綠咖啡豆綠原酸的體外抗氧化性活性測定

曹卓松，孫飛龍，唐 薇，寧景葉

（西安工程大學(xué) 環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，西安 710600）

0 引言

綠原酸（Chlorogenic acid，CGA）來源于天然植物，成分安全，廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健、日用化工以及食品制造等行業(yè)，近年來國內(nèi)外學(xué)者對(duì)CGA的結(jié)構(gòu)、成分、性質(zhì)、提取純化工藝及其生物活性等方面進(jìn)行了大量研究。Rodrigues研究發(fā)現(xiàn)咖啡中基因型是影響生咖啡豆中生物活性物質(zhì)含量和抗氧化能力的決定因素，并且發(fā)現(xiàn)咖啡中清除活性氧和活性氮的活性物質(zhì)主要是CGA［1］。

體外抗氧化性測定方式有很多，比如還原能力（即Fe3+還原能力）和抑制自由基能力（即DPPH自由基清除能力）等。梁萱等人研究了桃花中CGA的還原力和抗氧化活性，并以Vc和CGA標(biāo)準(zhǔn)品做對(duì)照，用K3［Fe（CN）6］測還原力，采用DPPH自由基清除法、D-脫氧核糖-鐵體系法和鄰苯三酚自氧化法測其抗氧化活性，證明了桃花提取物中主要活性物質(zhì)是CGA［2］。

本文利用鐵離子還原法和DPPH自由基清除法測定綠咖啡豆綠原酸（Green Coffee Bean Chlorogenic acid，GCBCGA）的體外抗氧化活性，并探究了溫度、光照、pH值對(duì)GCBCGA穩(wěn)定性（抗氧化活性）的影響，本課題對(duì)GCBCGA作為天然抗氧化劑的研究發(fā)展提供了一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

將經(jīng)過純化、濃縮、干燥后得到的GCBCGA粉末用無菌水溶解，即得不同濃度的GCBCGA樣品液，下述為GCBCGA樣液。

TPTZ，DPPH，冰醋酸，山梨酸鉀，結(jié)晶乙酸鈉，七水合硫酸亞鐵，檸檬酸，三氯化鐵，抗壞血酸，無水亞硫酸鈉，30%過氧化氫均為分析純；蒸餾水為試驗(yàn)室自制。

1.2 儀器

DJ靈巧型粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；SHH· W21· 420型三用電熱恒溫水箱（余姚市東方電工儀器廠）；752N型紫外可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；酸度計(jì)（上海任氏電子有限公司）。

1.3 抗氧化性的測定

1.3.1 FRAP還原力的測定

（1）FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。FRAP溶液的配制：稱取0.31 g結(jié)晶乙酸鈉溶解至1.6 mL冰醋酸中，用蒸餾水定容至100 mL，得到300 mmol/L的醋酸緩沖液（pH值為3.6）；稱取31.233 mg TPTZ并用40 mmol/L的鹽酸溶解再定容至10 mL，得到10 mmol/L的TPTZ溶液（4 ℃冷藏備用）；稱取三氯化鐵0.270 3 g并加蒸餾水定容至50 mL，得到20 mmol/L的FeCl3· 6H2O溶液。將上述溶液依次按體積比10：1：1混合均勻，即可得FRAP溶液，需現(xiàn)配現(xiàn)用［3］。

稱取0.278 0 g七水合硫酸亞鐵加蒸餾水定容至100 mL，即得10 mmol/L的FeSO4溶液（可滴加少量濃硫酸使pH值約為4以防止溶液氧化）。取10 mmol/L的FeSO4溶液，加水稀釋定容，配成5、4、2.5、2、1.25、1、0.625、0.312 5 mmol/L不同濃度的FeSO4溶液。

取不同濃度的FeSO4溶液各0.05 mL，加入4.5 mL提前預(yù)熱至37 ℃的FRAP試劑，混勻，37 ℃水浴下反應(yīng)10 min后在593 nm下測吸光值，繪制FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）GCBCGA樣液還原力的測定。分別移取0.05 mL質(zhì)量濃度為0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mg/mL的GCBCGA樣液于不同試管中，再向各試管加入4.5 mL預(yù)熱至37℃的FRAP試劑，混勻，37 ℃水浴反應(yīng)10 min后測該溶液在波長593 nm處的吸光值。平行試驗(yàn)3次取平均值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出不同吸光值下FeSO4濃度，此濃度值即為FRAP值。以不同濃度0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的抗壞血酸（Vc）作對(duì)比試驗(yàn)。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定

