不同貯藏溫度下阿根廷魷魚(yú)內(nèi)源性甲醛及相關(guān)物質(zhì)的變化規(guī)律

宋素珍，李佳琳，曹娜娜，趙夢(mèng)曉，楊賢慶，沈 琳，李穎暢

（1.渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，廣州 540641；3.大連東霖食品股份有限公司，遼寧大連 116101）

0 引言

阿根廷魷魚(yú)具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，屬于低脂肪高蛋白海產(chǎn)品，是我國(guó)最重要的經(jīng)濟(jì)類海產(chǎn)品之一。近年來(lái)魷魚(yú)等海產(chǎn)品內(nèi)含有甲醛的問(wèn)題一直受到國(guó)內(nèi)外的廣泛關(guān)注。研究證明魷魚(yú)及其制品中含有較高含量的甲醛（FA）［1-3］。FA能夠與細(xì)胞親核物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致DNA損傷，進(jìn)而引發(fā)各種癌癥；甲醛還可與氨基酸殘基反應(yīng)，促進(jìn)蛋白質(zhì)鏈分子間和分子內(nèi)連接形成共價(jià)交聯(lián)，從而使蛋白質(zhì)變性，影響魷魚(yú)的品質(zhì)［4］。魷魚(yú)內(nèi)源性甲醛的產(chǎn)生途徑包括：生物途徑和非酶途徑［5］。在低溫貯藏期間，酶學(xué)途徑是水產(chǎn)品產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛的主要途徑［6］。國(guó)外研究者對(duì)鱈魚(yú)等海產(chǎn)品中的氧化三甲胺脫甲基酶（TMAOase）進(jìn)行初步研究，TMAOase主要集中在內(nèi)臟組織［7-8］。

低溫保鮮是水產(chǎn)品保鮮中最為常見(jiàn)的一種方法［9］，但是低溫貯藏過(guò)程中仍會(huì)有甲醛產(chǎn)生。Jinhwan等［10］研究了貯藏條件對(duì)鱈魚(yú)甲醛含量的變化；韓冬嬌等［11］研究了不同貯藏溫度下南白美對(duì)蝦中甲醛的含量；苗林林等［12］研究了梭子蟹貯藏和加工過(guò)程中內(nèi)源性甲醛含量的變化，但是不同貯藏溫度下，魷魚(yú)中甲醛變化規(guī)律以及與氧化三甲胺脫甲基酶（TMAOase）活性的關(guān)系研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本文通過(guò)測(cè)定不同貯藏溫度下阿根廷魷魚(yú)體內(nèi)FA、DMA、TMA、TMAO、TMAOase活性、肌原纖維蛋白溶解性、菌落總數(shù)，探討了不同溫度對(duì)阿根廷魷魚(yú)中甲醛的影響及酶催化途徑對(duì)魷魚(yú)甲醛的積累作用，旨在為酶學(xué)途徑控制海產(chǎn)品中甲醛含量提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿根廷魷魚(yú)（錦州市林西路水產(chǎn)市場(chǎng)）；曲拉通X-100（TritonX-100，北京化學(xué)試劑公司）；甲醛溶液（分析純，遼寧泉瑞試劑有限公司）；甲苯（分析純，上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；甲醇（色譜純，DIKMA公司）；苦味酸（分析純，西隴化工股份有限公司）；甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.4 mg/mL，國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所）；三羥甲基氨基甲烷（分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；TMAO標(biāo)準(zhǔn)品（國(guó)家環(huán)境保護(hù)總局標(biāo)準(zhǔn)樣品研究所）。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度儀（島津儀器有限公司）；THERMO X1R冷凍高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）；Agilent GC7890氣相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）；MS105DU電子分析天平（METTLER TOLEDO公司）；雷磁pHS-C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 貯藏條件

