益氣健脾中藥修復(fù)腹瀉仔豬小腸黏膜損傷的病理學(xué)觀察

趙 娟，段昌學(xué)，王志俊，劉一飛，王志宇，趙 敏，李正莉，王樹(shù)華

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西 太原 030032；2.山西省商洛市動(dòng)物疾病防控中心，商洛 726000）

仔豬采用早期斷奶技術(shù)能提高母豬繁殖力，但過(guò)早斷奶又會(huì)因仔豬消化系統(tǒng)不健全等易出現(xiàn)仔豬早期斷奶綜合征[1]，表現(xiàn)為食欲降低、消化不良、飼料利用率低、抗病力下降、腹瀉等癥狀，斷奶仔豬腹瀉是集約化生產(chǎn)條件下的一種典型的多發(fā)性疾病。據(jù)調(diào)查，在我國(guó)，斷奶仔豬腹瀉率高達(dá)50%～60%，死亡率高達(dá)20%，在斷奶10～15 d高發(fā)，該病流行面廣，終年發(fā)病，病愈的仔豬也常生長(zhǎng)緩慢，飼料報(bào)酬降低，導(dǎo)致生長(zhǎng)抑制，甚至出現(xiàn)僵豬或死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。

目前，系統(tǒng)觀察斷奶仔豬小腸超微病變的研究仍較少，所以本試驗(yàn)采用中藥和抗生素治療斷奶仔豬腹瀉，通過(guò)腸黏膜病理切片染色及電鏡包埋切片觀察中藥對(duì)斷奶腹瀉仔豬小腸黏膜的影響[3]，腸道微絨毛腸上皮間淋巴細(xì)胞（LELs）、杯狀細(xì)胞（GSs）及上皮細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的病變，闡述了中藥復(fù)方顆粒劑對(duì)斷奶腹瀉仔豬小腸黏膜的影響，以期能在養(yǎng)豬生產(chǎn)中阻斷斷奶仔豬腹瀉的愈后不良，為防治斷奶仔豬腹瀉、提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能及現(xiàn)代養(yǎng)豬場(chǎng)中以中藥替代抗生素作為添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 中藥復(fù)方顆粒劑制備 中藥復(fù)方由黃芪、黨參、炒白術(shù)、炒山楂、炒麥芽、炒神曲、淮山藥、干姜、茯苓、甘草等13味中藥組成（原材料購(gòu)自山西省醫(yī)藥公司），由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所中獸醫(yī)藥研究室研制，山西省中醫(yī)研究所煎制。

1.1.2 抗生素的配制 廣譜抗生素鹽酸林可霉素購(gòu)自一心堂，用pH 7.4的生理鹽水配制成濃度為100 mg/mL，待用。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物 選用18頭（28±1）d、體重10.04 kg左右的杜長(zhǎng)大三元雜種斷奶腹瀉仔豬。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2019年5月12日至9月27日在太原市小店區(qū)南郊繁峙砂鎮(zhèn)的宏利豬場(chǎng)進(jìn)行。試驗(yàn)將18頭斷奶腹瀉仔豬隨機(jī)分為2組，每組3個(gè)重復(fù)，Ⅰ組為抗生素治療組，Ⅱ組為中藥復(fù)方顆粒劑治療組，分別于用藥后14 d時(shí)，每組隨機(jī)抽取3頭，頸動(dòng)脈放血處死，腹腔解剖觀察病理變化，無(wú)菌采集小腸黏膜。

1.2.2 腸壁光學(xué)顯微鏡組織學(xué)觀察 觀察各組仔豬小腸黏膜病理組織學(xué)變化：取十二指腸、回腸各5 cm腸組織剖開(kāi)，用生理鹽水沖洗后，在4%福爾馬林溶液中固定，石蠟包埋，并制成5 μm厚的切片，用常規(guī)HE（蘇木-伊紅）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察小腸黏膜出血、黏膜脫落及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況（趙娟等，2011）。

1.2.3 腸壁電子顯微鏡細(xì)胞學(xué)觀察 觀察各組仔豬小腸黏膜在電鏡下的形態(tài)：分別取十二指腸、回腸1～2 cm組織，經(jīng)過(guò)生理鹽水清洗后，切成1 mm大小顆粒，放入2%戊二醛固定2 h后，經(jīng)脫水包埋于環(huán)氧樹(shù)脂中，并切成80 nm厚的超薄切片，枸櫞酸鉛染色，電鏡下觀察，小腸絨毛排列，細(xì)胞受損狀況及細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核、線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體等的病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 解剖病理學(xué)變化

