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      撒壩豬AIDA基因編碼區(qū)克隆、序列特征分析及組織表達量檢測

      2020-06-10 09:28:18呂敏娟崔藝佳李明麗周曉霞嚴達偉董新星
      家畜生態(tài)學報 2020年5期
      關鍵詞:白豬位點引物

      呂敏娟,崔藝佳,李明麗,周曉霞,嚴達偉,董新星

      (云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院,云南 昆明 650201)

      AIDA(axin interactor, dorsalization associated)基因,最初認為是一種軸突連接分子,在酶的合成中起重要作用[1]。后圍繞敲除AIDA基因的易胖小鼠研究發(fā)現(xiàn):AIDA基因編碼的AIDA蛋白能夠控制脂肪吸收的效率[2]。AIDA基因能夠與磷酸肌肽結(jié)合,或通過環(huán)狀結(jié)構(gòu)與細胞膜結(jié)合來發(fā)揮作用[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白降解(endoplasmic reticulum associated degradation, ERAD)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)中的一種蛋白降解系統(tǒng)[4],以一種底物依賴性的方式執(zhí)行特殊細胞的功能[5-8]。AIDA基因是通過ERAD促進小腸細胞內(nèi)脂肪合成酶的降解。在熱中性條件下,對敲除AIDA基因的小鼠喂食高脂肪食物時,小鼠體內(nèi)的脂肪酸會進行再酯化,三酰甘油急劇增加,但是脂肪的生成并沒有增加[1]。因此, AIDA蛋白介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑可以通過降解脂肪合成途徑過程中的代謝酶,限制膳食脂肪在腸道的吸收,來抵御機體肥胖。

      撒壩豬肌內(nèi)脂肪含量高,肉質(zhì)優(yōu)良[9-10],但脂肪率較高,在動物脂肪市場需求大幅下降、豬肉市場優(yōu)質(zhì)優(yōu)價機制尚未健全的情況下,其養(yǎng)殖比較效益受到了一定影響。鑒于AIDA基因與脂肪的吸收有關,本研究對撒壩豬AIDA基因編碼序列進行克隆及序列特征分析,旨在揭示撒壩豬AIDA基因編碼區(qū)序列的生物信息學特征,運用實時熒光定量PCR技術檢測該基因在mRNA水平上的表達規(guī)律,豐富AIDA基因的數(shù)據(jù)庫信息,為撒壩豬AIDA基因與脂肪性狀相關的遺傳機制研究提供一定依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 樣品采集

      采集撒壩豬、大河豬、杜洛克、大白豬和長白豬的耳組織樣,每個品種各90頭(公母各半),裝入裝有75%乙醇的離心管中。采集撒壩豬脾臟、胰臟、背脂、腎臟、肺、大腦、肝臟、心臟、背最長肌和大白豬的背脂、背最長肌,用于各組織表達分析檢測。

      1.2 方法

      1.2.1 引物設計 以GenBank中豬AIDA基因序列(登錄號:NC_010452.4)為模板,使用Primer premier 5.0軟件設計引物(見表1):分別擴增10個外顯子,涵蓋了AIDA基因的CDS區(qū)域。所設計的引物由北京擎科(昆明)生物技術有限公司合成。

      1.2.2 基因組DNA提取 采用動物基因組 DNA 提取試劑盒(TSINGKE)從耳組織樣品中提取DNA,儲于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.3 RNA提取與cDNA合成 采用Trizol法分別提取撒壩豬的脾臟、胰臟和背脂等9種組織以及大白豬的背脂和背最長肌的RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,質(zhì)控合格后保存?zhèn)溆谩?/p>

      1.2.4 PCR擴增與測序 PCR反應體系為25 μL,包含ddH2O18 μL,10×buffer(Mg2+)2.5 μL,上下游引物各0.5 μL(10 μmol/L),dNTPs2.0 μL(2.5 mmol/L),Taq聚合酶(5 U/μL)0.5 μL,DNA模板(50 ng/μL)1.0 μL。PCR反應程序為:94 ℃預變性4 min,然后94 ℃變性30s→退火30s→72℃延伸30s,30個循環(huán)后,于72 ℃后延伸8 min,4 ℃終止反應。退火溫度依次依引物而異(見表1)。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

