盧冰霞,周英寧,梁家幸,秦毅斌,陳忠偉,何 穎,趙 碩,蔣冬福,李 斌,段群棚,劉 磊,3,趙 武
(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530001;2.廣西大學(xué),南寧 530005;3.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,南寧 530007)
現(xiàn)代養(yǎng)殖業(yè)不斷向規(guī)模化、集約化的方向發(fā)展,但伴隨著養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,動(dòng)物疫病也愈發(fā)復(fù)雜,已成為限制養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的重要因素。養(yǎng)殖業(yè)為了“防病治病”,大量濫用抗生素的現(xiàn)象十分普遍[1]??股貫E用會(huì)引起細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)、免疫抑制、藥物殘留等一系列問(wèn)題,嚴(yán)重威脅養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展和人類的健康。研究開(kāi)發(fā)抗生素替代品、推廣使用綠色添加劑是當(dāng)前研究的熱門,也是未來(lái)研究的方向[2]。益生菌是一類有益于宿主的活性微生物的總稱,它們定植于動(dòng)物腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi),能夠發(fā)揮改善宿主微生物生態(tài)平衡、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)吸收等有益作用。益生菌以其安全、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)生長(zhǎng)、抑制病原菌等優(yōu)勢(shì),作為理想的抗生素替代品而被廣泛應(yīng)用[3-5]。芽孢桿菌是一種好氧的革蘭氏陽(yáng)性菌,有芽孢,能夠耐高溫、耐酸且方便保存,是當(dāng)前應(yīng)用廣泛的一種益生菌[6]。枯草芽孢桿菌是芽孢桿菌的一種,因具有改善消化道內(nèi)環(huán)境、促生長(zhǎng)、提高免疫力及生產(chǎn)多種酶類或提高消化酶活性等功能而廣泛應(yīng)用[7]。雖然市面上也有較多商品化的添加于豬飼料中的枯草芽孢桿菌,但源于動(dòng)物尤其是來(lái)源于豬的枯草芽孢桿菌益生菌菌種鮮見(jiàn)報(bào)道。非動(dòng)物來(lái)源的枯草芽孢桿菌在動(dòng)物腸道中定殖力難,無(wú)法發(fā)揮其生物活性[8-9],因此開(kāi)展動(dòng)物源益生菌的篩選與研發(fā)十分必要。本研究從某規(guī)模豬場(chǎng)健康豬的新鮮糞便中分離鑒定獲得1株枯草芽孢桿菌,并研究其部分生物學(xué)特性及其益生性能,為下一步鑒定其是否能成為益生菌候選菌株奠定基礎(chǔ),也為進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)畜禽微生態(tài)制劑提供菌種資源和理論依據(jù)及技術(shù)支持。
試驗(yàn)于2019年6月10日至2020年4月2日在廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所進(jìn)行。健康仔豬的新鮮糞便,采自廣西某規(guī)?;B(yǎng)豬場(chǎng);6周齡健康小鼠,體重18~22 g,由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。
胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)和胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司;豬膽鹽購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;革蘭氏染液、芽孢染液、生理生化試劑,購(gòu)自杭州濱和微生物試劑有限公司;DNA抽提試劑盒為Axygen生物科技有限公司產(chǎn)品。
1.3.1 樣品采集 采集健康仔豬新鮮糞便,按照1∶5的比例使用無(wú)菌的PBS混勻后,于85℃水浴加熱20 min,取1 mL上清液進(jìn)行10倍系列的梯度稀釋,得到10-1~10-4一系列不同濃度的菌源稀釋液。
1.3.2 菌株的分離 無(wú)菌吸取上一步驟各稀釋度的菌源稀釋液接種于TSA平板的表面,每個(gè)平皿接種3個(gè)稀釋度,每組設(shè)3個(gè)重復(fù),37℃靜置培養(yǎng)24 h。