將阿根廷魷魚(yú)分別在4 ℃，0 ℃，-20 ℃下貯藏，測(cè)定樣品FA、DMA、TMA、TMAO、TMAOase酶活、肌原纖維蛋白溶解度、菌落總數(shù)，根據(jù)不同溫度的貯藏期，4 ℃和0 ℃貯藏18 d，每隔2 d取樣測(cè)定，-20 ℃下分別在0、9、18、27、36、45、54 d取樣測(cè)定。各指標(biāo)測(cè)定均做三個(gè)重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)試驗(yàn)平行測(cè)定兩次。

1.3.2 樣品處理

根據(jù)朱軍莉等［13］的方法略作修改，將阿根廷魷魚(yú)清洗、去皮、取胴體，取2.00 g絞碎的魚(yú)肉，加50 mL超純水，震蕩混勻后浸泡10 min，加入20 mL 10%三氯乙酸混勻，冰浴超聲30 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液，用1 mol/L NaOH調(diào)至pH 4.0，然后定容至100 mL，4 ℃冷藏待用。

1.3.3 甲醛（FA）的測(cè)定

根據(jù)Benjakul等［14］的方法測(cè)定FA含量，取1 mL上清液，加蒸餾水至5mL，加入乙酰丙酮溶液1 mL，混合均勻，60 ℃水浴10 min，取出冷卻，以空白為參比，于波長(zhǎng)413 nm處測(cè)吸光度值。公式如下：

式中 A ——樣品管相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)甲醛的量，μg；

m ——樣品質(zhì)量；

v1——TCA萃取總體積；

v2——樣品測(cè)定萃取體積；

X ——甲醛的含量，mg/kg。

1.3.4 二甲胺的測(cè)定

根據(jù)賈佳［15］等的方法測(cè)定二甲胺（DMA）含量，取2 mL上清液，加入2 mL 65%KOH溶液，定容至5 mL，加入2 mL對(duì)甲苯磺酰氯-甲苯溶液，60 ℃水浴加熱1 h，取出冰浴冷卻，漩渦振蕩3 min，進(jìn)行GC-FID分析。

1.3.5 三甲胺的測(cè)定

根據(jù)賈佳的方法略作修改，取4mL上清液，依次加入l mL 10% FA、5 mL甲苯、3 mL 25% KOH，30 ℃水浴30 min，震蕩3min，將甲苯層用0.2 g無(wú)水硫酸鈉吸水，吸取2 mL無(wú)水甲苯層與2 mL苦味酸混合，以空白為參比，在410 nm處測(cè)定吸光值。

1.3.6 氧化三甲胺的測(cè)定

取4 mL反應(yīng)液加入1%三氯化鈦溶液0.50 mL，振蕩混勻于80 ℃水浴90 s，冷水冷卻。其他步驟同TMA測(cè)定步驟相同。氧化三甲胺（TMAO）計(jì)算公式如下：

式中 A0——樣品中氧化三甲胺的含量，mg/kg；

A1—— 經(jīng)三氯化鈦溶液還原后的三甲胺含量，mg/kg；

A2——樣品中三甲胺的含量，mg/kg；

79.11 ——氧化三甲胺的相對(duì)分子質(zhì)量；

59.11——三甲胺的相對(duì)分子質(zhì)量。

1.3.7 氧化三甲胺脫甲基酶活性的測(cè)定

參考金洋等［16］的方法提取粗酶，稱取15 g肝臟，以l：3的比例加入抽提液（0.1 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris-乙酸），混合勻漿100 s，離心（10 000 r/min，4 ℃，30 min）除去雜蛋白，用1 mol/L HCl將其酸化，調(diào)節(jié)pH至4.5后，離心（4 ℃，10 000 r/min，30 min），除去雜蛋白；再用1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至6.0，繼續(xù)離心（4 ℃，10 000 r/min，30 min），取上清液，即為酸化的粗酶液。

