• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    辣椒基因組SSR引物的開發(fā)及品種純度分子鑒定

    2020-06-09 02:35:08盧霞鄧志軍劉夢華趙玉虎司龍亭李文虎阿門
    江蘇農(nóng)業(yè)科學 2020年7期
    關鍵詞:分子標記辣椒

    盧霞 鄧志軍 劉夢華 趙玉虎 司龍亭 李文虎 阿門

    摘要:辣椒是世界上重要的蔬菜作物之一,基因組簡單重復序列(simple sequence repeats,簡稱SSR)標記的開發(fā)對于辣椒分子育種和雜交種子純度檢測具有重要意義。為了檢測辣椒品種綠隴3號雜交種子的純度,基于辣椒全基因組序列開發(fā)了75對SSR標記。結果表明,只有SSR標記p50對父母本的擴增結果表現(xiàn)為帶型清晰、共顯性,且具有高多態(tài)性,可進一步用于雜交種的純度檢測。為了確保標記p50的準確性和可靠性,對其PCR產(chǎn)物進行了進一步測序。測序結果表明,在父母本中分別擴增出了251、293 bp的序列。用標記p50對綠隴3號辣椒進行純度檢測,結果顯示,種子純度為100%,鑒定結果與田間純度一致。新SSR 分子標記的開發(fā),為辣椒雜交種子純度的鑒定提供了參考,也為辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子育種研究奠定了基礎。

    關鍵詞:辣椒;SSR;分子標記;種子純度鑒定

    中圖分類號: S641.303文獻標志碼: A

    文章編號:1002-1302(2020)07-0065-04

    辣椒(Capsicum annuum L.)屬于茄科(Solanaceae)辣椒屬(Capsicum),是我國的主要蔬菜作物之一,既可鮮食,又是重要的調(diào)料。辣椒品種的好壞對其產(chǎn)量及品質(zhì)均有直接而明顯的影響,因而辣椒新品種的選育至關重要。利用雜種優(yōu)勢選育優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的雜交種,是辣椒育種中行之有效的途徑。目前,我國辣椒生產(chǎn)已經(jīng)廣泛使用雜交種,但是在實際制種過程中,由于人工去雄不及時、外來花粉干擾、母本自交、機械混雜等均影響了種子純度,因此,為了保證辣椒種子的質(zhì)量,純度鑒定是種子銷售中不可或缺的重要步驟[1]。在傳統(tǒng)的形態(tài)學角度,辣椒種子的純度鑒定主要依賴于果型、株型、絨毛等田間表型,其檢測周期長、用地多,不僅費時費工,而且易受環(huán)境因素的影響,難以滿足當年的生產(chǎn)需求。

    近年來,分子生物學的發(fā)展使種子純度鑒定進入基因水平。用分子標記鑒定種子純度采用電泳方法檢測基因組DNA的結構與組成,通過分析DNA水平上的差異來檢驗品種純度與真實性,其遺傳性穩(wěn)定、多態(tài)性高,不受發(fā)育階段、取材部位等環(huán)境因素的制約,目前DNA分子標記技術已經(jīng)被廣泛用于辣椒、番茄、茄子、黃瓜、西葫蘆、西瓜等主要蔬菜作物的鑒定與純度檢測中[2-8]。目前,在利用DNA分子標記檢測辣椒種子純度方面已有部分研究,劉子記等對辣椒雜交種簡單重復序列(simple sequence repeats,簡稱SSR)分子標記鑒定結果及表型鑒定結果進行比較分析,結果表明,篩選出的SSR分子標記可用于熱辣3號雜交種純度的快速鑒定[9];張曼用篩選出的標記CA885分別對2份辣椒品種F1代雜交種的96株單株進行純度檢測,檢測結果與田間鑒定結果一致[10]。辣椒全基因組測序的完成[11-13],不僅有助于了解辣椒基因組的結構與功能,而且對于辣椒SSR位點的開發(fā)、加速辣椒育種進程都有重要的指導作用。隨著更多辣椒SSR位點得到開發(fā)及研究應用,有望進一步推動SSR標記在種子純度檢驗、遺傳育種中的應用[14]。