（1）DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。分別準(zhǔn)確稱取DPPH標(biāo)準(zhǔn)品0、0.79、1.58、2.37、3.15和3.94 mg于100 mL棕色容量瓶中，再用95%的乙醇充分溶解并定容至100 mL，即可得到濃度分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mmol/L的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，將其避光保存，備用。分別取不同濃度的DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液在517 nm波長下測吸光值，繪制DPPH標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）GCBCGA樣液DPPH自由基清除率的測定。配0.1、0.25、0.5、0.75、1.0 mg/mL不同濃度的GCBCGA樣液，各取1 mL的GCBCGA樣液和2 mL的0.1 mmol/L DPPH醇溶液混勻，不同濃度1 mL GCBCGA 樣液和2 mL的95%乙醇混勻，0.1 mmol/L DPPH醇溶液2 mL和95%乙醇1 mL混勻，避光放置30 min后在517 nm波長下分別測吸光度Ai、Aj、A0。做3組平行試驗(yàn)，取平均值。以上試驗(yàn)均以抗壞血酸（Vc）做陽性對(duì)照。按下式計(jì)算自由基清除率AE［4］：

用標(biāo)準(zhǔn)曲線所測得吸光值可計(jì)算殘留率，可與上述清除率比對(duì)驗(yàn)證，殘留率CREM計(jì)算公式如下［5］：

式中 Ct—— t時(shí)刻的DPPH自由基的摩爾濃度，mmol/L；

C0—— 初始DPPH自由基的摩爾濃度，mmol/L。

1.3.3 影響抗氧化穩(wěn)定性的試驗(yàn)

（1）光照時(shí)間對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響。取10 mL 濃度為0.8 mg/mL的GCBCGA 樣液兩組，分別置于無光條件下和完全遮擋自然光并用日光燈持續(xù)照射條件下，在第0、3、6、9天分別取樣按上述1.3.2（2）中方法進(jìn)行試驗(yàn)，測吸光度得自由基清除率，比較在不同時(shí)間下光照的影響因素。

（2）pH值對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響。取10mL濃度為0.8 mg/mL GCBCGA 樣液6組，分別調(diào)pH值至2、4、6、8、10、12的，24 h后取樣進(jìn)行試驗(yàn)，測吸光度得自由基清除率，比較不同pH值對(duì)DPPH自由基清除率的影響。

（3）溫度對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響。將0.8 mg/mL GCBCGA 樣液分裝10mL于帶塞試管中，分別置于40 ℃、60 ℃、80 ℃不同溫度的恒溫水浴鍋中，一組在室溫下（20±2）℃，于0、30、60、90、120、150 min時(shí)，取樣按上述1.3.2（2）中方法進(jìn)行試驗(yàn)后測吸光度得自由基清除率。

2 結(jié)果與分析

2.1 FRAP還原力

（1）FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以吸光值為縱坐標(biāo)，F(xiàn)eSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)，如圖1繪制FeSO4標(biāo)曲，得線性回歸方程：y=0.216 1x-0.060 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，線性范圍：0～5 mmol/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

（2）GCBCGA樣液還原力的測定。圖2中，主次縱坐標(biāo)的GCBCGA樣液和Vc濃度為自變量，兩者濃度范圍不同，F(xiàn)RAP值為因變量。當(dāng)樣液和Vc濃度均為0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)應(yīng)的FRAP值分別為3.45 mmol/L和6.69 mmol/L，后者是前者的1.94倍。相同F(xiàn)RAP值下，所需GCBCGA樣液濃度明顯大于Vc的濃度。增加相同量的FRAP值，所需GCBCGA樣液濃度比所需Vc的濃度高?？梢奊CBCGA的還原能力不如Vc。

2.2 DPPH自由基清除能力

（1）DPPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。以DPPH醇溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制DPPH的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖3可得，線性回歸方程：y=11.283x+0.003 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，線性范圍：0～0.1 mmol/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好。

