不同培養(yǎng)液及細(xì)菌HT-6 對致病疫霉 游動孢子活性的影響

張聰穎，梁 嬌，喬 柳，孟翠麗，蔣繼志

（1. 河北大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；2. 邢臺醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河北 邢臺 054000）

卵菌致病疫霉（Phytophthora infestans）主要引起馬鈴薯晚疫病，通過產(chǎn)生孢子囊或卵孢子進行繁殖，其成熟的孢子囊在水或風(fēng)的作用下從孢子囊梗脫落后可以進行較長距離的傳播，而且一個孢子囊在適宜條件下會釋放多個游動孢子，游動孢子被譽為是卵菌尤其是疫霉菌侵染植物的核心武器，也是這一類病菌傳播植物病害的主要因子之一［1-3］。游動孢子為單核、無細(xì)胞壁，具有2 根不等長的鞭毛，便于游動，通常游動30 min 或到達宿主表面后，就會失去鞭毛，形成細(xì)胞壁并萌發(fā)出芽管附著在植株上，繼而芽管頂端彭大形成附著胞，再次萌發(fā)產(chǎn)生侵染釘侵染植物。孢子囊直接萌發(fā)產(chǎn)生的芽管及其菌絲直接侵染植物的能力遠(yuǎn)不及游動孢子［2,4,5］。在孢子囊釋放游動孢子所必需的條件中，除溫度和濕度有顯著影響外［6］，關(guān)于培養(yǎng)液或培養(yǎng)基對孢子囊釋放游動孢子及其侵染能力的影響在苧麻疫霉（P. boehmeriae）、煙草疫霉（P. nicotianae）和多種腐霉（Pythium spp.）中已有報道［7-8］，但迄今為止，不同培養(yǎng)液或不同培養(yǎng)基對致病疫霉孢子囊釋放游動孢子及其侵染力的影響少有報道。

本研究室在前期連續(xù)多年監(jiān)測致病疫霉生理小種動態(tài)變化以及篩選對致病疫霉游動孢子萌發(fā)和釋放具有強烈抑制作用的活性物質(zhì)的過程中，發(fā)現(xiàn)來源于植物或微生物的不同活性物質(zhì)對同一致病疫霉菌株孢子囊的形成、游動孢子的釋放和萌發(fā)似有不同影響［9-11］，同時，在細(xì)菌HT-6 對于致病疫霉的影響方面已經(jīng)明確了其對致病疫霉菌絲的抑制效果（抑制率為89.61%）、對菌絲的致畸作用（畸變率為40.33%）及對馬鈴薯離體組織的防病效果等［11-13］，但是該菌對于致病疫霉游動孢子運動能力、侵染能力、成膜能力尚不明確。本試驗通過實驗室中常用的10%V8 培養(yǎng)液、黑麥液體培養(yǎng)基及無菌蒸餾水和自來水4 種培養(yǎng)液來處理致病疫霉孢子囊，對游動孢子的釋放能力、侵染能力、運動能力和生物膜形成能力進行比較，同時探究不同濃度HT-6 菌液對游動孢子活性的抑制作用，明確拮抗細(xì)菌HT-6 對游動孢子活性的影響，為迅速獲得高質(zhì)量的致病疫霉游動孢子提供參考，并為加快利用該細(xì)菌防治馬鈴薯晚疫病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

致病疫霉（Phytophthora infestans (Mont.) de Bary）W101 菌株及枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）HT-6 菌株均由河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物病理研究室保存，培養(yǎng)基分別為黑麥固體培養(yǎng)基（RA）和LB 液體培養(yǎng)基（LB）。

誘導(dǎo)孢子囊釋放游動孢子的培養(yǎng)液分別為自來水（TW，未經(jīng)滅菌或去礦化）、無菌蒸餾水（SDW，經(jīng)高溫高壓滅菌）、培養(yǎng)致病疫霉常用的黑麥液體培養(yǎng)基（RL）和10%V8 液體培養(yǎng)基（V8）。