    本研究以江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司選育的辣椒品種綠隴3號為試驗材料,基于辣椒基因組序列,設計開發(fā)了1批SSR引物,篩選其中具有多態(tài)性、特異性強、重復性好的SSR引物,對綠隴3號雜交種子進行分子純度鑒定,初步建立辣椒雜交種種子室內(nèi)純度鑒定的SSR體系,以期為辣椒雜交種子的純度鑒定及品種遺傳多樣性分析提供理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料

    本試驗所用辣椒品種購自江蘇綠港現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司,以綠隴3號的F1代及母本、父本種子作為試驗材料,取144粒F1代種子、各12粒父母本種子播在穴盤中,在育苗棚中育苗,待長出第1張真葉時進行試驗。

    1.2 基因組DNA的提取與檢測

    辣椒基因組DNA的提取采用改良的十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide,簡稱CTAB)法[15]。取30 mg幼嫩葉片放入2 mL離心管中,加入1個直徑為4 mm的鋼珠,蓋緊蓋子后將其放入液氮中90 s,然后用組織研磨儀磨樣;在磨好的樣中加入600 μL三氯甲烷CTAB緩沖液,55 ℃水浴20 min;12 000 r/min離心1 min,吸取400 μL 上清于干凈的1.5 mL離心管中,加入350 μL體積比為24 ∶[KG-*3]1的三氯甲烷-異戊醇溶液,充分混勻;12 000 r/min離心1 min,取300 μL上清于另1個干凈的1.5 mL離心管中,加入500 μL無水乙醇(提前于-20 ℃預冷)與50 μL乙酸銨,混勻,于-20 ℃冰箱放置2 h;13 000 r/min離心10 min,倒掉上清液,將離心管放置于室溫條件下;待離心管中無乙醇味時,加入100 μL ddH2O溶解DNA。分別用超微量紫外可見分光光度計與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提DNA的濃度與質(zhì)量。

    1.3 SSR分子標記的開發(fā)

    從茄科基因組數(shù)據(jù)庫(Sol Genomics Network)中下載辣椒的全基因組序列,通過Pilot Edit軟件與SSR搜索工具SSR Hunter軟件在基因組序列中有目的地搜索包含SSR位點的序列,以二、三、四、五、六核苷酸基序(motif)的最少重復次數(shù)在10次以上作為標準進行SSR位點序列的選擇。用Primer 5設計引物,引物設計參數(shù)如下:引物長度為18~30 bp,最適長度為22 bp,正反引物的長度相差不超過3 bp,退火溫度為50~60 ℃,GC含量在40%左右,PCR預擴增產(chǎn)物大小為100~300 bp。引物由浙江尚亞生物技術有限公司合成。

    1.4 PCR擴增與檢測

    PCR采用15 μL體系,包含1 μL DNA模板、7.5 μL Taq Mix、各1 μL正反向引物、4.5 μL ddH2O。PCR擴增條件如下:95 ℃預變性5 min;94 ℃ 變性60 s,58 ℃退火60 s,72 ℃延伸60 s,35個循環(huán);72 ℃ 延伸2 min,16 ℃終止反應。

    擴增完成后,將擴增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠上電泳,電泳完成后,進行硝酸銀溶液染色、氫氧化鈉甲醛溶液顯色。在自然光下,對每對引物擴增出來的條帶進行判斷,當某對引物的擴增條帶在父母本中具有多態(tài)性,并在F1代中同時顯示出父母本的特征條帶時,則確定該引物可用于純度鑒定,否則表明該引物不適合用于鑒定雜交種的純度。

    1.5 SSR標記的克隆與測序

    為了驗證所選標記片段的大小,對父母本進行PCR擴增,對擴增產(chǎn)物進行膠回收,然后連接至pMD19-T載體上,送至浙江尚亞生物技術有限公司進行測序。

    2 結果與分析

    2.1 多態(tài)性引物的篩選

    利用筆者所在公司自主開發(fā)的75對SSR標記對辣椒品種綠隴3號及其父母本進行PCR擴增,對擴增產(chǎn)物進行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳。由圖1可以看出,標記p50在綠隴3號父母本中都能擴增出清晰的條帶,且在綠隴3號中表現(xiàn)為父母本帶型互補的條帶。重復試驗結果表明,標記p50擴增的帶型穩(wěn)定、多態(tài)性高,且為共顯性標記。

