沉水植物綠羽毛狐尾藻組織培養(yǎng)體系的建立

邢春玉 張秋

摘要 以小二仙草科觀賞沉水植物綠羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）莖段為外植體，比較升汞、次氯酸鈉在不同濃度、不同處理時(shí)間下對(duì)外植體滅菌效果的影響;以MS為基本培養(yǎng)基，研究不同質(zhì)量濃度配比的6-BA和NAA對(duì)芽誘導(dǎo)和生根培養(yǎng)的影響。結(jié)果表明，外植體最佳消毒方式為70%乙醇（20 s）+無(wú)菌水沖洗4次+0.1%升汞（結(jié)合吐溫80），消毒5 ?min;最適合芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，誘導(dǎo)率為89.2%;最適合根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+0.30 mg/L NAA，生根率達(dá)100%。

關(guān)鍵詞 綠羽毛狐尾藻;沉水植物;組織培養(yǎng);再生體系

中圖分類(lèi)號(hào) S682.32 ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2020）10-0068-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.10.019

Abstract The stem segments of ornamental submerged plant Myriophyllum hippuroides were used as explants，with different concentrations of mercuric chloride and sodium hypochlorite in different processing time on explants，and the sterilization effects were compared by different disinfection methods.The effects of different ratio concentration of 6BA and NAA on adventitious bud induction and rooting culture were studied with stem segment as explants and MS as media.The results showed that the optimal way to sterilization for explants was 70% ethyl alcohol（20 s）+sterile water washing 4 times+0.1% HgCl2（with Tween80）for 5 min.The most suitable medium for bud induction was MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，the inducation rate reach 89.2%;the most suitable medium for root induction was MS+0.30 mg/L NAA，the rooting rate could reach 100%.

Key words Myriophyllum hippuroides;Submerged plant;Tissue culture;Regeneration system

沉水植物作為淡水生態(tài)系統(tǒng)的重要成員，在維持水生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定以及園林造景方面發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，由于水體污染嚴(yán)重，導(dǎo)致河流沉水植物群落退化或消失，造成淡水生態(tài)系統(tǒng)的功能喪失[1]。沉水植物可防治水體富營(yíng)養(yǎng)化，具有很好的脫氮除磷效果[2]，是水生植物群落重建與恢復(fù)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵，因此沉水植物的引種成為水生植被恢復(fù)工程的首要環(huán)節(jié)。沉水植物主要以無(wú)性繁殖為主[3]，短時(shí)間內(nèi)從異地采集種苗會(huì)遇到種源不足和采集地生態(tài)環(huán)境破壞等問(wèn)題，而利用組織培養(yǎng)快繁技術(shù)可以解決這一問(wèn)題。綠羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）為小二仙草科狐尾藻屬多年生沉水植物，原產(chǎn)美洲，為水族造景常用植物，具有較高的觀賞價(jià)值和一定水體凈化能力。因此，綠羽毛狐尾藻組織培養(yǎng)體系的建立，為沉水植物組織培養(yǎng)技術(shù)研究提供參考，對(duì)營(yíng)建人工濕地景觀和水生植被恢復(fù)重建具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用綠羽毛狐尾藻（Myriophyllum hippuroides Nutt.ex Torr.& A.Gray）購(gòu)于水族市場(chǎng)，以長(zhǎng)勢(shì)良好的幼嫩莖段作為外植體。

1.2 培養(yǎng)條件

試驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基（含蔗糖20 g/L、瓊脂6 ?g/L，pH 5.8），分別添加不同濃度配比的6-BA和NAA，并于121 ℃高壓滅菌20 min。培養(yǎng)溫度為（24±1）℃，光強(qiáng)2 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 外植體的處理。

取長(zhǎng)勢(shì)良好的綠羽毛草幼嫩植株，用洗衣粉浸泡20 min，自來(lái)水沖洗植株1 h，剪去葉片，用蒸餾水沖洗4遍。

1.3.2 外植體不同消毒方法的篩選。

將已經(jīng)處理好的外植體置于超凈工作臺(tái)，采用不同消毒方式進(jìn)行處理，初步清洗后的外植體采用70%乙醇表面消毒20 s，無(wú)菌水沖洗4遍，再分別用0.1%升汞或次氯酸鈉消毒（0.1%升汞結(jié)合吐溫-80，處理時(shí)間分別為3、5、7 min;1%次氯酸鈉，處理時(shí)間分別為3、5、7 min;2%次氯酸鈉，處理時(shí)間分別為3、5、7 min），不同處理見(jiàn)表1。消毒處理后用無(wú)菌水沖洗4遍，用無(wú)菌濾紙吸干多余水分，切取2 cm左右?guī)Ч?jié)莖段，接種到培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 ?mg/L NAA。每個(gè)處理接種30個(gè)外植體，重復(fù)3次。培養(yǎng)15 d后，統(tǒng)計(jì)污染率=污染外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%，死亡率=死亡的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%，存活率=存活的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100%。