1.2 不同培養(yǎng)液影響游動孢子各項能力的檢測

1.2.1 不同培養(yǎng)液影響孢子囊釋放游動孢子的測定 參照黃英菊［11］等的方法并作如下改進：將致病疫霉W101 接種于RA，20 ℃黑暗條件下培養(yǎng)至第7 天，在培養(yǎng)皿中分別加入15 mL 的TW、SDW、RL 和V8，淹沒致病疫霉菌落，用無菌涂布棒刮取致病疫霉菌體，收集菌體于50 mL 燒杯中，經(jīng)300 目篩網(wǎng)過濾得到孢子囊懸浮液，用無菌水將濃度調(diào)至10×10 倍顯微鏡下每個視野100 ～130 個孢子囊，然后置于4 ℃冰箱2.5 h 促進游動孢子釋放，從均勻分布的菌懸浮液中部用移液器吸取少量懸浮液鏡檢，試驗重復(fù)3 次，每次隨機觀察100 個視野，計算游動孢子釋放率，同時統(tǒng)計菌懸液中游動孢子的濃度，經(jīng)15 μm 濾膜過濾（僅含有少量孢子囊），再用培養(yǎng)液調(diào)整每個視野20 ～40 個游動孢子，得到游動孢子懸浮液（0.4×106cfu/mL），進行后續(xù)試驗。

游動孢子釋放率（%）=孢子囊空殼數(shù)/孢子囊總數(shù)×100

1.2.2 不同培養(yǎng)液影響游動孢子侵染馬鈴薯離體組織能力的測定 分別吸取50 μL 用不同培養(yǎng)液制備的游動孢子懸浮液，滴加并用無菌涂布棒涂抹接種于馬鈴薯塊莖切片（2.0 cm × 2.0 cm × 0.5 cm）表面，以涂抹等量相對應(yīng)的4 種培養(yǎng)液作為對照，接種后的塊莖切片置于20 ℃黑暗保濕培養(yǎng)7 d，觀察塊莖切片的發(fā)病情況，根據(jù)文獻［14］統(tǒng)計病情指數(shù)。試驗重復(fù)3 次，每個處理設(shè)置4 個重復(fù)。

病情指數(shù)=［Σ（病級數(shù)×該病級的塊莖切片數(shù)）/（調(diào)查塊莖切片總數(shù)×最高病級數(shù)）］×100

1.2.3 不同培養(yǎng)液影響游動孢子運動能力的檢測 參考楊佳瑤等［15］的方法，光學(xué)顯微鏡下檢查游動孢子的運動狀態(tài)，并統(tǒng)計每個視野中具有運動性的游動孢子所占比例，試驗重復(fù)3 次，每次隨機觀察20 個視野，比較不同培養(yǎng)液對致病疫霉釋放的游動孢子運動能力的影響。

1.2.4 不同培養(yǎng)液影響游動孢子生物膜形成能力的測定 依據(jù)李星星［16］的方法，并做如下改進：在24 孔板的孔中分別加入1.6 mL 的4 種培養(yǎng)液和 400 μL 不同培養(yǎng)液制備的游動孢子懸浮液，置于 20 ℃黑暗靜置培養(yǎng)4 d 后，吸出培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液沖洗24 孔板中形成的生物膜，再用移液器吸干緩沖液，然后加入0.2%（w/v）結(jié)晶紫水溶液染色30 min，吸出染色液，用無菌蒸餾水清洗2 次，吸干后再加2 mL 乙醇/丙酮溶液（80:20，v/v）溶解吸附于生物膜上的染料，蒸餾水稀釋10 倍后，測定 540 nm 處的吸光值計算生物膜量。

每個處理設(shè)置3 個重復(fù)，試驗重復(fù)3 次。

1.3 不同濃度細(xì)菌HT-6 菌液對游動孢子各項能力的影響

1.3.1 細(xì)菌HT-6 影響游動孢子釋放能力的測定 由1.2.1 的結(jié)果已知，致病疫霉孢子囊在TW 中游動孢子釋放率最高，因此取經(jīng)過LB 活化培養(yǎng)24 h的HT-6 菌液（OD600=1.433）分別稀釋5、10、100 倍，按照上述1.2.1 的方法，分別與用TW 制備的孢子囊懸浮液等體積混合，鏡檢游動孢子釋放情況，評價細(xì)菌HT-6 的影響。