1.3.3 分離菌的純化 挑取步驟1.3.2中的單菌落,劃線接種TSA平板37℃培養(yǎng)24 h,重復(fù)劃線接種培養(yǎng)3次,得到純的分離菌。選取菌落形態(tài)典型的單個(gè)菌落加入4 mL TSB培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)24 h,得到的培養(yǎng)物擴(kuò)大培養(yǎng)后用于下面的鑒定和益生特性研究。
1.3.4 分離菌培養(yǎng)特性與形態(tài)觀察 取10 μL純培養(yǎng)的菌液,用適量生理鹽水稀釋后涂片,進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色,顯微鏡下觀察細(xì)菌染色情況及形態(tài)特征。
1.3.5 分離菌生理生化鑒定 對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行接觸酶試驗(yàn)、明膠液化、V-P試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、卵磷脂酶試驗(yàn)、7%氯化鈉試驗(yàn)、檸檬酸鹽試驗(yàn)、葡萄糖試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、丙酸鹽試驗(yàn)及運(yùn)動(dòng)性檢驗(yàn)試驗(yàn)等,根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(9版)對(duì)分離菌的種屬進(jìn)行初步鑒定。
1.3.6 分離菌分子生物學(xué)鑒定 按照DNA抽提試劑盒中的方法提取分離菌DNA。以分離菌的DNA作為模板,PCR擴(kuò)增其16S rDNA序列。PCR引物為擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA的通用引物,序列為:27F 5'-AG AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和1492R 5'-TACGGY TACCTTGTTACGACTT-3'(由上海生物工程有限公司合成),擴(kuò)增目的片段長(zhǎng)度約1 500 bp。采用25 μL PCR反應(yīng)體系:2xF8FastlongPCR MasterMix 12.5 μL,25 μmol/L 上、下游引物各 0.5 μL,滅菌水 8.5 μL,模板 3.0 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min,94 ℃ 10 s,退火溫度10 s,72℃ 10 s,30個(gè)循環(huán);72℃最后再延伸10 min。取10 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物于1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳并觀察結(jié)果。
將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)序,再利用生物學(xué)軟件Meglin對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行核苷酸同源性比對(duì)分析,并運(yùn)用MAGA 7.0進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建,確定分離菌株的類別。
1.4.1 耐酸性研究 用0.1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)TSB培養(yǎng)基 pH 為 1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 和 4.0(每個(gè) pH 3 個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1個(gè)樣品),分別按1∶100加入純化的分離菌,37℃處理4 h后取菌懸液,用涂抹平板法計(jì)數(shù),以自然pH下的菌懸液為對(duì)照,37℃培養(yǎng)24 h,分別計(jì)算存活率。存活率(%)=[1-(對(duì)照組含菌量-不同條件處理后含菌量)/對(duì)照組含菌量]×100%。
1.4.2 耐膽鹽性研究 TSB培養(yǎng)基加入豬膽鹽使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%、0.3%、0.4%、0.5%和0.6%,滅菌后分別按1∶100加入純化的分離菌,37℃培養(yǎng)24 h,以不加豬膽鹽的培養(yǎng)基作為對(duì)照組,每種濃度3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1個(gè)樣品。用涂平板法計(jì)活菌數(shù)。1.4.3 耐熱性能研究 取純化的分離菌(每個(gè)溫度1 mL) 分別置于 70、75、80、85、90 和 95 ℃的水中放置10 min,取出冷卻至室溫,用涂抹平板法計(jì)數(shù),以室溫下的菌懸液為對(duì)照組。每個(gè)處理溫度3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)1個(gè)樣品。
