山西地方豬種肉質(zhì)相關(guān)基因相對表達(dá)量比較分析

孟冬霞，馬政禹，曹日亮

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)，山西 晉中 030801）

肉質(zhì)是一個綜合經(jīng)濟(jì)性狀，受遺傳、生理、營養(yǎng)、飼養(yǎng)管理?xiàng)l件等諸多因素的影響，其中豬品種的遺傳特性對豬肉品質(zhì)起決定性作用[1]。多年的研究結(jié)果表明，肉的化學(xué)組成、生理變化和食用品質(zhì)等均受到基因表達(dá)的調(diào)控，基因?qū)θ馄焚|(zhì)的影響主要表現(xiàn)在以下幾個方面：肉色、最終pH、持水性、肌內(nèi)脂肪。己糖激酶同工酶（HK）基因、ATP合成酶（ATP5B）基因及磷酸果糖激酶（PFK）基因與pH、肉色、滴水損失有關(guān)，心臟脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）主要影響肌內(nèi)脂肪含量，MyoD基因族和鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）主要調(diào)控肌纖維的生長和轉(zhuǎn)化，脂蛋白脂肪酶（LPL）基因主要影響脂肪代謝、沉積，與背肌長、平均背膘厚顯著相關(guān)[2-4]。山西黑豬、晉陽白豬是山西主要2個地方豬種。本項(xiàng)目在對山西黑豬和晉陽白豬肉色、pH、系水力、肌內(nèi)脂肪含量、氨基酸含量、脂肪酸含量、膽固醇含量等肉質(zhì)特性分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對 CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK等7個肉質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)量進(jìn)行比較分析，為系統(tǒng)開展山西地方豬種肉質(zhì)性狀遺傳控制奠定基礎(chǔ)，同時也為山西地方豬種的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時間與地點(diǎn)

2016年6—9月在山西大同地區(qū)某豬場進(jìn)行飼養(yǎng)試驗(yàn)，在大同生豬定點(diǎn)屠宰場進(jìn)行屠宰，屠宰時迅速取背最長肌組織樣品，裝入凍存管，編號并及時投入液氮中迅速冷凍，然后將所有樣品轉(zhuǎn)到-70℃低溫冰箱中保存。

1.2 試驗(yàn)動物與分組

選擇體重30 kg左右的山西黑豬、晉陽白豬各30頭，按品種分為2組，即山西黑豬組和晉陽白豬組，每組5個重復(fù)，每個重復(fù)6頭豬，組間平均體重差異不顯著。預(yù)試期10 d，進(jìn)行驅(qū)蟲和健胃后，開始正式試驗(yàn)。飼喂相同飼糧，豬瘟、口蹄疫、藍(lán)耳病等免疫程序按常規(guī)進(jìn)行。體重達(dá)110 kg左右時，飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束。

1.3 測定指標(biāo)

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，進(jìn)行屠宰，每個品種隨機(jī)抽選6頭豬進(jìn)行屠宰取樣，測定CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK 等 7個肉質(zhì)相關(guān)基因，并進(jìn)行比較分析。

1.4 主要試劑、儀器

Trizol試劑盒、cDNA合成試劑盒、核酸染色劑、瓊脂糖，均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；SW-CJ-1D潔凈工作臺，江蘇蘇潔凈設(shè)備廠生產(chǎn)；HC－2518R高速冷凍離心機(jī)，安徽中科中佳儀器有限公司生產(chǎn)；H6－1微型電泳槽，上海精益有機(jī)玻璃制品儀器廠生產(chǎn)；FR980凝膠成像系統(tǒng)，上海復(fù)日科技有限公司生產(chǎn)；PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀，BIO公司生產(chǎn)；TU－1901紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司生產(chǎn)；移液器（100～1 000 μL，20～200 μL，0.5～10 μL），加拿大 BBI公司生產(chǎn)；LightCycler480 Software Setup，Roche羅氏生產(chǎn)。

1.5 功能基因檢測方法

1.5.1 總RNA提取、cDNA合成 應(yīng)用Trizol試劑盒提取試驗(yàn)豬背最長肌總RNA，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳和核酸儀檢測驗(yàn)證RNA的完整性。注意：整個操作要戴口罩及一次性干凈手套，并盡可能在低溫下操作；使用cDNA合成試劑盒合成cDNA。

1.5.2 引物設(shè)計 應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，針對7個目的基因進(jìn)行引物設(shè)計，引物序列和擴(kuò)增片段信息見表1。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 引物序列和擴(kuò)增片段信息

1.5.3 PCR擴(kuò)增 將cDNA樣品稀釋8倍作為模板進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測。PCR反應(yīng)體系20 μL：SybrGreen qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性7 s，57℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45個循環(huán)。完成上述步驟后，把加好樣品的96/384孔細(xì)胞培養(yǎng)板放在LightCycler480 Software Setup（Roche羅氏）中進(jìn)行反應(yīng)。

1.5.4 豬肉樣品中功能基因相對表達(dá)量的檢測CAST、H-FABP、ATP5B、LPL、MyoG、PFK、HK 等 7 個基因相對表達(dá)量的檢測均是由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

基因相對表達(dá)量用2－△△Ct法計算。數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0中的ANOVA程序進(jìn)行方差分析和鄧肯氏（Duncan）多重比較。試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬肉樣品中RNA檢驗(yàn)結(jié)果