1.3.2 細(xì)菌HT-6 影響游動孢子侵染能力的測定 由上述的結(jié)果已知，孢子囊在V8 中釋放的游動孢子其侵染能力、運動能力和成膜能力均最強，因此以下試驗均選擇由V8 制備的游動孢子進行。分別取50 μL 不同濃度（同1.3.1）的HT-6 菌液均勻涂抹在塊莖切片上，以涂抹等體積LB 作對照，在20 ℃黑暗條件下保濕培養(yǎng)24 h，然后按照1.2.2的方法接種用V8 制備的游動孢子懸浮液（0.4×106cfu/mL），觀察塊莖切片的發(fā)病情況，評價HT-6 對游動孢子侵染能力的影響。

病害預(yù)防效果( %) =（對照病情指數(shù)－處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100

1.3.3 細(xì)菌HT-6 影響游動孢子運動能力的測定 將不同濃度的HT-6 菌液（同1.3.1）與用V8 制備的游動孢子懸浮液（0.4×106cfu/mL）等體積混合，以加入相同體積的LB 作為對照，按照12.3 中的方法，鏡檢視野中具有運動性的游動孢子所占比例，測定細(xì)菌HT-6 對游動孢子運動能力的影響。

1.3.4 細(xì)菌HT-6 影響游動孢子成膜能力的測定 在24 孔板中分別加入V8（1 200 μL）、不同濃度的HT-6 菌液（400 μL）和游動孢子懸浮液（0.4×106cfu/mL，400 μL），每孔中總體積為 2 000 μL，以不加HT-6 菌液和不加游動孢子懸浮液分別為對照1 和對照2。按照1.2.4 中的方法測定各處理下游動孢子的成膜能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)液對致病游動孢子各項能力的影響

2.1.1 不同培養(yǎng)液對致病疫霉釋放游動孢子的影響 供試4 種培養(yǎng)液均能誘導(dǎo)致病疫霉孢子囊釋放游動孢子（圖1），且彼此間的游動孢子釋放率均存在顯著性差異（P＜0.05）。釋放率由高到低依次為TW（46.77 %）、SDW（25.99 %）、V8 （16.36 %）和RL（6.16 %），說明游動孢子在滲透壓較低的的培養(yǎng)液中釋放得更快更多。由4 種培養(yǎng)液得到的游動孢子懸浮液濃度分別為0.74×106、0.56×106、0.48×106和0.41×106cfu/mL。

圖1 不同培養(yǎng)液對致病疫霉釋放游動孢子的影響 Fig.1 Effects of different culture media on the release of zoospores of P. infestans

2.1.2 不同培養(yǎng)液對游動孢子侵染離體組織能力的影響 來自不同培養(yǎng)液的致病疫霉孢子囊釋放的游動孢子對馬鈴薯離體塊莖切片均有很強的侵染能力（見圖2），但彼此間均存在顯著性差異（P＜0.05）。在接種后的第2 天，即可觀察到塊莖切片發(fā)病，第7 天時最為嚴(yán)重；其中接種來自V8 及RL 的游動孢子的塊莖切片表面完全被菌絲體覆蓋，且切片顏色發(fā)黑、腐爛變軟，病情指數(shù)最高（分別為87.51 和81.25），而接種來自TW 和SDW 的游動孢子的切片表面雖也布滿菌絲體，但發(fā)病較輕，僅輕微腐爛，病情指數(shù)分別為75.45 和58.33，而對照組所有塊莖切片表面均鮮亮有光澤未見褐變和腐爛，表明培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份能顯著增強孢子囊釋放出的游動孢子對植物的侵染能力。

圖2 不同培養(yǎng)液對游動孢子侵染馬鈴薯塊莖切片的影響Fig.2 Effects of different culture media on infection of potato tuber slices by zoospore

