黑水虻幼蟲抗菌肽粗提物敏感腫瘤細胞株篩選及溶血作用研究

馮群，高嘉敏，夏嬙

(遵義醫(yī)科大學珠海校區(qū)/貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地，廣東 珠海519041)

腫瘤是導致人類死亡的主要原因，預計到2035 年每年新增腫瘤病例2 400 萬，死亡人數(shù)將突破1 300 萬［1］。腫瘤的傳統(tǒng)治療方法以手術和放化療為主，不良反應大，且存在復發(fā)、多藥耐藥以及機體免疫力低下的風險，進一步增加了腫瘤治療的難度。其中腫瘤普遍存在的多藥耐藥及如何提高藥物靶向性一直是研究的熱點和難點，對此學者們將腫瘤藥物的研發(fā)轉向天然生物產物，期望能夠找到一種新的、高效無毒的抗腫瘤藥物替代或部分替代常規(guī)化療藥物［2］。天然多肽分子抗菌肽除具備抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗寄生蟲、免疫調節(jié)、傷口愈合以及中和體內毒素等活性外，還具有抗腫瘤活性，如LL-37 是唯一一個來自人類的免疫防御肽，其可誘導結腸癌細胞發(fā)生凋亡［3］;SALF、Pardaxin 和HPRP-A1抗菌肽能誘導宮頸癌HeLa 細胞凋亡［4-6］;抗菌肽17BIPHE2 可顯著抑制肺腺癌A549 細胞增殖［7］;蜘蛛來源肽Gomesin 可抑制小鼠黑色素瘤、乳腺癌和結腸癌細胞增殖，且對正常細胞無明顯影響［8-9］。以上研究均表明抗菌肽具有抗癌活性。

黑水虻black soldier fly，Hermetia illucens L.(Diptera:Stratiomyidae)，學名亮斑扁角水虻，是一種與蠅蛆、黃粉蟲等齊名的雙翅目水虻科的重要資源昆蟲，全球分布廣泛［10］，長期暴露的生存環(huán)境使其形成了強大的先天免疫系統(tǒng)。對黑水虻來源抗菌肽的研究始于2013 年［11］，目前黑水虻抗菌肽已在大腸埃希菌和畢赤酵母X-33 中成功表達，并表現(xiàn)出對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及真菌良好的抑菌活性［12-13］，與其 他 昆 蟲 來 源 肽 如 天 蠶 素［14］、Bmattacin 2［15］、cecropins［16］、ABP-dHC-A-K［17］、黃粉蟲防御素［18］以及蜂毒素［19］等的作用一致，表明黑水虻抗菌肽在未來醫(yī)藥研發(fā)方面具備巨大潛能。然而，黑水虻抗菌肽抑癌活性的研究鮮見報道，本研究以黑水虻幼蟲抗菌肽為研究對象，探討其抗癌及溶血效應，旨在為未來抗腫瘤藥物的研發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 黑水虻蟲卵來自珠海市農業(yè)科學研究院;雄性豚鼠，4 只，2 ～3 月齡、體重300 ～350 g，合格證號:SCXK(京)2016-0002，由遵義醫(yī)學院珠海校區(qū)實驗動物研究中心提供。

1.1.2 細胞株 結腸癌細胞株(HCT-8)、肺腺癌細胞株(A549)、宮頸癌細胞株(HeLa)、卵巢癌細胞株(SKOV3)以及正常人胚腎細胞株(HEK293)標準株購于中國科學院上海ATCC 細胞庫。

1.1.3 主要試劑 5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)購于美國Sigma 公司;RPMI-1640、DMEM(Dulbecco's modification of Eagle' s medium Dulbecco)、MEM(Minimum Essential Medium)、McCoy's 5A (McCoy's 5a medium)培養(yǎng)基以及氨芐青霉素、鏈霉素產品購于澳大利亞Gibco 公司;胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;CCK(cell counting kit)-8試劑盒購自日本同仁公司，批號:LF673。