參考Kimura等［17］的方法測(cè)定氧化三甲胺脫甲基酶活性。反應(yīng)液中含有20 mmol/L TMAO、2 mmol/L半胱氨酸、2 mmol/L抗壞血酸、0.2 mmol/L FeCl2和20 mmol/L Tris-乙酸（pH 7.0），加入酶液，25 ℃反應(yīng)15 min后加入10% TCA 終止反應(yīng)，離心（4 ℃，8 000 r/min，15 min），取1 mL上清液測(cè)定甲醛含量。在相同條件下，分別以不加酶液的反應(yīng)液和不加反應(yīng)液的酶液作為陰性對(duì)照。

1.3.8 肌原纖維蛋白溶液的提取

參考Bertram［18］方法略作修改，將阿根廷魷魚(yú)流水解凍，去皮，取酮體肉，加3倍體積A液（0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl，pH 7.5）和1倍體積B液（1% Triton X-100、0.1 mol/L KCl、0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液，pH 7.5）均質(zhì)（10 000 r/min，30 s，至少6次），紗布過(guò)濾（除去結(jié)締組織），離心（4 ℃，10 000 r/min，10 min），去上清液，沉淀用4倍體積A液浸提，重復(fù)浸提4次，所得沉淀即為肌原纖維蛋白，并測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。所有操作均在4 ℃條件下進(jìn)行，備用。

1.3.9 肌原纖維蛋白溶解度的測(cè)定

參考Benjakul［19］的方法略作改進(jìn)，取5 mL蛋白濃度為5 mg/mL的肌原纖維蛋白溶液于7 mL離心管中，離心（4℃，3 000 r/min，10 min），立即取上清液1 mL，并加入4 mL雙縮脲試劑混勻，在25 ℃中靜置30 min，以空白為參比，540 nm下測(cè)吸光度，重復(fù)3次，肌原纖維蛋白的溶解程度用溶解性（PS）來(lái)表示，公式如下：

式中 C1——離心后上清液中的蛋白質(zhì)濃度；

C2——離心前的蛋白質(zhì)濃度。

1.3.10 菌落總數(shù)的測(cè)定

參考GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)菌落總數(shù)測(cè)定》的方法測(cè)定［20］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)7次重復(fù)3次，用SPASS19.0對(duì)進(jìn)行方差分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯藏溫度下FA含量的變化

圖1是阿根廷魷魚(yú)在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過(guò)程中FA含量的變化。結(jié)果顯示，4 ℃，0 ℃和-20 ℃魷魚(yú)的FA初始值為6.68 mg/kg，隨著貯藏時(shí)間的增加FA含量顯著增加（P＜0.05），到貯藏末期其含量分別達(dá)到了16.54、13.48和12.69 mg/kg。

在低溫貯藏過(guò)程中甲醛的產(chǎn)生主要是由于魷魚(yú)體內(nèi)氧化三甲胺脫甲基酶的催化作用。4 ℃和0 ℃貯藏后期迅速增加可能是由于魷魚(yú)組織受到魷魚(yú)內(nèi)部器官的污染，使肌肉組織充分與氧化三甲胺酶接觸導(dǎo)致甲醛增加；在-20 ℃的冷凍貯藏狀態(tài)下，氧化三甲胺脫甲基酶仍有活性，導(dǎo)致FA含量增加；相同貯藏時(shí)間內(nèi)，4 ℃甲醛含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低，各溫度之間差異顯著（P＜0.05），這可能是由于4 ℃條件下酶的活性較強(qiáng)，同時(shí)還有微生物的腐敗作用；貯藏溫度越低，甲醛含量就越低，因此低溫貯藏有利于控制魷魚(yú)中的甲醛含量。朱仁義等［21］對(duì)室溫0 ℃，4 ℃和-20 ℃貯藏條件下的烏賊內(nèi)源性甲醛含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了相似的變化。