1.3.3 芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選。

選取已經(jīng)滅菌完成的外植體，切取2 cm左右?guī)Ч?jié)莖段，接種到芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基為MS+蔗糖20 g/L+瓊脂6 ?g/L，pH 5.8，并添加0.25～2.00 ?mg/L 的6-BA及0.10～0.20 mg/L的NAA，以無(wú)激素培養(yǎng)基為對(duì)照，共設(shè)置9個(gè)處理，每個(gè)處理接入30個(gè)莖段，每個(gè)處理重復(fù)3次。置于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)28 d后，統(tǒng)計(jì)不定芽數(shù)量和芽長(zhǎng)，計(jì)算芽誘導(dǎo)率，誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.3.4 生根培養(yǎng)基的篩選。

為了研究不同濃度激素對(duì)根誘導(dǎo)的影響，將芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中長(zhǎng)勢(shì)良好的芽苗在無(wú)菌條件下轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基（MS+蔗糖20 g/L+瓊脂6 g/L+NAA，NAA含量為0.10～0.30 mg/L）。每個(gè)處理接入20棵芽苗，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，21 d后統(tǒng)計(jì)生根情況，根誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)生根的芽苗數(shù)/接種的芽苗數(shù)×100%。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒處理對(duì)外植體滅菌效果的影響

消毒劑的濃度和處理時(shí)間不同，外植體的滅菌效果不同，不同消毒處理間存在較顯著差異（P<0.05）。從表1可以看出，在9種消毒處理中，0.1% 升汞結(jié)合吐溫-80處理5 min，污染率較低，為11.82%，外植體死亡率為21.11%，存活率可達(dá)67.07%，吐溫作為表面活性劑，可以使升汞與外植體表面充分接觸，消毒效果較好;當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到7 min時(shí)，外植體無(wú)法存活，死亡率較高。次氯酸鈉消毒處理總體上比0.1%升汞效果要差，隨著次氯酸鈉濃度增加、處理時(shí)間延長(zhǎng)，污染率降低，但外植體存活率下降明顯，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)用2%次氯酸鈉處理7 min，外植體褐化嚴(yán)重，導(dǎo)致死亡。研究表明消毒劑處理時(shí)間短，滅菌不徹底，處理時(shí)間長(zhǎng)則會(huì)破壞植物組織，導(dǎo)致外植體死亡，綜合考慮污染率和存活率，最佳滅菌方式為0.1%升汞結(jié)合吐溫-80，處理5 min。

2.2 不同激素濃度配比對(duì)芽誘導(dǎo)培養(yǎng)效果的比較

從表2可看出，6-BA和NAA不同濃度組合使芽數(shù)增加顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。當(dāng)6-BA和NAA濃度較低且濃度配比值低時(shí)，可在莖段莖節(jié)處長(zhǎng)出側(cè)芽。培養(yǎng)基中添加0.25 ?mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA時(shí)，芽苗生長(zhǎng)較快，但較細(xì)弱（圖1A）。當(dāng)添加0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA時(shí)，芽誘導(dǎo)率最高，可達(dá)89.20%，芽苗呈深綠色，長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1B）。當(dāng)添加0.50 mg/L 6-BA+0.05 ?mg/L NAA時(shí)，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度較低，此時(shí)在莖段基部形成愈傷組織，從愈傷組織上長(zhǎng)出芽苗，芽苗較短（圖1C）。隨著生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度增加，在莖段基部形成愈傷組織，長(zhǎng)出的芽苗又會(huì)分蘗出側(cè)芽，芽苗長(zhǎng)勢(shì)良好（圖1D）。

2.3 不同激素對(duì)根誘導(dǎo)培養(yǎng)效果的比較 將誘導(dǎo)生成的芽苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基上，在MS基本培養(yǎng)基中只添加NAA，芽苗生長(zhǎng)情況見(jiàn)表3。接種7 d時(shí)有芽苗開(kāi)始生根，21 d時(shí)0.30 mg/L NAA的培養(yǎng)基生根率達(dá)到100%，平均根長(zhǎng)為7.59 cm（圖2A）。MS培養(yǎng)基中添加0.10 mg/L NAA時(shí)生根緩慢，培養(yǎng)21 d時(shí)根誘導(dǎo)率僅為66.67%，可見(jiàn)生長(zhǎng)素的含量對(duì)根的形成有較大影響。

