利用GFP-Trap 技術(shù)篩選與TaTLP1 相互作用的蛋白

王 菲，楊毅清，武文月，崔鐘池，王海燕，劉大群,2

（1.河北農(nóng)業(yè)大學 植物保護學院/河北省農(nóng)作物病蟲害生物防治工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071000； 2.中國農(nóng)業(yè)科學院 研究生院，北京 100081）

小麥葉銹菌（Puccinia triticina）是一種?；院軓姷幕铙w營養(yǎng)型寄生真菌，具有高度遺傳多樣性，且小種進化速度極快。在生產(chǎn)中，大多利用化學農(nóng)藥和抗病育種的方法來防治小麥葉銹?。?］，然而化學農(nóng)藥會給生態(tài)環(huán)境造成極大的壓力與負擔，因此應開展小麥與葉銹菌互作關(guān)系的研究，明確植物抗、感病信號通路，發(fā)掘更多優(yōu)良基因，將其轉(zhuǎn)入種植的農(nóng)家品種中，對于小麥抗銹性的合理布局和小麥銹病的可持續(xù)控制具有重要的理論指導作用。

植物受到病原物侵染后，會產(chǎn)生高效的防御機制，如超敏反應（Hypersensitive Response, HR）［2］、活性氧的迸發(fā)（Oxidative Burst）［3］、病程相關(guān)蛋 白（Pathogenesis-Related Proteins, PRs）［4］的產(chǎn)生等。PR 蛋白共有18 個家族（PR1 ～PR18）［5］，大量研究表明，病程相關(guān)蛋白在植物抗病反應中起到關(guān)鍵作用，特別是針對于植物的系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）。

PR5 家族屬于類甜蛋白家族（TLPs），分為Thaumatin、Zeamatin、Osmotin 三類，可裂解真菌菌絲的細胞壁，具有抗真菌活性，在植物防御系統(tǒng)中起到關(guān)鍵的作用。Cao 等［6］通過對擬南芥、水稻、楊樹、玉米等植物進行全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)TLPs 基因具有保守結(jié)構(gòu)域，可參與生物與非生物脅迫。Ojola 等［7］將水稻類甜蛋白基因Ostlp 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)入木薯中，該基因的超表達增強了木薯對炭疽病的抗性。麻楠等［8］通過串聯(lián)親和純化（Tandem Affinity Purifica-tion, TAP）與質(zhì)譜聯(lián)用的方法明確了小麥中翻譯控制腫瘤蛋白（Translationally Controlled Tumor Protein, TCTP） 與 類 甜 蛋 白TaTLP1 互作，增強小麥抵抗葉銹菌侵染的能力。Jiao 等人［9］發(fā)現(xiàn)從香蕉中分離純化出的BanTLP 基因能夠在pH 4 ～10、溫度20 ～50 ℃的范圍內(nèi)發(fā)揮作用，使青霉真菌細胞滲透壓發(fā)生變化，破壞真菌細胞結(jié)構(gòu)，導致病原菌的死亡。Manghwar 等［10］將小麥根腐病菌分別接種于不同品種的小麥和玉米中，發(fā)現(xiàn)該病原菌接種于小麥抗病品種‘RWP13’時，PR1、TLP、β-1,3-葡聚糖的表達量明顯提高，而接種于小麥感病品種SWG13 后，這些基因沒有表達，而且該試驗結(jié)果在玉米中得到了同樣的證明。因此可將這些抗病基因通過轉(zhuǎn)基因的方式轉(zhuǎn)入感病植物中，可以提高寄主植物的抗病性。

小麥基因組龐大，且含有較多的重復序列，與病原菌的互作研究相對滯后。本研究前期獲得了小麥類甜蛋白基因TaTLP1（Genbank 登錄號：KJ764822），qRT-PCR（Quantitative real time polymerase chain reaction）分析結(jié)果表明，TaTLP1在接種葉銹菌后36、96、120 h 表達量上調(diào)，表明該基因的表達受葉銹菌的誘導，且基因與蛋白表達趨勢一致［11］；Zhang 等［12］明確了該基因定位于胞外，且該基因參與TcLr19 小麥抗葉銹病防御反應。已有研究結(jié)果都表明該基因參與了小麥抗葉銹病防御反應，但對于該基因參與抗病反應的分子機制還不了解。本研究擬利用Gateway 克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體TaTLP1-pEarleyGate103，通過煙草異源表達該蛋白，進一步利用GFP-Trap 技術(shù)快速釣取與TaTLP1 互作的蛋白，以期為小麥與葉銹菌互作的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料：本氏煙；質(zhì)粒：pEarleyGate 103、陽性對照質(zhì)粒PR1-Promoter。