1.1.4 主要儀器 高速冷凍離心機(3K15，美國Thermo fisher 公司);精密電子天平(BSA-124S 型，德國賽多利斯科學儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(IX71，日本OLYMPUS 公司);二氧化碳培養(yǎng)箱(HF90，中國Heal Force 公司);全自動酶標儀(Elx-800 型，德國萊卡公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑水虻抗菌肽粗提物的誘導提取 抗菌肽的誘導提取參照夏嬙等［11］的提取方法，用金黃色葡萄球菌誘導黑水虻5 齡幼蟲，常規(guī)飼養(yǎng)24 h 后采用斷頭取血法收集幼蟲血淋巴。將收集的血淋巴于4 ℃、13 225 ×g 離心15 min，輕輕吸取上清后轉移至50 mL 超濾管中(規(guī)格:10 kD)，4 ℃、5 000 ×g 離心35 min，然后轉移濾液至3 kD 的超濾管中，4 ℃、5 000 ×g 離心20 min，截留部分即抗菌肽粗提液。透析24 h 除去部分鹽和色素，于-80 ℃冰箱過夜，真空冷凍干燥，收集抗菌肽粗提物粉末于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞的體外生長曲線 ①取對數(shù)期HCT-8、A549、HeLa、SKOV3 和HEK293 細胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640(HCT-8 和A549)、MEM(HeLa)、McCoy's 5A(SKOV3)和DMEM(HEK293)培養(yǎng)基中，待細胞貼壁達80%時棄除培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，用0.9%氯化鈉注射液制成細胞懸液，并調節(jié)細胞密度為7 ×104個/mL，以100 μL/孔的量將細胞懸液鋪于96 孔板中，分別設置實驗組和空白對照組，每組4 個復孔，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 d。②每日取出需要檢測的96 孔板，每孔加入10 μL CCK-8，再放入37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，用酶標儀檢測波長490 nm處的吸光度值，并以時間為橫坐標，A 值為縱坐標，繪制每株細胞的生長曲線。

1.2.3 敏感腫瘤細胞株篩選 ①細胞鋪板步驟同

1.2.2。②培養(yǎng)24 h 后，倒置顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，當細胞生長狀態(tài)良好時，吸出原培養(yǎng)基，分別向每株細胞的實驗組添加100 μL 濃度為12. 5、25、50、100、200 和400 mg/L 的黑水虻抗菌肽粗提物溶液(常規(guī)培養(yǎng)基配制)，陰性對照組則加入100 μL常規(guī)培養(yǎng)基，每組設4 個復孔，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。③作用24 h 后，向每孔細胞加入10 μL CCK-8檢測試劑，放回細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1.5 h，之后用酶標儀檢測波長為490 nm 處的吸光度值。計算出每株細胞的抑制率，具體公式:抑制率(%)=A(陰性對照組)- A(實驗組)/A(陰性對照)×100%。比較4 株腫瘤細胞的增殖抑制率，篩選出對黑水虻抗菌肽粗提物較敏感的腫瘤細胞株。④篩選出敏感腫瘤細胞株后，在相同條件下與陽性對照藥物5-FU 比較。

1.2.4 黑水虻抗菌肽粗提物對正常細胞影響 檢測抗菌肽粗提物對正常細胞HEK293 的毒性作用，細胞培養(yǎng)、鋪板及抗菌肽粗提物濃度設置步驟同1.2.3。

1.2.5 黑水虻抗菌肽粗提物對紅細胞溶血的影響

①采用心臟采血法采集健康豚鼠血液2 mL，離心收集血細胞，輕輕吸出紅細胞層至另外一支潔凈試管，磷酸鹽緩沖液洗滌4 次，用0.9%氯化鈉注射液配成2%的紅細胞懸液。②用0.9%氯化鈉注射液配制濃度為1 000 mg/L 抗菌肽粗提物，再用0.9%氯化鈉注射液對粗提物溶液進行倍比稀釋，實驗濃度設置為62.5、125、250、500、1 000 mg/L。③取出一塊96 孔板，所需孔先加入50 μL 2%的紅細胞懸液，向實驗組加入50 μL 不同濃度的抗菌肽粗提物，使實驗組抗菌肽粗提物的終濃度為31.25、62.5、125、250、500 mg/L，陰性對照組加入等量0.9%氯化鈉注射液，陽性對照組加入等量純水，每組設置4 個復孔。④加完樣，輕輕晃動96 孔板使細胞均勻分布，放入37 ℃的培養(yǎng)箱中孵育1 h，取出后1 000 ×g 離心5 min，然后吸出60 μL 上清至新的96 孔板中，利用酶標儀測定414 nm 處的吸光度A 值。溶血率(%)=〔A(實驗孔)-A(陰性孔)〕/〔A(陽性孔)-A(陰性孔)〕×100%。