    2.2 新開發(fā)標記p50的序列信息及相應測序結果

    2.2.1 標記p50的序列信息 以栽培辣椒品種Zunla-1全基因組序列開發(fā)的標記p50的序列信息見表1。

    2.2.2 標記p50擴增DNA的測序結果 為了在分子水平上確定所選SSR標記的準確性與可靠性,對用標記p50擴增的DNA片段進行了測序。由圖2的測序結果看出,綠隴3號父母本存在42 bp的序列差異,在其母本中擴增出了293 bp的序列,而在其父本中擴增出了251 bp的序列,父母本對應的差異序列為(GAG)1與(AAG)13。該結果與聚丙烯酰胺凝膠電泳結果完全一致,因此,本試驗選用標記p50來鑒定綠隴3號辣椒的種子純度。

    2.3 雜交種綠隴3號的純度鑒定

    隨機選取144粒綠隴3號的種子,在育苗棚中育苗后,提取其葉片基因組DNA,并以標記p50作為引物進行SSR擴增,檢測辣椒綠隴3號的純度。結果表明,綠隴3號所有種子均呈父母本互補帶型(圖3),雜交種子的純度達到100%。進行大田種植后,根據(jù)植株的表型鑒定結果,在136株綠隴3號群體中,有2株的表型表現(xiàn)與親本一致,田間鑒定得到的種子純度為98.5%,與分子標記鑒定的結果基本一致。

    3 討論

    種子純度鑒定是商業(yè)育種中必不可少的重要步驟,是衡量種子質(zhì)量的關鍵。辣椒是我國的重要蔬菜作物之一,每年通過傳統(tǒng)的田間試驗來鑒定其純度雖然有效,但是效率太低,不僅費時費力,且易受外界環(huán)境因素的影響。而利用分子標記技術,可以快速高效地完成種子純度鑒定,不但節(jié)約了種子公司的成本,為市場提供了優(yōu)質(zhì)種子,還對我國的辣椒育種具有重要的指導意義[1]。隨著分子生物學技術的飛速發(fā)展,分子標記技術已經(jīng)成為作物品種真實性和純度鑒定的發(fā)展方向。目前,SSR分子標記技術在蔬菜作物品種鑒定與純度檢測方面已得到了廣泛應用。近年來,國內(nèi)外學者對辣椒全基因組測序的完成,為SSR標記的開發(fā)提供了新途徑,使引物開發(fā)費用逐漸降低[11,13],更多的辣椒SSR位點被開發(fā),將進一步推動SSR標記在種子純度檢驗、遺傳育種及其他研究領域中的應用。

    本研究基于栽培辣椒品種Zunla-1全基因組序列信息,開展了辣椒SSR位點的挖掘與設計,開發(fā)了75對SSR引物,并篩選出了1對特異性條帶清晰、多態(tài)性強、便于識別、方便對辣椒雜交種綠隴3號進行種子純度分析的SSR引物p50。新開發(fā)的標記p50在基因組中的起始位點為第606399 bp,重復單元為AAG,重復了26次。但是有趣的是,對綠隴3號親本的測序結果顯示,雙親存在42 bp的序列差異,且母本序列比基因組參考序列多12個GAA與1個GAG序列,而父本序列較參考序列少1個GAA序列,這與p50的重復單元及數(shù)量并不相同,表明GAG可能是1個高變異位點,因而在不同辣椒品種中的存在模式有差異。本研究結果可用于親緣關系較近的種質(zhì)資源遺傳分析研究。

    本研究用標記p50對綠隴3號及其父母本進行SSR擴增后,能夠準確地將父母本、雜交種及假雜種區(qū)分開來,綠隴3號種子的純度為100%,與田間表型鑒定的結果高度一致。為了確保鑒定結果的準確性和可靠性,對綠隴3號父母本的擴增產(chǎn)物進行測序后,在母本中檢測出了293 bp的序列,在父本中檢測出了251 bp的序列,該測序結果與電泳結果完全一致,表明新開發(fā)的標記p50符合綠隴3號的DNA特點,篩選出的引物針對性強,適用于綠隴3號辣椒雜交種純度的鑒定。綜合分析可知,本研究結果為親緣關系較近的辣椒種質(zhì)資源遺傳多樣性分析及分子標記輔助育種研究奠定了基礎。

    參考文獻:

    [1]白占兵,李雪峰,戴雄澤. 利用SSR分子標記建立辣椒純度鑒定體系[J]. 辣椒雜志,2010(1):32-34.