抗生素治療組仔豬十二指腸至回腸充血，出血，小腸內(nèi)食糜呈稀便，腸系膜淋巴結(jié)充血，出血和水腫，黏膜脫落，有大量炎性細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。中藥復(fù)方顆粒劑治療腹瀉仔豬小腸除局部可見(jiàn)輕微充血、出血外，腸黏膜基底部完整，未發(fā)現(xiàn)明顯病理變化。

2.2 腸壁光學(xué)顯微鏡組織學(xué)觀察結(jié)果

2.2.1 小腸壁炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度 抗生素治療組仔豬小腸絨毛內(nèi)皮以淋巴細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，且炎癥細(xì)胞已達(dá)固有層及黏膜下層（圖1A），表明炎癥細(xì)胞范圍較大。而中藥治療組腹瀉仔豬的小腸絨毛上皮內(nèi)僅有少許淋巴細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，在固有層及黏膜下層未見(jiàn)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1B）。

2.2.2 小腸黏膜上皮細(xì)胞脫落程度 抗生素治療組仔豬十二指腸至回腸的小腸黏膜上皮細(xì)胞變性、壞死，腸腔中有脫落的上皮細(xì)胞和紅細(xì)胞，小腸黏膜基底部廣泛充血、出血，小腸絨毛杯狀細(xì)胞擴(kuò)張、增生（圖2A）。而中藥復(fù)方顆粒劑治療組斷奶腹瀉仔豬有個(gè)別小腸絨毛上皮細(xì)胞發(fā)生變性，其余未見(jiàn)異常（圖2B）。

2.2.3 固有層和黏膜下層病變 光鏡下觀察到抗生素治療仔豬的小腸固有層和黏膜下層充血、出血和水腫，腸腺細(xì)胞發(fā)生變性、壞死、間質(zhì)水腫，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)、增生、淋巴小結(jié)增大（圖3A、圖3C）。而中藥復(fù)方顆粒劑治療組仔豬的小腸絨毛排列整齊，長(zhǎng)短基本一致，無(wú)明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)（圖3B、圖3D）。

2.3 腸壁電子顯微鏡細(xì)胞學(xué)觀察結(jié)果

2.3.1 腸壁杯狀細(xì)胞電鏡切片 中藥復(fù)方顆粒劑治療組的杯狀細(xì)胞膜完整（因發(fā)育時(shí)期不同，所以沒(méi)有細(xì)胞核），線(xiàn)粒體完整，嵴完整，核膜完整（圖4A、圖4B）。而抗生素治療組的杯狀細(xì)胞核物質(zhì)外泄，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)空泡化，線(xiàn)粒體腫脹空泡化，嵴缺失，排列紊亂（圖4C）。

2.3.2 腸壁淋巴細(xì)胞和吸收細(xì)胞電鏡切片 中藥治療組的淋巴細(xì)胞健康完整，細(xì)胞核膜完整，線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)健康完整（圖5A）。而抗生素治療組的淋巴細(xì)胞核膜腫脹呈彌散狀，核物質(zhì)外泄，異染色質(zhì)凝聚于內(nèi)膜邊緣，明顯呈病理性狀態(tài)（圖5B）。

2.3.3 腸道微絨毛電鏡切片 中藥治療組小腸微絨毛排列緊密，上皮絨毛細(xì)胞微絨毛排列整齊，微絨毛平整，有規(guī)律排列，微絨毛下方可見(jiàn)完整的緊密連接復(fù)合體及肌動(dòng)蛋白，腸上皮細(xì)胞內(nèi)側(cè)可見(jiàn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（圖6A）。而抗生素治療組腸上皮細(xì)胞微絨毛倒伏狀，脫落明顯（圖6B）。

2.3.4 腸道菌及溶酶體電鏡切片 中藥復(fù)方顆粒劑治療組腸道菌已被溶酶體吸收并逐漸消化（圖7A）。而抗生素治療組的腸道菌依然有許多附著在腸道管壁上（圖7B）。

2.3.5 腸壁淋巴細(xì)胞電鏡切片 中藥復(fù)方顆粒劑治療組淋巴細(xì)胞健康完整，細(xì)胞核膜完整，線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)健康完整（圖8F）。而抗生素治療組的淋巴細(xì)胞呈各種病理性變化，線(xiàn)粒體腫大、嵴缺失（圖8A），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腫脹明顯（圖8B），核糖體脫落（圖8C），細(xì)胞膜、細(xì)胞核破裂，核物質(zhì)外泄（圖8D），并有呈雙核仁或核萎縮的淋巴細(xì)胞（圖8E）。