1.3 檢測指標 繪制4 種腫瘤細胞和正常細胞的生長曲線;比較黑水虻抗菌肽粗提物對4 種腫瘤細胞和正常細胞的抑制情況;在抑制率最高的濃度下，對各組細胞的抑制情況;比較黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對HCT-8 細胞的抑制作用;觀察黑水虻抗菌肽粗提物對紅細胞的溶血作用。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，符合正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 4 株癌細胞和1 株正常細胞的生長曲線 4 株癌細胞(A549、HeLa、SKOV3、HCT-8)和1 株正常細胞(HEK293)均在培養(yǎng)1 d 后進入對數(shù)生長期，3 d達到峰值，之后逐漸下降。故選取培養(yǎng)1 d 的細胞進行傳代及后續(xù)實驗。見圖1。

圖1 5 株細胞的生長曲線

2.2 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物對5 種細胞的增殖抑制率 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物對HCT-8、A549、SKOV3、HeLa 4 種細胞均有一定的抑制作用(P ＜0.05)，且隨著濃度的增加，抑制率逐漸升高，其中400 mg/L 濃度下的黑水虻抗菌肽粗提物對腫瘤細胞的抑制率最大。不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物對HEK293 無抑制作用(P ＞0. 05)。在400 mg/L 濃度下，黑水虻抗菌肽粗提物對HCT-8、A549、SKOV3、HeLa 以及HEK293 5 種細胞的抑制率不同(F=54.495，P ＜0.001)，其中對HCT-8 細胞的抑制率最高，對HEK293 的抑制率最低。見表1。

表1 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物作用24 h對5 種細胞的增殖抑制率 (%，±s)

表1 不同濃度的黑水虻抗菌肽粗提物作用24 h對5 種細胞的增殖抑制率 (%，±s)

a 與12.5 mg/L 組比較，P ＜0.05

HCT-8 A549 SKVO3 HeLa HEK293 12.5 mg/L 組 5.68±1.21 7.71±1.66 8.25±2.05 8.67±0.55 1.67±2.65 25 mg/L 組 6.09±1.77a 8.14±1.74a 13.50±1.58a 10.64±0.33a 3.33±2.23 50 mg/L 組 8.07±1.02a 8.18±1.21a 10.95±0.91a 12.26±0.31a 3.35±2.62 100 mg/L 組 15.48±1.44a 8.54±0.75a 18.28±2.85a 12.17±0.52a 5.33±3.93 200 mg/L 組 25.81±2.04a 8.55±0.94a 18.69±1.69a 13.84±0.61a 8.18±2.89 400 mg/L 組 41.76±7.34a 10.72±0.87a 21.06±0.82a 20.81±0.21a 9.93±2.07 F 值組別196.596 6.191 62.680 11.066 2.442 P 值＜0.001 0.005 ＜0.001 ＜0.001 0.074

2.3 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對HCT-8 細胞的抑制作用比較 黑水虻抗菌肽粗提物在12.5、25、50、100 mg/L 時對HCT-8 細胞的抑制率與50 mg/L 的5-FU 對HCT-8 細胞的抑制率比較差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，且粗提物的作用較5-FU 弱。當黑水虻抗菌肽粗提物濃度為200 mg/L 時，與5-FU 處理組比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。黑水虻抗菌肽粗提物濃度為400 mg/L 時，對HCT-8 細胞的抑制率較5-FU 處理組高(P ＜0.05)。見表2。

表2 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對HCT-8細胞的體外增殖作用比較 (%，±s)

表2 黑水虻抗菌肽粗提物和5-FU 對HCT-8細胞的體外增殖作用比較 (%，±s)

5-FU:5-氟尿嘧啶;a 與5-FU 處理組比較，P ＜0.05

組別 抑制率50 mg/L 5-FU 組 24.58 ±0.88 12.5 mg/L 組 5.57 ±0.85a 25 mg/L 組 6.09 ±2.50a 50 mg/L 組 8.07 ±1.20a 100 mg/L 組 15.38 ±1.18a 200 mg/L 組 25.82 ±2.26 400 mg/L 組 41.77 ±2.13a F 值176.396 P 值＜0.001