    [2]王 飛,姚明華,尹延旭,等. 辣椒SSR多態(tài)性引物的篩選及品種純度鑒定[C]//中國園藝學會.中國園藝學會2017年論文摘要集. 2017:126.

    [3]盧國強,盧海林,潘學春,等. 辣椒品種鎮(zhèn)研22種子純度的SSR分子比較鑒定[J]. 辣椒雜志,2017(2):33-35.

    [4]張錄霞,甘中祥,李倍金,等. 利用InDel標記鑒定加工番茄雜交種純度[J]. 分子植物育種,2016,14(6):1533-1537.

    [5]劉 軍,周曉慧,莊 勇. 茄子雜交品種種子純度的SSR分子標記鑒定[J]. 分子植物育種,2013,11(6):790-794.

    [6]周勝軍,張 鵬,朱育強,等. 黃瓜‘浙秀1號種子純度的SSR鑒定[J]. 分子植物育種,2013,11(5):557-561.

    [7]林春晶,張春寶,董英山. DNA分子標記在作物雜交種純度鑒定中的應用[J]. 分子植物育種,2015,13(3):702-710.

    [8]李超漢,劉 莉,劉 翔,等. 基于SSR標記的5個西瓜新品種純度鑒定及特異性分析的研究[J]. 中國農(nóng)學通報,2015,31(33):177-185.

    [9]劉子記,李靜婷,楊 衍,等. 辣椒雜交種SSR分子標記鑒定及表型比較分析[J]. 華北農(nóng)學報,2014,29(1):69-72.

    [10]張 曼. 基于分子標記的辣椒雜交種真實性和純度的檢驗[D]. 鄭州:河南農(nóng)業(yè)大學,2012.

    [11]Qin C,Yu C S,Shen Y,et al. Whole-genome sequencing of cultivated and wild peppers provides insights into Capsicum domestication and specialization[J]. PNAS,2014,111(14):5135-5140.

    [12]Lee J M,Nahm S H,Kim Y M,et al. Characterization and molecular genetic mapping of microsatelliite loci in pepper[J]. Theoretical and Applied Genetics,2004,108(4):619-627.

    [13]Kim S,Park M,Yeom S I,et al. Genome sequence of the hot pepper provides insights into the evolution of pungency in Capsicum species[J]. Nature Genetics,2014,46(3):270-278.

    [14]杜培粉. 14個辣椒雜交種純度鑒定的SSR引物篩選[J]. 長江蔬菜,2017(14):46-49.

    [15]Aljanabi S M,Martinez I. Universal and rapid salt-extraction of high quality genomic DNA for PCR-based techniques[J]. Nucleic Acids Research,1997,25(22):4692-4693.