致病菌為本實(shí)驗(yàn)室保存的豬源大腸桿菌和沙門氏菌,采用牛津杯法進(jìn)行抗致病菌測(cè)定試驗(yàn)。分別取100 μL大腸桿菌和沙門氏菌到兩個(gè)TSA平板上,用三角形涂布器涂布均勻,將6個(gè)牛津杯均勻插在TSA平板的瓊脂里,然后在每個(gè)牛津杯中加入200 μL純化的分離菌,37℃培養(yǎng)24 h,測(cè)定抑菌圈的直徑大小。
采用K-B紙片擴(kuò)散法,取100 μL純化的分離菌(濃度約為1.0×108CFU/mL)涂布于TSA平板上,靜置5 min后,用鑷子將藥敏紙片均勻貼到瓊脂表面(每個(gè)平板貼9種藥物),37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜,判斷標(biāo)準(zhǔn)按2010版CLSI M100-S20執(zhí)行。
將小鼠分為2組,每組5只,第1組為試驗(yàn)組,第2組為對(duì)照組。試驗(yàn)組分別喂服純化的分離到的菌株(濃度約為 1.0×108CFU/mL,按 1∶10 稀釋,注入飲水混勻),2次/周;對(duì)照組喂服生理鹽水。觀察小鼠的狀態(tài),記錄小白鼠的發(fā)病、死亡等情況,試驗(yàn)時(shí)間為4周。
在TSA平板上從健康仔豬糞便中分離培養(yǎng)出多株分離菌,經(jīng)過(guò)多次連續(xù)劃線培養(yǎng),分離到多個(gè)純化的菌落。選取生長(zhǎng)快速、形態(tài)特征好的一株優(yōu)秀菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),用于后續(xù)試驗(yàn)。分離菌在TSA平板上呈乳白色,不透明,邊緣不規(guī)則,表面有褶皺,容易挑起(圖1)。革蘭氏染色后鏡檢,菌體形態(tài)呈長(zhǎng)桿狀,革蘭氏陽(yáng)性菌(圖2),芽孢染色呈綠色,芽孢所占比例較大,基本位于一側(cè)(圖3)。符合芽孢桿菌的特征。
生化試驗(yàn)結(jié)果表明,分離菌株能發(fā)酵蔗糖、麥芽糖、果糖、甘露醇和葡萄糖,能水解淀粉,甲基紅試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)和檸檬酸鹽試驗(yàn)均為陽(yáng)性,依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(9版)可初步鑒定分離菌為芽孢桿菌屬,命名為Y1,分離菌Y1的部分生理生化結(jié)果見(jiàn)表1。
表1 分離菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果
分離菌Y1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的片段大小約為1 500 bp(圖4),對(duì)分離菌Y1的16S rDNA測(cè)序序列用生物學(xué)軟件Meglin進(jìn)行序列核苷酸同源性比對(duì)分析。分析結(jié)果表明,與枯草芽孢桿菌序列同源性為99.60%~100%。利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建遺傳進(jìn)化樹(shù),結(jié)果顯示,分離菌Y1與枯草芽孢桿菌(MH210872.1和DQ444283.1)親緣關(guān)系最近,在同一進(jìn)化樹(shù)分支上(圖5)。
2.4.1 耐酸性 從圖6可見(jiàn),分離菌Y1在pH為1.0~5.0的TSB培養(yǎng)基中37℃處理4 h后進(jìn)行計(jì)數(shù),隨著pH的降低,分離菌Y1的存活率也降低,當(dāng)pH為2.0時(shí),存活率平均值仍能達(dá)到82.7%。當(dāng)pH為1.0時(shí),存活率明顯降低,表明超低pH對(duì)分離菌Y1的活性有較大影響,但其存活率平均值仍能達(dá)到28.2%,表明分離菌Y1具有較強(qiáng)的耐酸性能。
2.4.2 耐膽鹽性 從圖7可見(jiàn),分離菌Y1在不同含量豬膽鹽的TSB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果顯示,其存活率隨著豬膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而下降,但濃度為0.6%時(shí)存活率平均值仍能達(dá)到60.5%,表明分離菌Y1具有較強(qiáng)的耐膽鹽性能。