3 討論

本研究結(jié)果表明，抗生素治療仔豬腹瀉，嚴(yán)重破壞仔豬腸黏膜病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)及腸黏膜細(xì)胞學(xué)結(jié)構(gòu)，影響仔豬的消化吸收及免疫功能，因此，抗生素對(duì)治療仔豬腹瀉雖具有一定效果，但也是形成僵豬的重要原因。而中藥治療有效改善腸黏膜組織結(jié)構(gòu)，修復(fù)腹瀉仔豬腸黏膜的吸收功能和免疫功能，為腹瀉仔豬的康復(fù)治療提供更為有效的方法。

有研究結(jié)果表明，胰高血糖素樣肽-2（GLP）對(duì)28日齡斷奶仔豬的腸黏膜上皮細(xì)胞的損傷有增殖作用，影響上皮細(xì)胞代謝并對(duì)其完整性有修復(fù)作用[4]。仔豬28日齡斷奶，腸道黏膜淋巴細(xì)胞含量最高，而斷奶越早，仔豬腸黏膜中杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著升高（P<0.05）[5]。新生犢牛小腸黏膜結(jié)構(gòu)隨著日齡增加，小腸絨毛變短，黏膜層厚度增加，小腸各段上皮細(xì)胞內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞隨年齡增長(zhǎng)而逐漸增多。相同日齡，從十二指腸至回腸，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，而杯狀細(xì)胞數(shù)量呈增多趨勢(shì)[6]。腸應(yīng)激綜合征患者小腸與結(jié)腸黏膜內(nèi)杯狀細(xì)胞、漿細(xì)胞、肥大細(xì)胞等超微結(jié)構(gòu)的改變?cè)诩膊“l(fā)生機(jī)制中有一定的作用[7]。肉仔雞飼糧中添加丁酸鈉，能增加小腸黏膜中肥大細(xì)胞，上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞及杯狀細(xì)胞的數(shù)量[8]。金光明等研究表明，中藥提取物對(duì)肉仔雞小腸黏膜免疫具有明顯的促進(jìn)作用[9]。肉兔飼糧中添加1%的銀杏葉復(fù)方制劑，可維持和養(yǎng)護(hù)斷奶肉兔的小腸黏膜組織[10]。中藥復(fù)方制劑對(duì)仔豬腸道中大腸埃希菌具有明顯的抑制作用，并能顯著提高仔豬腸道中乳酸桿菌和雙歧桿菌的數(shù)量，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，提高仔豬的生長(zhǎng)性能[11]。

在本試驗(yàn)中，通過(guò)中藥復(fù)方顆粒劑對(duì)腹瀉仔豬的治療，可明顯改善腸黏膜、受損淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，與上述文獻(xiàn)結(jié)果相近。研究發(fā)現(xiàn)斷奶仔豬腸黏膜系統(tǒng)不夠健全，黏膜免疫力低下，很容易誘發(fā)各種胃腸道疾病，引起腹瀉[12]，而用抗生素治療時(shí)會(huì)造成仔豬腸黏膜破壞及腸道菌群紊亂等，影響仔豬消化吸收及免疫功能，給現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。而中藥具有標(biāo)本兼治的特點(diǎn)，可以從根本上去除病因而達(dá)到抗生素所不能達(dá)到的治療效果，并可糾正因?yàn)E用抗生素而引起的耐藥性等不良反應(yīng)。有研究顯示，母豬的奶主要由脂肪（40.6 g/100 g）、蛋白質(zhì)（29.4 g/100 g）和乳糖（28.3 g/100 g）組成。母乳中的乳糖在乳糖酶的作用下轉(zhuǎn)變成豐乳糖和葡萄糖，母乳中的蛋白質(zhì)分解成氨基酸。葡萄糖和氨基酸可作為上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源，另一方面中藥中的多糖也可作為上皮細(xì)胞的主要能量來(lái)源[13-14]，中藥的蛋白質(zhì)中，一些氨基酸除了合成蛋白質(zhì)外，也可作為上皮細(xì)胞的能量來(lái)源，促進(jìn)腸黏膜的發(fā)育與成熟，促進(jìn)腸黏膜細(xì)胞的修復(fù)，從根本上解決仔豬腹瀉的發(fā)生，對(duì)早期斷奶仔豬腹瀉引起的腸黏膜損傷有顯著的修復(fù)作用。