1.2 主要試劑

試劑：pENTR/D-TOPO（Invitrogen）、卡那霉素、ECL 顯色液（上海生工生物工程有限公司）、硝酸纖維素膜（酷萊博）、限制性核酸內(nèi)切酶MluI（TaKaRa）、GFP 一抗（兔抗）、羊抗兔HRP 二抗（索萊寶）、蛋白marker（賽默飛）。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物設(shè)計 按照Gateway 定向克隆技術(shù)的要求，通過primer-premier 5.0 軟件設(shè)計含有信號肽的TaTLP1 的入門載體引物。同時，因為入門載體（pENTR/D-TOPO）上特殊位點attL1 的一側(cè)突出了4 個堿基，即GTGG，所以需在上游引物的5'端加上對應的4 個堿基，即CACC。引物由上海生工生物工程有限公司合成（表1）。

表1 PCR 引物的序列Table1 Sequences of primers for PCR

1.3.2 TaTLP1-pEarleyGate 103 的構(gòu)建 利用表1中的引物進行PCR 擴增，獲得平末端PCR 產(chǎn)物；純化產(chǎn)物用于連接體系的配置：PCR 產(chǎn)物4 μL，鹽溶液1 μL，TOPO 載體1 μL，瞬時離心，25 ℃室溫孵育過夜；取連接液，通過熱激法將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α 中，PCR 驗證無誤后，送北京中科希林測序，入門重組載體TaTLP1-pENTR 構(gòu)建成功。

由于試驗用入門載體pENTR/D-TOPO 和終載體pEarleyGate 103 都是卡那霉素抗性，導致抗生素篩選困難。因此，需利用Mlu I 限制性內(nèi)切酶酶切TaTLP1-pENTR，并純化，將其與帶有GFP 標簽的Gateway 載體pEarleyGate103 連接。連接體系為：酶切純化后的TaTLP1-pENTR 7.7 μL，pEarleyGate103質(zhì)粒0.3 μL，LR 酶2 μL，25 ℃室溫過夜，蛋白酶K 1 μL，37 ℃終止連接反應。將連接液轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α 中，PCR 驗證、測序。

1.3.3 TaTLP1 蛋白的異源表達 將TaTLP1-pEarley-Gate 103 轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101 中，借助煙草的異源表達技術(shù)，選擇4 ～6 葉期本氏煙草葉片的第2 ～5 葉注射含有重組載體TaTLP1-pEarleyGate 103 的菌液［13］，避光培養(yǎng)48 h 后，利用生工植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒，使用液氮將葉片研磨成粉末狀，在冰凍的條件下，加入蛋白提取緩沖液，4 ℃條件下緩慢融化后，將其轉(zhuǎn)移至無菌離心管中，于4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，此時液面分為有機層、蛋白液、沉淀層，獲得該蛋白，于-20 ℃分裝保存。

制備SDS-PAGE 膠（15%分離膠，5%濃縮膠），90 V，10 min；120 V，120 min 電泳，利用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到0.45 μm 的NC 膜上，麗春紅染色檢測轉(zhuǎn)膜情況，按1∶1 000 的比例分別稀釋GFP 一抗和HRP 二抗，孵育膜上的融合蛋白，ECL 顯色液于黑暗環(huán)境下膜上孵育2 min，利用BIO-RAD 公司的ChemiDoc Touch Imaging System 進行膜上曝光，檢測蛋白曝光結(jié)果。

1.3.4 利用GFP-Trap 釣取TaTLP1 的互作蛋白 按照Chromotek 公司GFP-Trap 的試劑盒說明操作：將TaTLP1 蛋白液加入預冷的裂解緩沖液，在冰上放置30 min，每10 min 充分吹吸1 次；4 ℃，1 300 r/min，離心10 min，取上清，向其中加入稀釋緩沖液；將珠子與上清混合，4 ℃上下緩慢搖動6 ～8 h，500 r/min，4 ℃，離心2 min；棄上清，利用pH 2.5的甘氨酸溶液洗脫掛在珠子上的純化蛋白；通過pH 10.4 的Tris 溶液來調(diào)整蛋白洗脫液的酸堿度，加上樣緩沖液，western blot 檢測無誤后，將純化蛋白的泳道切下來，送北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司進行質(zhì)譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gateway 克隆技術(shù)構(gòu)建重組載體TaTLP1-pEarleyGate 103