    猜你喜歡
    分子標記辣椒
    關于辣椒的快問快答
    原來,你還是這樣的辣椒
    你的辣椒結出果實了嗎?
    辣椒也瘋狂
    揀辣椒
    中外文摘(2020年9期)2020-06-01 13:47:56
    蘿卜抽薹相關SRAP分子標記篩選與分析
    軟棗獼猴桃性別相關的SRAP分子標記
    軟棗獼猴桃性別相關的SRAP分子標記
    大白菜種質(zhì)資源抗根腫病基因CRa和CRb的分子標記鑒定與分析
    玉米大斑病的研究進展
    一级毛片女人18水好多| 国产视频内射| 操出白浆在线播放| √禁漫天堂资源中文www| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 精品久久久久久久久久久久久| 麻豆一二三区av精品| 亚洲欧美日韩东京热| 黑人巨大精品欧美一区二区mp4| 精华霜和精华液先用哪个| 国产成年人精品一区二区| 免费人成视频x8x8入口观看| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 在线观看www视频免费| 在线永久观看黄色视频| 在线观看午夜福利视频| 精品久久久久久久久久久久久| 激情在线观看视频在线高清| 欧美黑人精品巨大| 午夜亚洲福利在线播放| 国产69精品久久久久777片 | 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 亚洲片人在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 亚洲精品国产精品久久久不卡| 黄片大片在线免费观看| 久久久久久久久免费视频了| 妹子高潮喷水视频| 国产精品一区二区三区四区久久| 欧美色视频一区免费| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 日本三级黄在线观看| 欧美精品啪啪一区二区三区| 色在线成人网| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 桃色一区二区三区在线观看| 国产1区2区3区精品| 精品欧美一区二区三区在线| 精品久久久久久久久久久久久| 日本免费a在线| 18禁美女被吸乳视频| 国产91精品成人一区二区三区| av在线播放免费不卡| 村上凉子中文字幕在线| 国产免费av片在线观看野外av| 香蕉av资源在线| 亚洲片人在线观看| 久久久国产欧美日韩av| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产1区2区3区精品| 成人欧美大片| 看片在线看免费视频| 老司机深夜福利视频在线观看| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 精品午夜福利视频在线观看一区| 老司机午夜福利在线观看视频| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲精品中文字幕一二三四区| 久久久精品欧美日韩精品| 国产乱人伦免费视频| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲午夜理论影院| 国产乱人伦免费视频| 亚洲av片天天在线观看| 国产一区二区三区视频了| 悠悠久久av| 两个人的视频大全免费| 怎么达到女性高潮| www国产在线视频色| 一本久久中文字幕| 成年人黄色毛片网站| 国产精品 国内视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 91av网站免费观看| 精品国产亚洲在线| 国产精品一及| 久9热在线精品视频| 国产1区2区3区精品| www日本在线高清视频| 99久久综合精品五月天人人| 日韩欧美在线乱码| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 国产不卡一卡二| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 大型黄色视频在线免费观看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美激情久久久久久爽电影| 久久婷婷成人综合色麻豆| av欧美777| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 亚洲欧美日韩高清专用| 色av中文字幕| 日本一本二区三区精品| 精品福利观看| 一a级毛片在线观看| 精品免费久久久久久久清纯| 精品国产乱码久久久久久男人| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 欧美黑人欧美精品刺激| 一夜夜www| 亚洲九九香蕉| 啦啦啦观看免费观看视频高清| 在线免费观看的www视频| 神马国产精品三级电影在线观看 | 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品一区av在线观看| 国产精品,欧美在线| 欧美成人一区二区免费高清观看 | 日韩有码中文字幕| 在线观看免费日韩欧美大片| 麻豆成人午夜福利视频| 99久久综合精品五月天人人| 怎么达到女性高潮| 又黄又粗又硬又大视频| 在线观看免费视频日本深夜| videosex国产| 极品教师在线免费播放| 一本久久中文字幕| 亚洲免费av在线视频| 国产av麻豆久久久久久久| 女同久久另类99精品国产91| 亚洲色图av天堂| 日本黄大片高清| 99在线人妻在线中文字幕| 女警被强在线播放| 老司机深夜福利视频在线观看| 日韩精品免费视频一区二区三区| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 观看免费一级毛片| 久久香蕉精品热| 十八禁网站免费在线| 无人区码免费观看不卡| 岛国在线观看网站| 一二三四社区在线视频社区8| 成人av在线播放网站| 