉”，也不應(yīng)成為不喝咖啡者開始喝咖啡的理由。但她說，這些結(jié)果印證了此前的研究，并給喝咖啡者提供了額外的信心。

利希滕斯坦說：“很難相信我們那么喜歡的一個東西對我們來說有這么大的好處。或者說，至少不是壞事。”

這項研究結(jié)果今天發(fā)表在《美國醫(yī)學(xué)會雜志·內(nèi)科學(xué)卷》雙周刊上。

目前尚不完全清楚喝咖啡是如何影響壽命的。

研究負(fù)責(zé)人、美國國家癌癥研究所研究員埃麗卡·洛夫特菲爾德說，咖啡含有1 000多種化合物，其中包括有助于保護細胞免受損傷的抗氧化物。

其他研究表明，咖啡中的物質(zhì)可以減輕炎癥并改善人體對胰島素的用法，從而降低患糖尿病的幾率。

咖啡因可導(dǎo)致血壓短期升高。一些較小規(guī)模的研究表明，咖啡因可能與高血壓有關(guān)。不過，在英國進行的這項研究表明，喝咖啡者并不比不喝者在心臟病和其他與血壓有關(guān)的疾病方面風(fēng)險更高。

和以前的研究一樣，喝咖啡者比不喝咖啡者更有可能飲酒和抽煙，但即使研究人員考慮了這些因素，喝咖啡似乎也能抵消掉這些因素。

（轉(zhuǎn)自 參考消息[N]，2018-07-04）