Gateway 定向克隆技術(shù)無需BP 反應，可將平末端PCR 產(chǎn)物定向克隆到入門載體pENTR/D-TOPO上。利用表1 中的引物擴增TaTLP1 基因，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物為516 bp，與預期大小一致（圖1A）。利用TaKaRa 的凝膠回收試劑盒回收目的片段，通過連接體系將TaTLP1 連接到TOPO 載體上，獲得TaTLP1-pENTR 入門重組載體。

利用限制性內(nèi)切酶Mlu I 酶切構(gòu)建好的TaTLP1-pENTR 重組體，酶切產(chǎn)物純化后，在LR 酶的作用下與終載體pEarleyGate103（圖1B）連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)菌落PCR 驗證，檢測到插入片段為516 bp，測序結(jié)果表明序列正確，表明成功構(gòu)建TaTLP1-pEarleyGate103 終載體。

圖1 重組載體TaTLP1-pEarleyGate103 的構(gòu)建Fig1 Construction of recombinant vector TaTLP1-pEarleyGate103

2.2 TaTLP1 蛋白的表達檢測

由于pEarleyGate103 載體中GFP-tag 位于插入位點attR1 和attR2 之后，pEarleyGate103 空載體在煙草細胞中檢測不到GFP 基因表達。因此以PR1-Promoter 作為陽性對照，經(jīng)質(zhì)壁分離后，熒光顯微鏡下觀察顯示，陽性對照組中細胞核、質(zhì)、膜中均可以看到明顯的GFP 熒光； TaTLP1-pEarleyGate103 的實驗組中，GFP 熒光出現(xiàn)在細胞間隙，表明TaTLP1在煙草中成功表達（圖2A）。

提取成功表達TaTLP1 的煙草全蛋白，預計融合蛋白應為45 kD。通過SDS-PAGE 凝膠電泳，考馬斯亮藍R250 染膠，結(jié)果顯示條帶清晰、主帶明顯，達到試驗要求（圖2B-1）；Western Blot 轉(zhuǎn)膜后，麗春紅染色結(jié)果顯示清晰的蛋白條帶，表明轉(zhuǎn)膜成功（圖2B-2）；將該蛋白進行GFP 一抗和HRP 二抗雜交，ECL 顯色液黑暗條件下膜上孵育，經(jīng)BIORAD ChemiDoc Touch Imaging System 檢測，曝光37 s 后，在40 ～55 kD 出現(xiàn)蛋白條帶，位置正確（圖2B-3），表明TaTLP1 在煙草中成功表達，達到完成GFP-Trap 的試驗要求。

圖2 TaTLP1 蛋白的異源表達Fig. 2 Heterologous expression of TaTLP1 protein

2.3 利用GFP-Trap 技術(shù)釣取與TaTLP1 互作的蛋白

GFP-Trap 珠子吸附的蛋白純化收集液經(jīng)SDSPAGE 凝膠電泳后，考馬斯亮藍染色結(jié)果顯示，泳道“+”與“-”中的蛋白分別為加入GFP-Trap 珠子和未加入GFP-Trap 珠子的TaTLP1 蛋白。對比兩泳道蛋白條帶的差異情況，發(fā)現(xiàn)在泳道“+”中大約17 kD 處出現(xiàn)差異蛋白條帶，證明該處可能存在與TaTLP1 互作的寄主蛋白（圖3）。

圖3 TaTLP1 蛋白GFP-Trap 的SDS-PAGE 檢測Fig. 3 SDS-PAGE detection GFP-Trapof TaTLP1 protein