2.1.3 不同培養(yǎng)液對游動孢子運動能力的影響 顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，來自V8 的游動孢子運動性最強（見圖3），約23.25%的游動孢子具有運動性，其次是來自RL 及TW 的游動孢子，而來自SDW的游動孢子運動性最弱，具有游動性的游動孢子僅為18.41%，但4 種處理之間均不存在顯著性差異（P＞0.05），表明不同培養(yǎng)液對已經(jīng)形成的游動孢子的運動能力均沒有顯著影響。

圖3 不同培養(yǎng)液對游動孢子運動能力的影響Fig.3 Effects of different culture media on the motile ability of zoospores

2.1.4 不同培養(yǎng)液對游動孢子生物膜形成能力的影響 游動孢子接種到24 孔板后24 h，生物膜開始形成，至第4 天時（圖4），發(fā)現(xiàn)來自V8 的游動孢子除在24 孔板底部形成生物膜外，還在氣液界面生成生物膜，而其他3 種處理僅在24 孔板底部形成，但各處理中生物膜結(jié)構(gòu)都比較完整牢固。不同培養(yǎng)液制備的游動孢子在形成生物膜量之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中以來自V8 的游動孢子生物膜量最高（OD540=1.107），其次是RL（OD540=0.753），來自SDW 的成膜量最低（OD540=0.397），表明培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成份可顯著增強游動孢子形成生物膜的能力。

圖4 不同培養(yǎng)液對游動孢子生物膜形成能力的影響Fig.4 Effects of different culture media on the biofilmforming ability of zoospores

2.2 不同濃度細(xì)菌HT-6 對致病疫霉游動孢子的影響

2.2.1 細(xì)菌HT-6 對游動孢子釋放能力的影響 不同濃度的細(xì)菌HT-6 菌液對來自TW 的游動孢子的釋放均有抑制作用，且隨菌液濃度升高，釋放率逐漸下降（表1）。其中HT-6 原液（OD600=1.433）的抑制作用最強（釋放率僅為4.17%），隨菌液濃度降低，抑制作用相應(yīng)減弱，游動孢子釋放率由4.17%升至18.52%，不同處理與對照之間均具有顯著性差異（P＜0.05）。

表1 細(xì)菌HT-6 對游動孢子釋放能力的影響Table 1 Effect of bacterial HT-6 on zoospore release ability

此外，在觀察游動孢子游動能力時，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌HT-6 對游動孢子的形態(tài)也具有一定的影響，部分游動孢子形狀不規(guī)則或破裂，并且大部分孢子囊不會將內(nèi)容物排空（圖5-A,B），而正常情況下除1 個孢子囊可以釋放多個游動孢子外，釋放出的游動孢子為圓球狀，內(nèi)含物均勻包裹于膜內(nèi)（圖5-C,D），內(nèi)含物通常全部排空。

圖5 細(xì)菌HT-6 對游動孢子形態(tài)的影響Fig.5 Effect of HT-6 strain on zoospore morphology

2.2.2 細(xì)菌HT-6 對游動孢子侵染能力的影響 因來自V8 的游動孢子對塊莖切片的侵染能力最強，因此利用不同濃度的HT-6 菌液處理塊莖切片，再接種來自V8 的游動孢子（圖6），發(fā)現(xiàn)對照組塊莖切片表面完全被菌絲體覆蓋，且塊莖腐爛變軟，嚴(yán)重褐變（病情指數(shù)為87.05），而不同濃度的HT-6 菌液預(yù)先處理后，病情指數(shù)與對照組相比均顯著降低（P＜0.05），僅涂抹濃度較低的HT-6 菌液（OD600=0.037）的塊莖切片上長出菌絲，出現(xiàn)褐變及腐爛現(xiàn)象，涂抹其他濃度菌液的塊莖切片僅出現(xiàn)輕微褐變，無菌絲產(chǎn)生。說明不同濃度HT-6 菌液對來自V8 的游動孢子的侵染能力均有較強的抑制作用，且彼此之間存在顯著性差異（P＜0.05），其中OD600=1.433 的菌液的抑制效果最顯著（病害預(yù)防效果72.95%）。

圖6 不同濃度細(xì)菌HT-6 菌液對游動孢子侵染塊莖切片的影響Fig.6 Effects of HT-6 strain at different concentrations on infection of tuber slices by zoospores