      經(jīng)檢測后的PCR擴增產(chǎn)物送至北京擎科(昆明)生物技術有限公司進行序列測定,測序結(jié)果經(jīng)比對拼接后,獲得撒壩豬AIDA基因完整CDS序列。

      表1 AIDA基因分段擴增引物Table 1 AIDA gene fragment amplification primer

      1.2.5 分析軟件 采用上述得到的CDS序列,經(jīng)一系列預測分析獲得AIDA基因的生物學信息。預測項目及軟件如表2所示。

      1.2.6 實時熒光定量PCR檢測 分別取撒壩豬和大白豬不同組織的cDNA,以GAPDH基因為內(nèi)參,實時熒光定量PCR檢測AIDA基因在不同組織中的表達。取0.2 ml PCR管,配制如下反應體系,每個反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管,反應體系為25 μL:2×qPCR Mix 12.5 μL,7.5 μM 上下游引物2.0 μL(表3),cDNA 2.5 μL,RNase-free水 8.0 μL。PCR反應條件為:95 ℃,10 min為模板的預變性階段;95 ℃,15 s,60 ℃,60 s,共40個循環(huán)為模板的擴增階段,60 ℃→95 ℃,每15 s緩慢升溫0.3 ℃,建立熔解曲線階段。結(jié)果用2-△△Ct法進行計算。

      表2 分析軟件Table 2 Analysis tools

      2 結(jié)果與分析

      2.1 AIDA基因多態(tài)性分析

      對大白豬、長白豬、撒壩豬、杜洛克、大河豬等5種豬的AIDA基因編碼區(qū)進行擴增、測序比對得出:AIDA基因在5個豬種間沒有發(fā)生錯義突變,在長白豬群體中發(fā)現(xiàn)2個同義突變(C20554T,G20560A),大白豬群體中發(fā)現(xiàn)3個同義突變(C20554T,G20560A,G34355A),撒壩豬中檢測到1個同義突變(T7243C)。經(jīng)過SeqMan軟件對撒壩豬各個外顯子進行拼接,利用DANMAN軟件翻譯,得到CDS的完整序列及氨基酸序列(圖1)。

      表3 實時熒光定量PCR引物序列信息Table 3 Real-time fluorescence quantitative PCR primer sequence information

      2.2 AIDA基因氨基酸序列理化特性預測與分析

      氨基酸是構(gòu)成生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位,是動物營養(yǎng)所需蛋白質(zhì)的最基本物質(zhì)[11]。經(jīng)ProtParam在線軟件預測顯示,撒壩豬AIDA蛋白由306個氨基酸組成,分子重34.973ku,其中亮氨酸(Leu)所占比例最高(11.1%),色氨酸(Trp)所占比例最低(0.7%),如表4。撒壩豬AIDA蛋白基本理化性質(zhì)如表5所示。其中AIDA蛋白的不穩(wěn)定指數(shù)為86.08,屬于不穩(wěn)定蛋白(注:不穩(wěn)定系數(shù)小于40,說明是穩(wěn)定蛋白,反之則是不穩(wěn)定蛋白[12])??偲骄H水性為-0.541,屬于親水蛋白。運用ExpAsy服務器上的Protscale程序預測撒壩豬AIDA蛋白的疏水性,結(jié)果如圖2。

      2.3 AIDA蛋白信號肽預測與分析

      信號肽在蛋白分泌的過程中起重要作用,分泌性蛋白質(zhì)合成后由信號肽引導其穿過合成所在的細胞到其他組織細胞中[13]。運用SignalP軟件對撒壩豬AIDA蛋白的信號肽進行預測。通過圖3可知,S<0.5,因此,撒壩豬AIDA蛋白不存在信號肽。