從豬背最長肌組織樣品中提取RNA，總RNA提取濃度在 200～1 000 ng/μL，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間，表明總RNA純度良好，可以滿足試驗(yàn)要求。2個品種的豬肉樣品均擴(kuò)增出特異性條帶。

2.2 豬肉樣品7個基因相對表達(dá)量測定結(jié)果

豬肉樣品7個基因相對表達(dá)量的測定結(jié)果見表2。由表2可知，山西黑豬HK、MyoG基因的相對表達(dá)量極顯著高于晉陽白豬（P<0.01）；山西黑豬HFABP、CAST基因的相對表達(dá)量均顯著高于晉陽白豬（P<0.05）；山西黑豬 ATP5B、PFK、LPL基因的相對表達(dá)量均高于晉陽白豬，但差異不顯著（P>0.05）。

表2 豬肉樣品7個基因相對表達(dá)量測定結(jié)果

3 討論

豬心型脂肪酸結(jié)合蛋白（H-FABP）基因是近年發(fā)現(xiàn)的影響豬肉質(zhì)的主要候選基因[5]，主要在心肌和骨骼肌細(xì)胞中表達(dá)，對長鏈脂肪酸穩(wěn)定的吸收和代謝有關(guān)鍵作用[6-7]。H-FABP基因的多態(tài)性顯著影響IMF（肌內(nèi)脂肪）含量和背膘厚[8]。IMF是嫩度的一個主要決定因素。Patrica等研究發(fā)現(xiàn)，肉的嫩度隨IMF的含量增加而改善，是因?yàn)榧±w維內(nèi)部和肌束之間的脂肪組織和結(jié)締組織呈交叉狀分布，脂肪含量增多可能會降低結(jié)締組織的物理強(qiáng)度，最終使肉的嫩度得到改善。CAST活性與肉的嫩度具有高相關(guān)性，與肌肉剪切力的平均表達(dá)高達(dá)28.9%，可作為肉質(zhì)嫩度性狀的候選基因[9]。本試驗(yàn)中山西黑豬H-FABP、CAST基因的相對表達(dá)量均顯著高于晉陽白豬（P<0.05），與文獻(xiàn)[10]中山西黑豬的肌內(nèi)脂肪含量顯著高于晉陽白豬試驗(yàn)結(jié)果一致。

肌纖維是構(gòu)成肌肉的基本單位，肌纖維直徑越細(xì)，肉質(zhì)越嫩；肌纖維比例越大，肉質(zhì)也越細(xì)嫩。肌纖維的生長和轉(zhuǎn)化受到MyoD基因族和鈣蛋白酶抑制蛋白（CAST）的調(diào)控[3，11-12]。MyoD 基因家族包括Myf-3、肌細(xì)胞生成素 Myf-4（MyoG）、Myf-5 及人體Myf-6基因。MyoG主要在骨骼肌中表達(dá)，是骨骼肌生長發(fā)育的抑制因子，與豬的生長性能和胴體特性相關(guān)，MyoG的突變能改變肌肉肌纖維的數(shù)目。脂蛋白脂肪酶（LPL）是動物機(jī)體組織脂肪沉積過程中的關(guān)鍵酶，能夠把血液中極低密度脂蛋白所攜帶的甘油三酯和乳糜微粒分解成甘油和脂肪酸，為脂肪組織合成甘油三酯提供的原料。王剛等對萊蕪豬和魯萊豬的研究表明LPL是肌內(nèi)脂肪沉積的重要參與者，其編碼基因的表達(dá)具有明顯的體重發(fā)育特征，并對肌內(nèi)脂肪的沉積具有一定程度影響[13]；本試驗(yàn)中山西黑豬MyoG基因表達(dá)量極顯著高于晉陽白豬（P<0.01），山西黑豬LPL基因的表達(dá)量與晉陽白豬差異不顯著（P>0.05）。文獻(xiàn)[10]中由于經(jīng)費(fèi)原因，沒有測量山西黑豬和晉陽白豬的肌纖維直徑、背肌長及平均背膘厚，條件允許時將進(jìn)一步進(jìn)行檢測分析。

ATP合成酶基因與動物的能量代謝、骨骼肌的形成、肌內(nèi)脂肪含量都有著密切關(guān)系[14]，通過對肌肉中糖代謝的調(diào)節(jié)，ATP5B基因在最終肉質(zhì)性狀（pH、肉色、滴水損失）中起著關(guān)鍵控制作用[15]；HK基因是糖酵解途徑的第一個酶，也是糖酵解途徑的限速酶，對宰后豬肉品質(zhì)形成具有重要影響[16]。生豬屠宰后，肌肉pH從7.0降至5.5左右，肌肉首先變硬變粗，隨后變嫩，經(jīng)過一系列變化過程，最終形成具有一定色澤、質(zhì)地、風(fēng)味等品質(zhì)特性的食用肉。研究表明，不同品種豬宰后其肉品質(zhì)具有一定差異性，且宰后無氧糖酵解速度和程度對肉品質(zhì)形成具有重要影響，無氧糖酵解速度越快，越易產(chǎn)生PSE肉[17]。ATP5B、PFK和HK基因均與pH、肉色、滴水損失有關(guān)。由試驗(yàn)可知，山西黑豬HK基因的相對表達(dá)量極顯著高于晉陽白豬，山西黑豬ATP5B、PFK基因的相對表達(dá)量與晉陽白豬差異不顯著（P>0.05），與文獻(xiàn)[10]中 pH、L 值（亮度）、b值（黃度）、系水力試驗(yàn)結(jié)果基本一致。