中文字幕av在线有码专区| 欧美日本亚洲视频在线播放| 日本 欧美在线| 国产精品一区二区免费欧美| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站 | www国产在线视频色| 老司机在亚洲福利影院| 国产欧美日韩一区二区三| 制服诱惑二区| 国产熟女xx| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 老鸭窝网址在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 欧美日韩黄片免| av有码第一页| 亚洲免费av在线视频| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 国产91精品成人一区二区三区| 亚洲五月婷婷丁香| 日日爽夜夜爽网站| 亚洲真实伦在线观看| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 日本在线视频免费播放| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜激情福利司机影院| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 色综合亚洲欧美另类图片| a在线观看视频网站| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲精品中文字幕在线视频| 午夜福利免费观看在线| 性欧美人与动物交配| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 中亚洲国语对白在线视频| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 亚洲专区国产一区二区| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美成狂野欧美在线观看| www.精华液| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 一a级毛片在线观看| a级毛片在线看网站| 久久午夜综合久久蜜桃| 嫩草影视91久久| 91成年电影在线观看| 国产真实乱freesex| 99热这里只有是精品50| 国产高清视频在线播放一区| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 久久热在线av| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲精品色激情综合| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 国产免费男女视频| 国产精品久久久人人做人人爽| 高清毛片免费观看视频网站| 一区二区三区国产精品乱码| 亚洲国产看品久久| 最近在线观看免费完整版| 看片在线看免费视频| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 欧美久久黑人一区二区| 国产男靠女视频免费网站| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 午夜成年电影在线免费观看| 三级国产精品欧美在线观看 | 精品乱码久久久久久99久播| 极品教师在线免费播放| 最近最新免费中文字幕在线| 曰老女人黄片| 在线国产一区二区在线| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 亚洲电影在线观看av| 美女午夜性视频免费| 黄色视频,在线免费观看| 麻豆成人午夜福利视频| 九色国产91popny在线| 婷婷亚洲欧美| 日韩欧美精品v在线| АⅤ资源中文在线天堂| 99国产精品一区二区蜜桃av| 在线看三级毛片| 日日夜夜操网爽| 亚洲中文字幕日韩| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 不卡一级毛片| 亚洲七黄色美女视频| 国内精品久久久久精免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 中亚洲国语对白在线视频| 国产精品野战在线观看| 久久99热这里只有精品18| 亚洲人成电影免费在线| 国产精品一区二区精品视频观看| 亚洲18禁久久av| 99久久精品国产亚洲精品| 欧美日韩精品网址| 亚洲国产欧美人成| 欧美久久黑人一区二区| 国产主播在线观看一区二区| 首页视频小说图片口味搜索| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 最近最新免费中文字幕在线| 久久精品国产综合久久久| 在线永久观看黄色视频| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 欧美日韩乱码在线| 午夜精品一区二区三区免费看| av天堂在线播放| av视频在线观看入口| 欧美最黄视频在线播放免费| 久久这里只有精品中国| 首页视频小说图片口味搜索| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆 | 特大巨黑吊av在线直播| 欧美+亚洲+日韩+国产| 18美女黄网站色大片免费观看| 国产亚洲精品综合一区在线观看 | 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲成人国产一区在线观看| 欧美中文综合在线视频| 美女大奶头视频| 国产真实乱freesex| 午夜日韩欧美国产| 欧美一区二区国产精品久久精品 | 精华霜和精华液先用哪个| 麻豆国产av国片精品| 国产黄片美女视频| 一夜夜www| 久久久久久久久中文| 欧美午夜高清在线| 人妻久久中文字幕网| 一进一出抽搐gif免费好疼| 69av精品久久久久久| 亚洲中文日韩欧美视频| 哪里可以看免费的av片| 中文字幕最新亚洲高清| 在线观看一区二区三区| 狂野欧美激情性xxxx| 国产爱豆传媒在线观看 | 18禁观看日本| 成年人黄色毛片网站| 一本大道久久a久久精品| 天堂√8在线中文| www.