2.4.3 耐熱性 從圖8可見(jiàn),分離菌Y1在70、75、80、85、90和95℃的水浴中放置10 min后再進(jìn)行計(jì)數(shù),結(jié)果表明分離菌Y1具有一定的耐熱性能,存活率隨著水浴溫度的增加而下降,80℃以下存活率很高,存活率平均值在94.5%以上,85℃以上存活率下降快,95℃時(shí)的存活率平均值為19.8%,表明分離菌Y1具有較強(qiáng)的耐高溫性能。
牛津杯法測(cè)定結(jié)果為:分離菌Y1抑制大腸桿菌和沙門氏菌的抑菌圈直徑平均值分別為14.56 mm和18.29 mm,說(shuō)明分離菌Y1能夠一定程度地抑制病原菌大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng),且抑制沙門氏菌的效果略好于抑制大腸桿菌的。
藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離菌Y1對(duì)試驗(yàn)用大部分抗生素較敏感,如對(duì)大觀霉素、阿奇霉素、慶大霉素、強(qiáng)力霉素等;對(duì)頭孢唑啉、阿莫西林、桿菌肽、鏈霉素等藥物中度敏感;僅對(duì)青霉素G、土霉素和金霉素耐藥。具體結(jié)果見(jiàn)表2。
表2 分離菌Y1藥敏試驗(yàn)結(jié)果
試驗(yàn)組小鼠與對(duì)照組相比,試驗(yàn)期間均采食正常、精神良好,無(wú)一死亡,說(shuō)明分離到的枯草芽孢桿菌具有良好的安全性。
動(dòng)物的消化道是獲取益生菌菌種的重要來(lái)源之一[9]。本試驗(yàn)從臨床健康仔豬的糞便中獲得多株芽孢桿菌,選取其中1株生長(zhǎng)快速、形態(tài)特征典型的菌株進(jìn)行研究。其形態(tài)特征、生理生化及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果與鐘羅華等[1]、魏珊珊等[10]報(bào)道的研究結(jié)果相符,確定該分離菌為枯草芽孢桿菌,并對(duì)其益生特性進(jìn)行研究,評(píng)價(jià)其作為畜禽微生態(tài)制劑菌種的潛在價(jià)值。
因芽孢桿菌具有改善動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高免疫力和減少相關(guān)疾病和安全等多重益生功效,已然是當(dāng)前動(dòng)物飼料中應(yīng)用最廣泛的一種益生菌[7]。章文明等[11]的研究表明,飼喂與動(dòng)物同源的益生菌才能使其更好地定殖于動(dòng)物腸道內(nèi)并搶奪附著點(diǎn)而發(fā)揮益生效應(yīng)。同時(shí),同源性菌株還應(yīng)具有安全性高、免疫原性低等優(yōu)點(diǎn),才能作為微生態(tài)制劑的益生菌株。因此安全、高效同源益生菌的篩選和培育研究開(kāi)發(fā)飼用益生菌添加劑是研究重點(diǎn)[12]。飼料中添加的益生菌要想定殖于腸道而發(fā)揮其益生作用,必須能經(jīng)受住胃中惡劣的強(qiáng)酸性環(huán)境和十二指腸中膽汁的破壞[6]。本試驗(yàn)分離獲得的枯草芽孢桿菌菌株耐酸性試驗(yàn)表明,其經(jīng)pH 2.0的TSB處理4 h后,存活率平均值仍能達(dá)到82.7%,表明菌株具有較好的耐酸特性。分離菌菌株耐膽鹽試驗(yàn)表明,在含0.6%豬膽鹽的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后,其存活率平均值仍能達(dá)到60.5%,表明其具備較強(qiáng)的耐膽鹽性能,為其進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后耐受腸道內(nèi)膽鹽的破壞提供了保障。分離菌其良好的耐酸性和耐膽鹽特性為其益生作用奠定了基礎(chǔ)。分離菌菌株耐熱試驗(yàn)表明,分離菌在90℃的水浴中放置10 min后,其存活率平均值仍能達(dá)到54.5%,表明分離菌具有較強(qiáng)的耐熱性能,符合飼料加工工藝的要求。對(duì)致病菌的抑制作用試驗(yàn)表明,分離菌能夠一定程度地抑制病原菌大腸桿菌和沙門氏菌的生長(zhǎng),對(duì)豬腸道可以起到一定的保健作用。分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明,分離菌對(duì)試驗(yàn)用大部分抗生素較敏感,僅對(duì)青霉素G、土霉素和金霉素耐藥,可能是豬場(chǎng)長(zhǎng)期使用或者在飼料中添加這3種抗生素,導(dǎo)致分離的枯草芽孢桿菌對(duì)其耐藥。此外,動(dòng)物試驗(yàn)表明分離菌對(duì)試驗(yàn)小鼠無(wú)毒副作用,具有較好的安全性。綜上所述,本試驗(yàn)分離得到的枯草芽孢桿菌符合作為益生菌候選菌株的必要條件,可成為畜禽微生態(tài)制劑的供試菌株,為進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)畜禽微生態(tài)制劑提供菌種資源和理論依據(jù)及技術(shù)支持。
