HPLC法測定蓮子殼提取物中原花青素的含量

童錫迪，彭 紅*，王 瓊，金 鑫

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

HPLC法測定蓮子殼提取物中原花青素的含量

童錫迪，彭 紅*，王 瓊，金 鑫

（江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330004）

目的：建立測定蓮子殼提取物中原花青素含量的高效液相色譜法。方法：色譜柱Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-水-甲酸-異丙醇（13∶73∶8∶6，V/V）；檢測波長525 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：原花青素在37.6～300.8 μg/mL與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r=0.999 5，加樣回收率為99.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%。結(jié)論：該方法簡便、快速、準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性和回收率，可作為蓮子殼提取物中原花青素含量的測定方法。

蓮子殼提取物；原花青素；高效液相色譜法

原花青素是不同數(shù)量的黃烷-3-醇或黃烷-3,4-二醇聚合而成的聚合物的總稱[1]，因其具有良好的抗氧化、清除自由基、抑制腫瘤、抗誘變等生物活性[2-18]，現(xiàn)已被廣泛用于醫(yī)藥、保健品、食品及化妝品等領(lǐng)域。蓮子殼為睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥成熟種子的果皮，蓮子殼作為蓮的副產(chǎn)物，資源十分豐富，但在加工過程中，多數(shù)蓮子殼被丟棄，資源未被充分利用，本研究發(fā)現(xiàn)，蓮子殼中含有原花青素，故以蓮子殼為原料提取原花青素，屬于廢物再利用。原花青素是一類多酚類化合物，化學(xué)成分復(fù)雜，其含量測定目前國際上并無統(tǒng)一的方法，常用的含量測定方法有鐵鹽催化比色法、香草醛法、紫外分光光度法等[19-25]。香 草醛法測定的是原花青素單體及其多聚體的總量，重復(fù)性較差；紫外分光光度法因其干擾性物質(zhì)較多，只適用于原花青素純度特別高的產(chǎn)品；鐵鹽催化比色法操作簡便，對原花青素測定專一性較好；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法測定相對準(zhǔn)確。未見HPLC法測定蓮子殼提取物中原花青素含量的相關(guān)報(bào)道，本研究將鐵鹽催化比色法與HPLC法結(jié)合，測定蓮子殼提取物中原花青素的含量，該方法簡便可行，具有良好的重復(fù)性，可為蓮子殼資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蓮子殼由廣昌縣白蓮科學(xué)研究所提供，品種：贛蓮62、太空蓮32、白花蓮；蓮子殼提取物（批號20130606、20130608、20130610） 自制；蓮子殼提取物（批號20130702、20130705、20130708） 江西遠(yuǎn)健藥業(yè)有限公司；原花青素對照品（純度＞95%） 貴州迪大科技責(zé)任有限公司；甲醇、甲酸、異丙醇（均為色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；水為自制三蒸水；其余試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

1200系列高效液相色譜儀（配有四元泵、真空脫氣泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器）；BS214D電子天平 北京賽多利斯電子儀器有限公司；GZX-9146MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SZ-97自動(dòng)三重純水蒸餾器 上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為Diamonsil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水-甲酸-異丙醇（13∶73∶8∶6，V/V）；檢測波長525 nm；流速1.0 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

1.3.2 蓮子殼提取物的制備

以原花青素的提取轉(zhuǎn)移率為指標(biāo)，鐵鹽催化后以HPLC法為檢測手段，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)法對乙醇體積分?jǐn)?shù)、溶劑倍數(shù)、提取溫度、提取時(shí)間進(jìn)行考察，優(yōu)選提取工藝條件，確定蓮子殼提取物的最佳提取工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、溶劑倍數(shù)8 mL/g、提取溫度65 ℃、提取2 次，每次2 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至浸膏狀，真空干燥，即得蓮子殼提取物。蓮子殼提取物的得率約為10.1%，在最佳提取工藝條件下，提取物中原花青素的提取轉(zhuǎn)移率約為88.3%。

1.3.3 測定原理

蓮子殼提取物中的原花青素能在熱酸性條件下醇解產(chǎn)生花色素，利用花色素的還原性在鐵鹽的催化反應(yīng)條件下產(chǎn)生特征性的紅色，并且在可見光區(qū)有一特征吸收峰，最大吸收峰波長為525 nm，其顯色靈敏而穩(wěn)定。

1.3.4 水解反應(yīng)

本研究在李華等[26]研究的基礎(chǔ)上，對水解反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定的水解反應(yīng)條件如下。將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，取出15 mL置于具塞錐形瓶中，再加入0.5 mL硫酸鐵銨溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%硫酸鐵銨溶液：稱取硫酸鐵銨2 g，用濃度為2 mol/L鹽酸溶解，定容至100 mL）和2 mL試樣溶液，混勻，稱定質(zhì)量，置沸水浴中回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，用甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，待進(jìn)HPLC分析。

1.3.5 溶液的制備

1.3.5.1 對照品溶液的制備

取原花青素對照品約15 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。分別精密量取對照品儲備液各0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mL置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，混勻，按1.3.4節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到各級標(biāo)準(zhǔn)溶液（37.5、75、150、225、300 μg/mL）。含量測定對照品溶液的質(zhì)量濃度約為150 μg/mL。

1.3.5.2 供試品溶液的制備

取蓮子殼提取物約60 mg，精密稱定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇適量，超聲20 min，再加甲醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液1 mL置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，按1.3.4節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即得供試品溶液。