2.4 TaTLP1 互作蛋白的質(zhì)譜分析

將2.4 中驗證無誤的TaTLP1 蛋白通過GFPTrap Beads，獲得的洗脫蛋白送由北京華大蛋白質(zhì)研發(fā)中心有限公司，以液相色譜-質(zhì)譜-質(zhì)譜（LC/MS/MS）聯(lián)用方法進行質(zhì)譜分析。蛋白質(zhì)譜分析共獲得165 個蛋白，包含了PR1、PR5、Osmotic 和非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族等。由于明確TaTLP1 定位于胞外，于是重點分析了定位于胞外的蛋白，其中PR 蛋白家族的評分較高，且定位與胞外［14］。本實驗室Gao［15］等克隆獲得TaPR1（Genbank 登錄號：HQ848391）基因，并且明確該蛋白為17 kD。因此擬計劃下一步實驗需驗證TaPR1 與TaTLP1 的互作關(guān)系（見表2）。

表2 蛋白質(zhì)譜分析獲得可能與TaTLP1 存在互作的蛋白Table 2 Summary of proteins that may interact with TaTLP1 by mass spectral analysis

3 討論

Gateway 技術(shù)是一項由Invitrogen 公司開發(fā)的快速體外克隆技術(shù)，適用于如植物、動物、昆蟲、病原等多種系統(tǒng)，該技術(shù)無需傳統(tǒng)的酶切、連接等步驟，直接利用LR 酶完成表達載體的快速構(gòu)建。目前國際上已經(jīng)開發(fā)或改造多個帶有不同標簽的Gateway 載體，可以用于不同目的的重組載體的構(gòu)建。Anggoro等［20］通過Gateway 克隆技術(shù)，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因重組載體，完成穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物的制備，且轉(zhuǎn)入的外源基因的表達水平高達普通方法制備重組載體的3倍，試驗效率大大提高；Hatsugai 等［21］利用TOPO定向克隆技術(shù)獲得兩種擬南芥的轉(zhuǎn)基因植物GFPPIP2a 和mRFP-VAM3a，通過Pull down 實驗驗證植物R 基因產(chǎn)物PRM1 與病原體因子AvrRPM1 之間存在相互作用。Liu 等［22］利用Gateway 克隆技術(shù)構(gòu)建了雙分子熒光互補（Bimolecular fluorescence complementation, BIFC） 和 免 疫 共 沉 淀（Coimmunoprecipitation, Co-IP）的不同的載體，通過這兩項技術(shù)驗證了小麥中TaCBL4 和TaCIPK5 存在互作，而且兩者的互作會增強小麥對于小麥條銹菌的抗性。然而，目前該技術(shù)在小麥葉銹病的研究上還屬于空白。本研究利用Gateway 克隆技術(shù)成功將前期獲得的一個小麥類甜蛋白基因TaTLP1 連接到了帶有GFP 標簽的Gateway 載體上。由于入門載體pENTR/D-TOPO 和終載體pEarleyGate103 都是卡那霉素抗性，抗生素篩選失去了作用。為了解決這一問題，對入門載體進行改造，即利用Mlu I 限制性內(nèi)切酶酶切重組入門載體TaTLP1-pENTR，有效分割目的片段，再以LR 酶將其與帶有GFP 標簽的Gateway 載體pEarleyGate103 連接，對傳統(tǒng)的Gateway 克隆進行了適應實際需要的有效改進。

在Gateway 重組載體成功構(gòu)建的基礎(chǔ)上，利用PR 蛋白在植物中的高度保守性這一特點，借助煙草異源表達TaTLP1 基因，在成功對其進行亞細胞定位的同時，利用國際先進的GFP-Trap 技術(shù)快速獲得了TaTLP1 的互作蛋白。該技術(shù)將GFP 結(jié)合蛋白（GBP）偶聯(lián)到瓊脂糖球或者磁力珠子上，形成GFP 陷阱。與普通抗體結(jié)合GFP 相比，GFP-Trap，結(jié) 合GFP 在 時 間 上 要 快5 ～30 min［23］。Xia 等人利用GFP-Trap 技術(shù)驗證了在擬南芥中泛素受體DA1 與E3 泛素連接酶DA2 的互作［24］；Zhang 等人通過GFP-Trap 技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，真菌的內(nèi)切多聚半乳糖醛酸酶與擬南芥受體蛋白RBPG1 互作可抑制灰霉病菌的生長［25］。目前國際上常用的獲得互作蛋白的方法除了GFP-Trap 技術(shù)之外，還包括GST-Pull down、酵母雙雜交技術(shù)（Yeast Two-Hybrid, Y2H）等。Wang 等［26］人通過酵母雙雜交技術(shù)，以大豆中響應高溫高濕脅迫的GmCDPKSK5 蛋白為誘餌，獲得了與之互作的蛋白GmTCTP，并通過GST-Pull down 和雙分子熒光互補（BiFC）的方法驗證其互作。Zhang 等人利用Pull down 的方法，獲得了與棉花黃萎病菌分泌蛋白PevD1 互作的蛋白GhPR5，并通過酵母雙雜交（Y2H）、免疫共沉淀（CoIP）的技術(shù)驗證兩者互作，發(fā)現(xiàn)該分泌蛋白具有抑制GhPR5 的抗真菌作用，可促進真菌感染［27］。不論用何種方法獲得互作蛋白，都需要結(jié)合不同實驗技術(shù)手段驗證蛋白互作的真實性，最終明確互作的意義。