（2）GCBCGA自由基清除率的測定。由吸光值計(jì)算可得DPPH自由基清除率AE值如圖4，AE值隨著GCBCGA 樣液濃度的增加而增大，當(dāng)其濃度為0.75 mg/mL和1 mg/mL時(shí)AE值分別為88.45%和92.97%，逐漸趨于穩(wěn)定，表明濃度為0.75 mg/mL已清除約90%的DPPH自由基。陽性對(duì)照Vc的AE值也隨著濃度增加而增大，當(dāng)Vc濃度為0.5 mg/mL時(shí)清除率達(dá)到約90%。GCBCGA 樣液濃度為0.75 mg/mL時(shí)的清除率相當(dāng)于0.5 mg/mL的Vc的清除率，當(dāng)兩者濃度均為0.75 mg/mL時(shí)，兩者的AE值相當(dāng)。以上表明GCBCGA 具有一定的抗氧化能力，但抗氧化能力不如Vc。

用標(biāo)準(zhǔn)曲線所測得的吸光值計(jì)算殘留率CREM，GCBCGA樣液的清除率AE和殘留率CREM如表1。

表1 GCBCGA的清除率AE和殘留率CREM

理論上，不同濃度下的AE和CREM之和都為100%，由表1可知，誤差均在2%以內(nèi)，說明試驗(yàn)誤差較小，數(shù)據(jù)可靠。

2.3 抗氧化穩(wěn)定性

（1）光照時(shí)間對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響。由圖5可知，在0～9天避光和光照條件下，DPPH自由基清除率均呈逐漸下降趨勢，避光條件下GCBCGA樣液的清除率下降了11.77%，光照條件下清除率下降了31.73%，下降率約是避光條件下的3倍。由于GCBCGA結(jié)構(gòu)中的酯鍵、不飽和雙鍵及多元酚具有光化學(xué)活性，這些光不穩(wěn)定因素在紫外線照射下，極易發(fā)生光降解作用而使GCBCGA含量下降，造成與DPPH自由基結(jié)合率下降使清除率變低。因此，光照時(shí)間對(duì)GCBCGA的DPPH自由基清除率的穩(wěn)定性影響較大。

（2）pH值對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響。由圖6可知，DPPH自由基清除率隨著pH值先緩慢增大再快速降低，當(dāng)pH值為6時(shí)，DPPH自由基清除率最大為85.35%。相比pH為6時(shí)，pH為2時(shí)的清除率低了10.62%，pH值為12時(shí)的清除率低了60.49%。說明pH值對(duì)GCBCGA的抗氧化穩(wěn)定性有顯著性影響。GCBCGA在低pH值環(huán)境下可以更穩(wěn)定的存在，酸性條件可以對(duì)GCBCGA結(jié)構(gòu)起到一定的保護(hù)作用，抑制了氫離子的釋放，降低了與DPPH自由基的結(jié)合率，而其在堿性條件下則十分活潑。

（3）溫度對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響。由圖7可知，在150 min內(nèi)，室溫（20±2 ℃）下，DPPH自由基清除率無明顯變化，在40、60和80 ℃下，隨著水浴時(shí)間延長，分別取樣測得與初始清除率相比浮動(dòng)均小于5%，說明溫度對(duì)GCBCGA的DPPH自由基清除率穩(wěn)定性無顯著影響。

3 結(jié)語

本文采用2種方法對(duì)GCBCGA進(jìn)行了體外抗氧化活性的測定，通過試驗(yàn)證明了GCBCGA具有一定體外抗氧化活性。GCBCGA樣液抗氧化能力與其濃度呈正相關(guān)，說明GCBCGA具有一定的抗氧化能力，但抗氧化能力不如Vc。穩(wěn)定性試驗(yàn)證明溫度對(duì)GCBCGA的抗氧化性穩(wěn)定性影響有限；光照對(duì)其抗氧化穩(wěn)定性有一定程度影響。pH值對(duì)抗氧化穩(wěn)定性的影響顯著，其在酸性條件下更穩(wěn)定，而在堿性條件下極其不穩(wěn)定。本文通過探究GCBCGA抗氧化活性為天然抗氧化劑的發(fā)展提供了試驗(yàn)依據(jù)。