1.3.5.3 陰性對照溶液的制備

用甲醇作為試樣溶液，按1.3.4節(jié)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即得陰性對照溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

取各級標(biāo)準(zhǔn)溶液（37.5、75、150、225、300 μg/mL），按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)樣分析，以對照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析?；貧w方程為Y=1.547 4X—17.023，r=0.999 5。結(jié)果表明，原花青素在37.6～300.8 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 專屬性實(shí)驗(yàn)

圖 1 原花青素對照品（A）、蓮子殼提取物（B）、陰性對照（C）色譜圖Fig.1 Chromatograms of proanthocyanidins reference substance (A), lotus seed shell extract (B), and negative control (C)

精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液，分別進(jìn)樣10 μL，按1.3.1節(jié)色譜條件測定，結(jié)果供試品溶液中原花青素分離度較好，陰性對照溶液在對應(yīng)位置上未見相同色譜峰，表明陰性對照無干擾，見圖1。

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

取原花青素對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，記錄其峰面積，計(jì)算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為0.37%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于配制后0、15、30、45、60、90 min進(jìn)樣測定，記錄其峰面積，計(jì)算RSD為0.35%（n=6），結(jié)果表明供試品溶液在90 min內(nèi)顯色基本穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取蓮子殼提取物（20130705）6 份，按1.3.5.2節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，其平均含量為43.0%，RSD為1.52%。說明含量測定方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

分別取已知含量的蓮子殼提取物6 份，各約30 mg，精密稱定，分別精密加入相當(dāng)于樣品中原花青素含量80%、100%、120%的原花青素對照品，精密稱定，按1.3.5.2節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表 1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)（n=9）Table 1 Results of recovery tests (n=9)

2.7 靈敏度實(shí)驗(yàn)

取蓮子殼提取物適量，按1.3.5.2節(jié)方法制備供試品溶液，并逐級稀釋，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行測定，信噪比約為10時(shí)，樣品溶液的質(zhì)量濃度50.5 μg/mL；信噪比約為3時(shí)，樣品溶液的質(zhì)量濃度16.6 μg/mL，即蓮子殼提取物中原花青素的定量限50.5 μg/mL，檢出限16.6 μg/mL。

2.8 樣品含量測定

應(yīng)用本研究建立的方法對6 批不同批號的蓮子殼提取物中的原花青素含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。

表 2 6 批樣品中原花青素的含量Table 2 Proanthocyanidins contents in samples from six different batches

3 討 論

本研究考察10、20、30、40 min不同超聲時(shí)間對樣品提取效果的影響，最終確定超聲提取20 min。在流動(dòng)相的選擇中，分別考察了甲醇-水、甲醇-水-甲酸、甲醇-水-磷酸、甲醇-水-甲酸-異丙醇等體系，最 終確定甲醇-水-甲酸-異丙醇（13∶73∶8∶6，V/V）為流動(dòng)相。

本研究也嘗試采用紫外分光光度法測定蓮子殼提取物中原花青素的含量，測得提取物中原花青素的含量約為48%，與HPLC法相比，測定結(jié)果稍微偏大，原因可能是部分反應(yīng)產(chǎn)物對原花青素的測定存在一定的干擾，鑒于HPLC法的專屬性較好，因此選擇HPLC法進(jìn)行蓮子殼提取物中原花青素的含量測定。

本研究中穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)的時(shí)間短，原因可能是反應(yīng)生成的物質(zhì)不穩(wěn)定等，故筆者建議蓮子殼提取物中原花青素的含量測定在90 min內(nèi)進(jìn)行。

本研究嘗試采用AB-18、ADS-8、D101等型號大孔吸附樹脂純化蓮子殼提取物，經(jīng)HPLC法測定，原花青素含量達(dá)到89%，故可繼續(xù)探索分離純化條件，提高蓮子殼提取物中原花青素的純度，為蓮子殼提取物的實(shí)際應(yīng)用提供相應(yīng)的參考依據(jù)。

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Determination of Proanthocyanidins in Lotus Seed Shell Extract by HPLC

TONG Xidi, PENG Hong*, WANG Qiong, JIN Xin
(School of Pharmacy, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine, Nanchang 330004, China)

Objective: To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for the determination of proanthocyanidins in lotus seed shell extract. Methods: HPLC analysis was carried out using Diamonsil C18(4.6 mm × 250 mm, 5 μm), and the mobile phase consisted of methanol-water-formic acid-isopropyl alcohol (13:73:8:6, V/V) at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 525 nm, the column temperature was set at 35 ℃, and the injection volume was 10 μL. Results: A good linearity of proanthocyanidins was achieved in the range of 37.6-300.8 μg/mL (r = 0.999 5). The average recovery was 99.2%, with relative standard deviation (RSD) of 0.30%. Conclusion: This method is simple, reproducible, accurate and reliable and thus can be used for quality control of lotus see shell extract.

lotus seed shell extract; proanthocyandins; high performance liquid chromatography (HPLC)

O657.7

A

1002-6630（2015）02-0145-04

10.7506/spkx1002-6630-201502028

2014-06-24

童錫迪（1988—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量控制。E-mail：812648316@qq.com

*通信作者：彭紅（1964—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)樗幬镔|(zhì)量控制。E-mail：ibbmm@163.com