在獲得與TaTLP1 互作的候選蛋白之前，需將GFP-Trap 獲得的純化產(chǎn)物進行蛋白質(zhì)譜分析，結(jié)果表明有兩類蛋白家族值得重點分析：病程相關(guān)蛋白家族和非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白家族。病程相關(guān)蛋白1 的評分為521 分，Beatrice 等人以丁香假單孢菌接種獼猴桃，qRT-PCR 結(jié)果顯示PR1、PR5 表達量增加，而兩基因表達量的增加引起了植物體內(nèi)殼聚糖的積累，從而激發(fā)植物體內(nèi)的抗病防御反應［28］。Chen 等人發(fā)現(xiàn)PR1 碳端的氨基酸序列中含有一段短肽（CAPE1），該短肽與植物的PTI（PA-MPs-triggered immunity）有關(guān)［29］，由于PR1 在許多生物體中序列高度保守，在擬南芥AtPR1 中發(fā)現(xiàn)的CAPE1 短肽同樣具有抗病的生物學活性，因此該短肽可能有助于增強其他植物物種的抗應激能力。在線軟件STRING（https://string-db.org/cgi/input.pl）預測蛋白互作，以PR5 為預測對象，以模式植物擬南芥為背景，預測結(jié)果顯示PR5 和PR1 之間可能存在相互作用。這些證據(jù)均為兩者之間互作增加可能性。因該類互作沒有相關(guān)文獻支撐，還需要后續(xù)實驗驗證。

非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白（nsLTP）評分為266，nsLTP 在植物中大多會參與植物抗病防御反應，序列大多很短，為堿性蛋白，參與植物抗病防御反應，但關(guān)于小麥抗病反應的報道較少。Wang 等［30］人研究整理了121 個物種的595 個nsLTPs，并構(gòu)建了關(guān)于nsLTPs 的數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)它們具有8 個半胱氨酸的保守結(jié)構(gòu)域，并將nsLTPs 分成I 和II 兩個類型，而且nsLTPs 的保守性在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性或脂質(zhì)結(jié)合能力中起重要作用。Wang 等［31］人從綠豆中提取出非特異性脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白基因nsLTP，與從小麥、玉米種子中獲得的該基因一樣具有脂質(zhì)轉(zhuǎn)移的活性，可對茄病鐮刀菌、尖孢鐮刀菌、腐霉和菌核病菌等產(chǎn)生抗性。關(guān)于nsLTP 是否與TaTLP1 互作還需要后續(xù)實驗驗證。

綜合上述，認為TaTLP1 蛋白可能與PR1 或者nsLTP 存在互作，下一步將對這些候選互作蛋白進行進一步驗證，并利用酵母雙雜交（Y2H），雙分子熒光互補（BiFC），免疫共沉淀（CoIP）等技術(shù)進行互作的深度驗證，明確互作的關(guān)鍵位點，探索TaTLP1所參與的信號通路以及抗病相關(guān)的互作機制。

本研究的創(chuàng)新點在于利用改造后的Gateway 技術(shù)準確構(gòu)建TaTLP1 基因在煙草中異源表達的載體，并利用GFP-Trap 技術(shù)快速獲得與TaTLP1 的互作蛋白，下一步工作需要對釣取的互作蛋白進行BiFC 和CoIP 的驗證，從信號通路的角度初步解析TaTLP1參與小麥與葉銹菌互作的分子機制，為明確小麥抗葉銹病防御機制奠定理論基礎(chǔ)。