      表4 AIDA蛋白的氨基酸組分Table 4 Amino acid component of AIDA protein

      表5 AIDA蛋白的基本理化性質(zhì)Table 5 Basic physical and chemical properties of AIDA protein

      圖2撒壩豬AIDA蛋白質(zhì)疏水性預測結(jié)果
      Fig.2 The hydrophobicity profile of AIDA in pigs analyzed by Prot Scale in Saba pig

      2.4 AIDA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預測與分析

      對撒壩豬AIDA蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行分析,預測結(jié)果如圖4。撒壩豬AIDA蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)。

      2.5 AIDA蛋白亞細胞定位

      通過在線軟件PsortⅡ分析預測豬AIDA基因編碼蛋白的亞細胞定位[14],結(jié)果如表6:該蛋白主要分布在細胞質(zhì),其次為細胞質(zhì)膜,在細胞壁和胞外少量分布。因此,可以推斷出撒壩豬AIDA蛋白主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用。

      表6 撒壩豬AIDA蛋白亞細胞定位分值Table 6 Location score of AIDA in Saba pigs

      2.6 AIDA蛋白卷曲螺旋預測與分析

      卷曲螺旋主要存在于一些轉(zhuǎn)錄因子、結(jié)構(gòu)蛋白以及酶中,在細胞與外界環(huán)境之間的物質(zhì)與信息交換中可以發(fā)揮重要功能[15]。由圖5可見,在14、21、28三個窗口寬度下均檢測到AIDA蛋白含有兩個典型的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)。

      2.7 AIDA蛋白糖基化位點、磷酸化位點預測

      運用 NetNGlyc 1.0 預測撒壩豬AIDA蛋白N糖基化位點(圖6),發(fā)現(xiàn)有1個糖基化位點,位于第51個氨基酸處,NLSE為0.579。由圖7可見,當潛在磷酸化位點的閾值為0.5時,AIDA蛋白存在29個潛在的磷酸化位點,其中包含11個絲氨酸(Ser)位點、14個蘇氨酸(Thr)位點、4個酪氨酸(Tyr)位點。在撒壩豬AIDA蛋白上可能有unsp、PKC、CaM-II、GSK3等15種保守的蛋白激酶結(jié)合位點,在221處unsp分值最高,為0.996。

      2.8 AIDA蛋白二級結(jié)構(gòu)預測

      由圖8可見,AIDA蛋白α-螺旋區(qū)域有106個氨基酸,占34.64%,β轉(zhuǎn)角區(qū)域有12個氨基酸,占3.92%,無規(guī)卷曲區(qū)域有139個氨基酸,占45.42%,延伸鏈區(qū)域有49個氨基酸,占16.01%。

      2.9 AIDA蛋白三級結(jié)構(gòu)預測

      采用Phyre2對AIDA蛋白同源建模獲得三級結(jié)構(gòu)模型,撒壩豬的AIDA蛋白經(jīng)折疊、彎曲等一系列復雜的過程形成如圖9所示的三級結(jié)構(gòu)。

      2.10 AIDA基因的分子進化分析

      對綿羊(XM_004013613.3)、山羊(XM_018060188.1)、牛(NM_001205634.1)、雞(NM_001277540.2)、猴(NM_001283182.1)、鼠(NM_181732.4)、人(NM_022831.3)和豬(XM_003130513.6)的AIDA基因編碼序列進行同源性分析,結(jié)果顯示,豬AIDA基因編碼區(qū)序列與綿羊、黃牛、雞、山羊、人、猴、鼠的同源性分別為94.2%、94.4%、84.9%、94.4%、94.1%、93.8%、91.0%(圖10)。

      對8個物種進行進化樹分析結(jié)果見圖11。由圖11知,撒壩豬與綿羊、山羊、黃牛的親緣關系較近。

      2.11 撒壩豬AIDA基因CpG Plot預測

      運用CpG Plot在線軟件預測撒壩豬AIDA基因的CpG Island,結(jié)果顯示撒壩豬AIDA基因沒有CpG island。

      2.12 AIDA基因組織表達分析

      由圖12可知,AIDA基因在大白豬的背最長肌和背脂中表達量要高于撒壩豬。圖13可知,撒壩豬AIDA基因在不同組織中的表達量不同,在胰中的表達量明顯高于其他組織,AIDA基因表達量從高到低依次為胰臟、脾臟、背脂、腎臟、肺臟、大腦、肝臟、心臟和背最長肌。