2.2 不同貯藏溫度下DMA含量的變化

二甲胺是海產(chǎn)品氧化三甲胺分解產(chǎn)物之一，是魚(yú)肉的腐敗指標(biāo)之一，也是魚(yú)肉腥臭味的來(lái)源。研究表明，氧化三甲胺在氧化三甲胺脫甲基酶的作用下分解為甲醛和二甲胺［22-23］。圖2是阿根廷魷魚(yú)在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過(guò)程中DMA含量的變化。結(jié)果顯示，4 ℃，0 ℃和-20 ℃魷魚(yú)的DMA初始值在100 mg/kg左右。隨著貯藏時(shí)間的增加，DMA含量顯著增加（P＜0.05），且與貯藏時(shí)間顯著相關(guān)（R4℃=0.981，R0℃=0.996，R-20℃=0.990），各溫度之間DMA含量差異顯著。到貯藏末期4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏條件下DMA含量分別達(dá)到初期的3.6倍、3.4倍和2.1倍，相同貯藏時(shí)間內(nèi)，4 ℃DMA含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低，溫度低時(shí)酶活性部分被抑制，二甲胺含量相對(duì)較低。

2.3 不同貯藏溫度下TMA含量的變化

三甲胺是氧化三甲胺的還原產(chǎn)物，具有腥臭味，因此也可用來(lái)判斷水產(chǎn)品是否新鮮。鱈魚(yú)等深海魚(yú)類體內(nèi)含有氧化三甲胺，當(dāng)魚(yú)類死后，在微生物和酶的作用下，氧化三甲胺被還原為三甲胺，隨著魚(yú)體新鮮度的下降，三甲胺含量逐漸增加［24］。圖3是阿根廷魷魚(yú)在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過(guò)程中TMA含量的變化。結(jié)果顯示，4 ℃和0 ℃魷魚(yú)的TMA初始值為35.29 mg/kg，隨著貯藏時(shí)間的增加TMA含量顯著增加（P＜0.05），到貯藏末期其含量分別達(dá)到了270.58和218.3 mg/kg，在冷藏初期，魷魚(yú)新鮮，品質(zhì)良好，TMA含量低，到冷藏后期魷魚(yú)開(kāi)始腐敗，TMAO在酶和微生物作用下，魚(yú)腥味產(chǎn)生，TMA含量增加；-20 ℃下TMA由初始的35.29 mg/kg增長(zhǎng)到190.2 mg/kg，由于低溫魚(yú)體內(nèi)代謝緩慢，因此三甲胺增長(zhǎng)緩慢；相同貯藏時(shí)間內(nèi)，4 ℃甲醛含量最高，然后是0 ℃，-20 ℃最低。

2.4 不同貯藏溫度下TMAO含量的變化

TMAO是海洋生物中的天然滲透劑和重要的非蛋白氮、水產(chǎn)品的鮮味物質(zhì)，也是產(chǎn)生三甲胺（TMA）、二甲胺（DMA）和甲醛（FA）的主要前體物質(zhì)［25］。圖4是阿根廷魷魚(yú)在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過(guò)程中TMAO含量的變化。結(jié)果顯示，4，0 ℃和-20 ℃貯藏下TMAO含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，不同溫度下貯藏時(shí)間對(duì)TMAO含量變化的影響差異顯著（P＜0.05）；相同貯藏時(shí)間內(nèi)，4 ℃氧化三甲胺含量最低，0 ℃次之，-20 ℃最高，可見(jiàn)溫度越低氧化三甲胺分解越慢。

2.5 不同溫度貯藏下TMAOase活性的變化

TMAOase廣泛分布于海產(chǎn)動(dòng)物組織中，是海產(chǎn)品中TMAO產(chǎn)生內(nèi)源性甲醛的主要酶類［26］。圖5是在4，0，和-20 ℃貯藏下阿根廷魷魚(yú)肝臟中TMAOase活性的變化，結(jié)果顯示，4，0和-20 ℃貯藏下魷魚(yú)的TMAOase的初始活性在1.38 U/g；4和0 ℃貯藏條件下，氧化三甲胺脫甲基酶活性顯著（P＜0.05）升高，后趨于平緩，這可能是由于貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)TMAOase發(fā)生變性從而導(dǎo)致酶活性降低；-20 ℃時(shí)隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高（P＜0.05）后降低的趨勢(shì)（P＜0.05），這可能是由于TMAOase主要集中在溶酶體膜上［27］，-20 ℃貯藏后期由于冰晶變大導(dǎo)致溶酶體膜被破壞，從而導(dǎo)致TMAOase的活性降低。