熟女人妻精品国产| 国产av一区二区精品久久| 亚洲人成伊人成综合网2020| 18禁观看日本| 成人av在线播放网站| 小说图片视频综合网站| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 色精品久久人妻99蜜桃| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美不卡视频在线免费观看 | 国产视频一区二区在线看| 哪里可以看免费的av片| 99精品在免费线老司机午夜| 午夜免费观看网址| 欧美中文综合在线视频| 久久这里只有精品中国| www国产在线视频色| 手机成人av网站| 国产黄a三级三级三级人| 成熟少妇高潮喷水视频| 动漫黄色视频在线观看| 国产高清有码在线观看视频 | 亚洲熟妇熟女久久| 精品久久久久久久久久免费视频| 深夜精品福利| 亚洲avbb在线观看| 午夜福利欧美成人| 制服诱惑二区| 精品高清国产在线一区| 美女午夜性视频免费| 丝袜美腿诱惑在线| 午夜福利在线在线| 99热只有精品国产| 黄频高清免费视频| 首页视频小说图片口味搜索| 99久久99久久久精品蜜桃| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美在线一区亚洲| 国产成人av激情在线播放| 大型黄色视频在线免费观看| 日韩欧美免费精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 日本黄大片高清| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 午夜久久久久精精品| 91字幕亚洲| 国产成人精品久久二区二区91| 国产成人啪精品午夜网站| 色哟哟哟哟哟哟| 叶爱在线成人免费视频播放| 久久午夜综合久久蜜桃| 99国产极品粉嫩在线观看| 在线观看午夜福利视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 午夜福利欧美成人| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 床上黄色一级片| 中出人妻视频一区二区| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产一区二区激情短视频| www.精华液| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 母亲3免费完整高清在线观看| 最近最新中文字幕大全电影3| 日本黄大片高清| 制服丝袜大香蕉在线| 美女扒开内裤让男人捅视频| 午夜视频精品福利| 人成视频在线观看免费观看| 国产视频内射| 国产亚洲av高清不卡| 久久久久久久午夜电影| 久久香蕉激情| 精品高清国产在线一区| 国产成人系列免费观看| 亚洲av熟女| 九色国产91popny在线| 久久欧美精品欧美久久欧美| 51午夜福利影视在线观看| 日本在线视频免费播放| 国产精品综合久久久久久久免费| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 欧美日韩黄片免| 免费看美女性在线毛片视频| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲熟女毛片儿| 视频区欧美日本亚洲| 99热这里只有精品一区 | 日韩有码中文字幕| 韩国av一区二区三区四区| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 在线观看日韩欧美| 国产午夜精品论理片| www日本黄色视频网| 1024手机看黄色片| 欧美zozozo另类| tocl精华| 在线看三级毛片| 麻豆成人av在线观看| 午夜福利免费观看在线| 国产精品永久免费网站| 身体一侧抽搐| 国产黄色小视频在线观看| 久久人妻av系列| av天堂在线播放| 国产欧美日韩一区二区精品| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产精品一及| 久久久国产成人精品二区| 免费在线观看影片大全网站| 日本免费a在线| 高清在线国产一区| svipshipincom国产片| 欧美性长视频在线观看| 国产免费av片在线观看野外av| 在线观看午夜福利视频| 99国产精品99久久久久| 日韩精品免费视频一区二区三区| 高清毛片免费观看视频网站| 亚洲午夜理论影院| 久久99热这里只有精品18| 亚洲人成伊人成综合网2020| 日本熟妇午夜| 久久久久久国产a免费观看| 精品久久久久久久久久久久久| 久久欧美精品欧美久久欧美| 国产成人影院久久av| netflix在线观看网站| 两个人免费观看高清视频| 一进一出抽搐动态| av福利片在线观看| 中文字幕熟女人妻在线| 91大片在线观看| 亚洲美女黄片视频| 这个男人来自地球电影免费观看| 国产精品亚洲美女久久久| 亚洲精品粉嫩美女一区| 久久午夜综合久久蜜桃| 精华霜和精华液先用哪个| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 一级黄色大片毛片| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 国产亚洲精品一区二区www| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲专区国产一区二区| 一本一本综合久久| 男人舔女人的私密视频| 首页视频小说图片口味搜索| 欧美在线黄色| 日韩欧美国产在线观看| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产三级中文精品| 欧美3d第一页| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 