2.2.3 細(xì)菌HT-6 對游動孢子運動能力的影響 利用不同濃度的HT-6 菌液處理來自V8 的游動孢子，統(tǒng)計具有游動性的游動孢子所占比例（表2），發(fā)現(xiàn)隨著HT-6 濃度的增加，具有游動能力的游動孢子比例逐漸下降，與未加入HT-6 菌液的對照組相比均具有顯著性差異（P＜0.05），其中，HT-6 菌液原液（OD600=1.433）對游動孢子游動能力的抑制效果最強，抑制率達87.37%，僅2.97%的游動孢子具有游動能力。

表2 細(xì)菌HT-6 對游動孢子運動能力的影響Table 2 Effect of bacteria HT-6 on zoospore motility

2.2.4 細(xì)菌HT-6 對游動孢子成膜能力的影響 將來自V8 的游動孢子與細(xì)菌HT-6 菌液接種到24 孔板，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)至第4 天時（見表3），加入游動孢子懸浮液且不加HT-6 菌液的對照1 形成的生物膜較稀疏，孔隙較大，形成于孔板底部，然后再延伸至氣液表面，形成的生物膜總量（OD540）為1.107；而加入HT-6 菌液且不加游動孢子懸浮液的對照2 與各試驗組僅在氣液界面處形成較致密的細(xì)菌HT-6生物膜，未發(fā)現(xiàn)游動孢子形成的生物膜，表明細(xì)菌HT-6 可以抑制致病疫霉游動孢子生物膜的形成。

表3 不同濃度細(xì)菌HT-6 菌液對游動孢子成膜能力的影響Table3 Effect of HT-6 bacterial suspension at different concentrations on the biofilm-forming ability of zoospores

3 討論與結(jié)論

卵菌的生物學(xué)性狀及其遺傳學(xué)研究通常以孢子囊或孢子囊釋放的游動孢子為研究對象，因此選擇合適的培養(yǎng)液誘導(dǎo)卵菌孢子囊產(chǎn)生游動孢子就顯得尤為重要［7,17］。Michael 等［8］對12 株煙草疫霉（P. nicotianae）和17 種腐霉（Pythium spp.）在4 種培養(yǎng)基和5 種培養(yǎng)溫度下產(chǎn)生游動孢子的能力進行了測定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)菌株在20%澄清V8 培養(yǎng)液中要比在黑麥、利馬豆和胡蘿卜這3 種培養(yǎng)基中能產(chǎn)生更多的游動孢子，游動孢子濃度可高達1×104cfu/mL。左豫虎等［18］探究了影響大豆疫霉游動孢子產(chǎn)生的條件，得出Petri 培養(yǎng)液誘導(dǎo)得到的游動孢子濃度（0.637×106cfu/mL）顯著高于蒸餾水誘導(dǎo)的濃度（0.338×106cfu/mL）。在對馬鈴薯致病疫霉的研究中，通常用V8 或Rye 培養(yǎng)致病疫霉，但對2 種培養(yǎng)基誘導(dǎo)孢子囊釋放游動孢子進行比較尚未見報道。本試驗發(fā)現(xiàn)致病疫霉在TW 和SDW 中孢子囊游動孢子的釋放率均顯著高于V8 和RL，獲得的游動孢子濃度同樣也顯著高于V8 和RL，這與Michael 等［8］得出的結(jié)論相同，即營養(yǎng)物質(zhì)含量較少的培養(yǎng)液更有利于誘導(dǎo)孢子囊產(chǎn)生游動孢子。