3 討論與結(jié)論

沉水植物為了適應(yīng)水體生態(tài)環(huán)境而發(fā)生組織結(jié)構(gòu)改變，表皮細(xì)胞壁薄，無(wú)角質(zhì)層或角質(zhì)層很薄，使得消毒劑通透性增強(qiáng)[4]，在滅菌的同時(shí)，對(duì)植物組織傷害較大，滅菌條件較難控制，因此，常用于陸生植物的消毒方法對(duì)沉水植物并不適用。升汞殺菌的原理是Hg2+可與帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性，酶失去活性;而次氯酸鈉的殺菌作用主要是次氯酸的氧化作用，不僅可與細(xì)胞壁發(fā)生作用，還可浸入細(xì)胞內(nèi)與蛋白質(zhì)發(fā)生氧化作用，使細(xì)胞糖代謝失調(diào)而死亡[5]，吐溫作為表面活性劑，可以使滅菌更加徹底，外植體染菌率低，成活率高，在對(duì)紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca）[6]和衛(wèi)矛（Euonymus alatus）[7]外植體消毒過(guò)程中吐溫和升汞的結(jié)合為外植體消毒的最佳方法，與該試驗(yàn)的結(jié)果相似。

植物組織培養(yǎng)中，不定芽誘導(dǎo)常用的激素為6-BA和NAA[8]，該研究發(fā)現(xiàn)激素濃度低且6-BA與NAA質(zhì)量濃度比小于10∶1時(shí)，外植體莖節(jié)處長(zhǎng)芽，由于激素含量低，芽苗較為細(xì)弱;當(dāng)激素濃度升高且6-BA與NAA質(zhì)量濃度比值超過(guò)10∶1時(shí)，莖段基部會(huì)形成愈傷組織，愈傷組織進(jìn)一步分化形成芽苗，可見(jiàn)芽苗誘導(dǎo)效果既受到6-BA和NAA的濃度影響，同時(shí)還受到2種激素濃度比值的影響。從愈傷組織誘導(dǎo)途徑獲得植株個(gè)體，存在變異，不利于母本的特性保留[9]，綜合考慮得出該研究最適合芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+0.50 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA，誘導(dǎo)率達(dá)89.20%。

誘導(dǎo)芽苗生根時(shí)加入的NAA對(duì)根誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用[10]，隨著NAA濃度的增加，芽苗的生根率及生長(zhǎng)速度都有顯著增加，該研究最適合的根誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+0.30 mg/L NAA，培養(yǎng)21 d的生根率高達(dá)100%，平均生根數(shù)為4.5條。

該試驗(yàn)從外植體滅菌、芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基、根誘導(dǎo)培養(yǎng)基的篩選3個(gè)方面研究了沉水觀賞植物綠羽毛狐尾藻的組織培養(yǎng)離體快繁技術(shù)，此技術(shù)能夠短期內(nèi)培育出大量種苗，可用于水體環(huán)境修復(fù)，因其為水族造景常用植物，其經(jīng)濟(jì)意義不言而喻。

參考文獻(xiàn)

[1]成小英，王國(guó)祥，濮培民，等.冬季富營(yíng)養(yǎng)化湖泊中水生植物的恢復(fù)及凈化作用[J].湖泊科學(xué)，2002，14（2）：139-144.

[2] 李歡，吳蔚，羅芳麗，等.4種挺水植物、4種沉水植物及其組合群落去除模擬富營(yíng)養(yǎng)化水體中總氮和總磷的作用比較[J].濕地科學(xué)，2016，14（2）：163-172.

[3] 濮培民，王國(guó)祥，李正魁，等.健康水生態(tài)系統(tǒng)的退化及其修復(fù)——理論、技術(shù)及應(yīng)用[J].湖泊科學(xué)，2001，13（3）：193-203.

[4] 陳波，郝文濤.沉水植物菹草組織培養(yǎng)體系的建立[J].北方園藝，2010（12）：138-140.

[5] 黃作喜，邱超，曾楨迦，等.植物組織培養(yǎng)中消毒劑的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].內(nèi)江師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，28（6）：26-30.

[6] 周婧，楊美純，岑秀芬，等.紅腺忍冬外植體滅菌與芽誘導(dǎo)研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，42（2）：124-127.

[7] 趙麗蒙，陸秀君，張麗杰，等.衛(wèi)矛莖段組織培養(yǎng)中消毒方法及不定芽誘導(dǎo)[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，44（12）：21-25，63.

[8] GHIMIRE B K，SEONG E S，GOH E J，et al.Highfrequency direct shoot regeneration from Drymaria cordata Willd.leaves[J].Plant Cell Tissue Organ Cult，2010，100（2）：209-217.

[9] 閆海霞，鄧杰玲，何荊洲，等.永福報(bào)春苣苔離體快繁體系的建立[J].植物生理學(xué)報(bào)，2017，53（11）：2037-2043.

[10] 趙振利，曹艷春，劉榮寧.素心蠟梅組織培養(yǎng)及其體外植株再生技術(shù)[J].北方園藝，2017（3）：112-115.