      S.撒壩豬;Y.大白豬;LD.背最長??;BF.背脂

      S. Saba pig;Y. Yorkshire;LD. Longest back muscle;BF. Backfat

      3 討 論

      動物脂肪沉積是脂肪合成和分解代謝平衡后的結(jié)果,受到脂肪合成、分解和脂肪酸轉(zhuǎn)運等方面的影響[16]。腸道內(nèi)消化的脂肪含量是控制食欲的關鍵部分[17-18],脂肪進入體內(nèi)后,首先在小腸里水解成脂肪酸和單酰甘油,之后被小腸上皮細胞攝入,在小腸上皮細胞中又重新合成脂肪,形成脂蛋白并從小腸上皮細胞分泌,進入淋巴循環(huán)通過血管輸送到全身,被各個器官利用或儲存。脂肪合成途徑的代謝酶大多都定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白降解(ERAD)是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)中的一種蛋白降解系統(tǒng),能夠控制蛋白質(zhì)的組成,及時清理ER中未折疊的蛋白質(zhì)[3]。ERAD的失調(diào)會導致各種疾病的發(fā)生,如神經(jīng)疾病和代謝綜合征[19]。從機理上講,AIDA能夠與ERAD機制中的E3連接酶HRD1相互作用,下調(diào)TAG合成途徑中的限速酶,從而改變TAG合成途徑中酶的活性,導致脂肪吸收失調(diào)[20-22]。研究表明,對于敲除AIDA基因的小鼠,雖然能夠正常發(fā)育,但成年小鼠在中性溫度條件下生長時,即使采食正常的食物,也會嚴重肥胖,喂食高脂肪食物則會加劇肥胖程度[1]。而導致小鼠肥胖的主要原因可能是敲除AIDA基因的小鼠對膳食脂肪的高效率吸收。AIDA介導的ERAD是通過選擇性下調(diào)TAG合成酶來防止脂肪過度吸收,合成和儲存的第一道防線。檢測AIDA基因在草原紅牛不同組織中的表達量發(fā)現(xiàn)AIDA基因在腎臟、肌肉和脂肪中表達量占有較高比重[23],三者均是脂代謝的重要場所[24]。

      本研究發(fā)現(xiàn),AIDA基因在5種豬群中沒有發(fā)現(xiàn)錯義突變,推測是樣本的來源單一,血緣相對較窄,也可能是樣本量不足,導致低頻的基因型未被檢測到,同時也說明AIDA基因可能較為保守。AIDA基因在大白豬背最長肌和背脂中的表達量分別是撒壩豬的1.2倍、2.55倍(P<0.01)。檢測AIDA基因在撒壩豬各組織的表達量發(fā)現(xiàn),AIDA基因在胰臟中的表達量最高。胰臟分為胰腺和胰島,胰腺分泌的胰液經(jīng)胰管進入十二指腸,其中含有胰脂肪酶,胰脂肪酶能將中性脂肪分解成甘油和脂肪酸,使得膳食脂肪被充分的消化和吸收[25]。推測豬體內(nèi)的AIDA基因可能與前人的研究結(jié)果一致,在脂肪代謝、脂肪吸收和脂肪沉積中發(fā)揮著重要作用。

      4 結(jié) 論

      AIDA基因在5個豬種間沒有發(fā)生錯義突變,有較高的保守性。屬于親水性蛋白,沒有信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)和CpG Island,有2個卷曲螺旋結(jié)構(gòu)、29個磷酸化位點和1個糖基化位點,與綿羊、山羊、黃牛的親緣關系較近。AIDA基因在大白豬背最長肌和背脂中的表達量顯著高于撒壩豬,且在胰臟中的表達量高于其他組織。

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