目前在一些植物抗病性鑒定試驗中有時采用經(jīng)過培養(yǎng)的致病菌菌餅（或菌塊）接種，該方法操作比較簡便，但接菌量大小不易掌握，準(zhǔn)確度不夠高，且引起侵染和發(fā)病較為緩慢，而游動孢子是按照一定濃度和用量來接種，可明顯提高抗病性鑒定的精確性，同時又有利于病菌侵染［19］。梁永剛等［20］在致病疫霉侵染馬鈴薯塊莖切片的試驗中發(fā)現(xiàn)，接種致病疫霉菌餅（φ=6 mm）3 ～4 d 后，切片開始發(fā)病，并有變色及萎縮的現(xiàn)象，但由于菌餅本身占據(jù)一定空間，在一定程度上影響試驗的結(jié)果；孫曉慧［21］使用無菌水制備的大豆疫霉菌游動孢子接種大豆幼苗，24 h 即發(fā)病；本試驗中使用不同培養(yǎng)液制備的游動孢子對馬鈴薯塊莖切片進行侵染，24 h 后即可觀察到發(fā)病情況，且發(fā)現(xiàn)由營養(yǎng)成分較高的培養(yǎng)液制備的游動孢子的侵染能力更高、活性更強。

作為植物病原菌定殖感染、增強抗藥性的重要因子［22-23］，生物膜已經(jīng)成為了人們的研究熱點之一，傅本重［24］采用結(jié)晶紫染色法分析了不同培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基對水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）生物膜形成的影響，發(fā)現(xiàn)在M210 培養(yǎng)基中該菌成膜能力較強，在LB 中形成能力較弱；本研究中不同培養(yǎng)液對游動孢子成膜能力的影響存在顯著性差異（P＜0.05），其中V8 制備的游動孢子成膜能力最強，其次為RL，無菌蒸餾水制備的游動孢子成膜能力最弱，培養(yǎng)基對生物膜的影響可能主要是由于提供的營養(yǎng)條件與營養(yǎng)物質(zhì)不同引起的［24］。

關(guān)于游動孢子的游動性，本試驗中觀察發(fā)現(xiàn)孢子囊釋放游動孢子后，游動孢子在培養(yǎng)液中呈螺旋式繞圈運動。楊佳瑤等［15］發(fā)現(xiàn)抗病品種和感病品種的葡萄葉提取物，對葡萄生單軸霉菌（Plasmopara viticola）游動孢子的運動能力有不同影響，抗病品種巨峰的葉片提取物在濃度為5 mg/mL 時即可使游動孢子失去游動性，感病品種紅乳和美人指葉片的提取物均在濃度為10 mg/mL 以上時才有抑制游動孢子運動的作用。Newhook 等人［25］在研究樟疫霉（P. cinnamomi）游動孢子的運動性和趨化行為時，發(fā)現(xiàn)細(xì)玻璃微珠、細(xì)砂或砂土混合物對游動孢子的運動能力幾乎沒有影響。這與本試驗中觀察到的不同培養(yǎng)液對致病疫霉游動孢子運動能力的影響無顯著性差異相一致。

關(guān)于拮抗菌對致病疫霉游動孢子影響的報道主要集中于游動孢子的釋放與侵染能力方面，關(guān)于成膜與運動能力較少，本研究室黃英菊等［11］對放線菌Sy11 及細(xì)菌SR13-2 影響致病疫霉游動孢子釋放與萌發(fā)進行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著拮抗菌菌液濃度下降，游動孢子的釋放率及萌發(fā)率均呈上升趨勢；本試驗通過前期游動孢子培養(yǎng)液的篩選，進一步分析了細(xì)菌HT-6 對致病疫霉游動孢子各項能力的影響，發(fā)現(xiàn)拮抗菌HT-6 對于游動孢子的釋放、侵染、運動和成膜能力均有顯著影響。不同濃度的HT-6 菌液可以在一定程度上抑制致病疫霉游動孢子的釋放，并且顯著降低塊莖切片上的病情指數(shù)，有很好的防病效果，且隨菌液濃度升高防病效果增強；此外，HT-6 菌液能顯著抑制游動孢子的游動能力和生物膜形成能力。這些結(jié)果表明，細(xì)菌HT-6 可以通過影響游動孢子的各項能力來抑制致病疫霉，達到防治晚疫病的效果，這些結(jié)果深化了試驗中對細(xì)菌HT-6 抑制致病疫霉的作用機制的認(rèn)識，為下一步分離純化抑菌物質(zhì)并將其開發(fā)成抗馬鈴薯晚疫病生物制劑提供了試驗依據(jù)，也為今后開發(fā)高效環(huán)保的生物農(nóng)藥提供了新的參考。