2.4 黑水虻抗菌肽粗提物對紅細胞的溶血作用抗菌肽粗提物的濃度為0、31. 25、62. 5、125、250、500 mg/L 時的溶血率分別為0、(0.16 ±0.11)%、(0. 20 ± 0. 12)%、(0. 95 ± 0. 04)%、(1. 09 ±0.16)%、(1.60 ±0.18)%、組間比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.778，P=0.210)，且溶血率均低于5%。

3 討 論

CCK-8 是一種細胞活性檢測劑，目前已被廣泛用于多個領域，如新藥篩選、細胞毒性鑒定及腫瘤放射敏感性觀察等，該檢測方法在操作上具有簡單、快速、重復性好、效率高等優(yōu)點。本課題組采用CCK-8探討黑水虻幼蟲抗菌肽粗提物對HCT-8、A549、SKOV3和HeLa 4 種癌細胞株的增殖抑制情況發(fā)現(xiàn)，抗菌肽粗提物對4 株癌細胞的增殖均有一定的抑制作用，尤其是對HCT-8 的作用較明顯，隨著濃度的升高抑制率也升高。與HCT-8 細胞株的陽性藥物5-FU 比較發(fā)現(xiàn)，低濃度抗菌肽粗提物的作用較5-FU的作用弱，當濃度達到400 mg/L 時，效果則優(yōu)于5-FU，表明高濃度黑水虻抗菌肽粗提物有望代替或者部分代替5-FU 用于未來結腸癌的治療。本研究以正常HEK293 細胞作為陰性對照細胞，探究抗菌肽在作用于癌細胞的同時是否也作用于正常細胞，以保障實驗的完整性。結果顯示，黑水虻抗菌肽對正常細胞的毒性較小，表明黑水虻抗菌肽粗提物的抗癌作用具有選擇性。關于作用機制有研究認為，抗菌肽可作用于腫瘤細胞的細胞膜和線粒體膜，影響DNA 復制;或通過產生大量活性氧類、增加Ca2+內流等激活信號通路;也可通過激活和聚集樹突狀細胞，從而提高機體免疫力［20］。此外，抗菌肽還可作為一種免疫佐劑，通過增強淋巴細胞的表達，發(fā)揮抗腫瘤作用［21］。但不同來源的抗菌肽的作用機制存在差異。因此，黑水虻來源肽的作用機制有待進一步研究。

溶血即紅細胞被破壞后，血紅蛋白被釋放出來的現(xiàn)象，說明某物質具有破壞紅細胞胞膜的作用，間接反映該物質的安全性。近年來，一些抗菌肽如Cecropin A 和B、Magainin、melittin、Tachyplesin I、cathelicidin 家族PR-39、Mastoparan 及人工合成的抗菌肽CM-S 被認為是理想的抗腫瘤藥物［22-24］，但因其在體內具有溶血作用而導致應用受限。因而需要對已有抗菌肽的結構進行改造或者尋找新的抗菌肽來源，盧亞麗等［25］報道，動物內源性抗菌肽CGA-N46、JH-3 不具有溶血作用。Kim 等［26］報道，Harmoniasin類似物HaA4 可在不溶血的情況下作用于白血病細胞U937 和Jurkat 細胞。Sang 等［17］研究報道，天蠶素類似物ABP-dHC-Cecropin A 對K562、U937 和THP-1等白血病細胞具有濃度依賴性細胞毒性，其在最高檢測濃度(800 μmol/L)時也未顯示出明顯的溶血活性。夏一赫等［27］發(fā)現(xiàn)，抗菌肽JH-3 的溶血率低于5%。本研究測定了黑水虻抗菌肽粗提物對紅細胞的溶血性，結果發(fā)現(xiàn)，黑水虻抗菌肽粗提物的濃度不大于500 mg/L 時對紅細胞也無溶血活性，表明黑水虻抗菌肽有較好的安全性。

目前，在已發(fā)現(xiàn)的具有抗癌活性的200 種抗微生物肽中，有些抗菌肽已進入Ⅲ期臨床試驗階段［28］，且尚未發(fā)現(xiàn)癌細胞對抗菌肽有耐藥現(xiàn)象，甚至有抗菌肽具有逆轉耐藥的作用［29］，顯示抗菌肽在抗癌藥物研發(fā)方面的巨大潛力。本研究表明，黑水虻抗菌肽對癌細胞具有選擇性作用，對正常細胞無毒、對紅細胞不溶血，是未來腫瘤藥物研發(fā)得較好來源之一。