本試驗(yàn)從健康仔豬新鮮糞便中分離獲得一株細(xì)菌,根據(jù)形態(tài)特征、生化及分子生物學(xué)鑒定,確定該分離菌為枯草芽孢桿菌。該分離菌具有如下優(yōu)勢(shì):菌株菌落大,生長(zhǎng)快速,耐85℃以上熱處理,耐酸(pH為2.0)處理,耐0.6%豬膽鹽處理。同時(shí)具有一定的拮抗致病菌的作用,對(duì)大部分抗生素敏感,具有作為優(yōu)良益生菌候選株的優(yōu)勢(shì)。本試驗(yàn)豐富了豬源枯草芽孢桿菌益生菌菌種候選資源,為畜禽益生菌制劑的研發(fā)提供了優(yōu)質(zhì)候選供試菌株。
銅鍍層能殺滅新冠病毒
【澳大利亞《悉尼先驅(qū)晨報(bào)》網(wǎng)站4月15日?qǐng)?bào)道】題:鍍銅門把手能殺死新冠病毒?科學(xué)家說(shuō),有道理(記者 利亞姆·曼尼克斯)
鍍銅門把手成了全球抗疫的最新武器。
墨爾本一家三維打印公司目前已在多處政府設(shè)施和大學(xué)安裝了銅門牌和銅門把手,但科學(xué)家稱應(yīng)擴(kuò)展到醫(yī)療設(shè)施和各公共場(chǎng)所。
銅具有廣泛的抗微生物特性,且已安裝在全球的一些醫(yī)院,以阻止對(duì)抗生素具有耐藥性的超級(jí)細(xì)菌的傳播。初步證據(jù)顯示,銅還可以摧毀新冠病毒(SARS-CoV-2)。
澳大利亞弗林德斯大學(xué)一個(gè)實(shí)驗(yàn)室的負(fù)責(zé)人巴特·艾克爾坎普博士在研究銅的特性,他說(shuō):“眾所周知,銅具有抗微生物的特性,已用于醫(yī)療設(shè)備的抗微生物涂層?!?/p>
他說(shuō):“將之轉(zhuǎn)化為更廣泛的用途,比如床欄桿和扶手,似乎是非常合乎邏輯的,可能會(huì)有幫助?!?/p>
澳大利亞總理斯科特·莫里森說(shuō),正在討論取消限制。但他重申,由于擔(dān)心之后會(huì)暴發(fā)新冠疫情,解禁尚需幾周的時(shí)間。
3月在美國(guó)《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》周刊上發(fā)表的一項(xiàng)小型研究檢測(cè)了各種物質(zhì)表面的新冠病毒,結(jié)果發(fā)現(xiàn),銅表面的病毒會(huì)很快變得不穩(wěn)定。
打印銅門器具的澳大利亞“速度”三維打印機(jī)公司委托墨爾本的一家病毒實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行研究,結(jié)果表明,銅在兩個(gè)小時(shí)內(nèi)將病毒數(shù)量減少了96%。
悉尼大學(xué)病毒存活專家漢納·薩西博士說(shuō):“我們已經(jīng)知道銅具有抗微生物的特性,對(duì)醫(yī)院的很多病原體非常有效?!?/p>
2013年在多家醫(yī)院進(jìn)行了一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn),檢測(cè)醫(yī)院房間內(nèi)的銅床欄桿、桌子和椅子扶手。鍍銅表面將醫(yī)院獲得性感染的風(fēng)險(xiǎn)減少了一半以上。
另一方面,不銹鋼似乎是SARS-CoV-2的“良港”。在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》發(fā)表的這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中,不銹鋼表面72小時(shí)后仍可檢測(cè)到病毒。
公共衛(wèi)生專家正在考慮疫情期間健身房是否應(yīng)該一直關(guān)閉,因?yàn)槔锩嫱ǔ6际遣讳P鋼器械。
“速度”三維打印機(jī)公司的首席執(zhí)行官拜倫??夏岬险f(shuō):“不銹鋼看著真的很干凈。事實(shí)完全不是這樣。它不會(huì)殺死病毒。我們的測(cè)試長(zhǎng)達(dá)5個(gè)小時(shí),不銹鋼表面的病毒數(shù)量根本沒(méi)有減少?!?/p>
該公司向汽車和航空工業(yè)以及軍方出售三維金屬打印設(shè)備。隨著新冠疫情大流行,肯尼迪及其團(tuán)隊(duì)已研究出方法,利用三維打印機(jī)為現(xiàn)有的門把手涂上一毫米厚的銅鍍層。
每次鍍銅的花費(fèi)約為50到100美元,大約需要5分鐘。
銅似乎有多種特性,可以殺死病毒。當(dāng)細(xì)菌或病毒落到銅表面,帶電粒子,即離子,會(huì)從銅表面跳到細(xì)菌上,對(duì)細(xì)菌穿孔然后消滅它。
銅似乎還對(duì)細(xì)菌有一系列其他的負(fù)面影響,包括破壞其DNA。
(轉(zhuǎn)自 參考消息[N],2020-04-17)