2.6 不同貯藏溫度下肌原纖維蛋白溶解度的變化

溶解性是反映蛋白變性的一個(gè)重要指標(biāo)，反映魷魚(yú)產(chǎn)品的品質(zhì)［28］。圖6是阿根廷魷魚(yú)在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過(guò)程中肌原纖維蛋白溶解性變化。結(jié)果顯示，3組蛋白的初始溶解度為72.9%，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各溫度下蛋白的溶解性呈下降趨勢(shì)，3組貯藏條件分別在第18、54 d時(shí)溶解性分別達(dá)到50.01%、53.17%、54.62%；相同貯藏時(shí)間內(nèi)4 ℃下降最多，依次是0，-20 ℃，各溫度之間存在顯著差異（P＜0.05），溫度越低，蛋白變性越慢，溶解性越好；這和甲醛的生成量相關(guān)，F(xiàn)A與蛋白質(zhì)側(cè)鏈的官能團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，形成分子內(nèi)和分子間的亞甲基橋，使蛋白質(zhì)變性，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)伸展，發(fā)生聚集，聚集物增加，導(dǎo)致了蛋白質(zhì)溶解度的下降。

2.7 不同貯藏溫度下魷魚(yú)菌落總數(shù)的變化

海產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中極易受到微生物感染，菌落總數(shù)可反映海產(chǎn)品的腐敗程度，同時(shí)魷魚(yú)等海產(chǎn)品在微生物的作用下也可產(chǎn)生少量甲醛［29］。圖7是阿根廷魷魚(yú)在4 ℃，0 ℃和-20 ℃貯藏過(guò)程中菌落總數(shù)的變化。結(jié)果顯示，貯藏初期阿根廷魷魚(yú)的菌落總數(shù)均小于4 lg（CFU/g），均處于1級(jí)鮮度。隨著貯藏時(shí)間的增加，各溫度下的菌落總數(shù)總體呈上升趨勢(shì)；4 ℃，0 ℃貯藏至15 d分別達(dá)到6.4、6.03 lg（CFU/g），魷魚(yú)已經(jīng)超過(guò)了食用價(jià)值。相同貯藏時(shí)間內(nèi)，-20 ℃的菌落總數(shù)低于4 ℃，0 ℃。菌落總數(shù)與FA、DMA、TMA變化趨勢(shì)一致，主要是由于微生物能利用TMAO，產(chǎn)生TMA，菌落總數(shù)的增加導(dǎo)致魚(yú)肉組織迅速軟化和水解，加速了魚(yú)肉腐敗，而這一過(guò)程又促進(jìn)了魷魚(yú)組織中的TMAOase釋放與激活，使魚(yú)肉組織中的DMA和FA含量迅速增加［30］。

3 結(jié)語(yǔ)

阿根廷魷魚(yú)在4 ℃、0 ℃和-20 ℃貯藏下，隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)菌落總數(shù)、甲醛、二甲胺、三甲胺顯著性增加（P＜0.05），氧化三甲胺、溶解度顯著性降低（P＜0.05）；4 ℃和0 ℃下酶活先升高后平緩；-20 ℃下酶活先升高后下降。低溫貯藏過(guò)程中，溫度越低，甲醛含量越低；各溫度下TMAOase活性與甲醛含量顯著相關(guān)；因此，低溫貯藏過(guò)程中酶學(xué)途徑是產(chǎn)生甲醛的主要途徑，通過(guò)控制酶的活性來(lái)控制魷魚(yú)甲醛的產(chǎn)生至關(guān)重要。