曰老女人黄片| 一个人观看的视频www高清免费观看 | 久久久精品大字幕| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 欧美高清成人免费视频www| 99国产综合亚洲精品| 欧美乱色亚洲激情| 狠狠狠狠99中文字幕| 免费无遮挡裸体视频| 久久精品成人免费网站| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲成人久久爱视频| 999久久久国产精品视频| 在线看三级毛片| 在线视频色国产色| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 国产野战对白在线观看| 好男人在线观看高清免费视频| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品一区二区三区av网在线观看| 午夜视频精品福利| www.www免费av| 啦啦啦韩国在线观看视频| av在线播放免费不卡| 18美女黄网站色大片免费观看| 怎么达到女性高潮| 18禁国产床啪视频网站| av视频在线观看入口| 观看免费一级毛片| 日本黄大片高清| 久久香蕉国产精品| 很黄的视频免费| 手机成人av网站| 丁香欧美五月| 久久精品国产亚洲av高清一级| xxxwww97欧美| 国产亚洲精品av在线| 日韩精品免费视频一区二区三区| 99精品久久久久人妻精品| 欧美性长视频在线观看| 精品久久久久久久毛片微露脸| 三级毛片av免费| www国产在线视频色| 国产午夜福利久久久久久| 免费看美女性在线毛片视频| 久久午夜综合久久蜜桃| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| 香蕉国产在线看| av福利片在线观看| 欧美日韩乱码在线| 国产激情欧美一区二区| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 午夜激情福利司机影院| 日韩欧美 国产精品| www.www免费av| 国产精品免费视频内射| 91av网站免费观看| 中文字幕av在线有码专区| 久久香蕉国产精品| 午夜精品一区二区三区免费看| av欧美777| 欧美一级毛片孕妇| 久久欧美精品欧美久久欧美| 久久香蕉激情| 不卡一级毛片| 国模一区二区三区四区视频 | 亚洲国产欧美网| 国产精品日韩av在线免费观看| 免费观看精品视频网站| 日韩欧美三级三区| √禁漫天堂资源中文www| 欧美av亚洲av综合av国产av| 国产日本99.免费观看| 好男人电影高清在线观看| 久久精品91无色码中文字幕| 成人手机av| 少妇熟女aⅴ在线视频| 俄罗斯特黄特色一大片| 搞女人的毛片| 麻豆国产97在线/欧美 | 国产激情欧美一区二区| 国产高清视频在线观看网站| 中文字幕久久专区| 久久久久久大精品| 久久精品国产综合久久久| 国产伦人伦偷精品视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 男女视频在线观看网站免费 | 成人手机av| 欧美一区二区精品小视频在线| 亚洲人成伊人成综合网2020| 国产成人系列免费观看| 亚洲国产精品久久男人天堂| 精品乱码久久久久久99久播| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产精品日韩av在线免费观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久伊人香网站| 日本 av在线| 成熟少妇高潮喷水视频| 国产又色又爽无遮挡免费看| 成人国语在线视频| 身体一侧抽搐| 午夜福利视频1000在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| av在线天堂中文字幕| 亚洲午夜理论影院| 一个人免费在线观看的高清视频| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 亚洲无线在线观看| 亚洲国产欧美网| 18禁美女被吸乳视频| 国产精品1区2区在线观看.| av有码第一页| 人人妻人人看人人澡| 一个人免费在线观看电影 | 一级黄色大片毛片| 一边摸一边抽搐一进一小说| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 亚洲成人久久性| tocl精华| 欧美+亚洲+日韩+国产| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 久久精品人妻少妇| 99久久国产精品久久久| 午夜福利在线在线| 美女 人体艺术 gogo| 男人舔女人的私密视频| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 99在线视频只有这里精品首页| 成人特级黄色片久久久久久久| 午夜福利在线观看吧| 婷婷亚洲欧美| 男女床上黄色一级片免费看| 成人欧美大片| 国产高清激情床上av| 日本a在线网址| 久久 成人 亚洲| 欧美黑人欧美精品刺激| 少妇的丰满在线观看| 男人舔奶头视频| 午夜精品在线福利| 757午夜福利合集在线观看| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲av成人av| 亚洲avbb在线观看| 午夜福利欧美成人| 久久香蕉激情| 一二三四在线观看免费中文在| 久久精品91无色码中文字幕| 国产高清videossex| 我的老师免费观看完整版| 久久久久国内视频| 精品一区二区三区av网在线观看| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图| 亚洲美女黄片视频| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲九九香蕉| 一级毛片精品| 视频区欧美日本亚洲| 欧美久久黑人一区二区|