蛭龍活血通瘀膠囊對PD大鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響

王蔚 沈宏萍 楊思進 杜淵

【摘要】目的 觀察蛭龍活血通瘀膠囊對帕金森（PD）大鼠凋亡相關(guān)蛋白的影響。方法 將50只SD大鼠隨機分為假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀膠囊（ZL）高、中、低劑量組，采用頸背部皮下注射魚藤酮2 mg/kg/d連續(xù)4周以制備PD大鼠模型，觀察行為學(xué)改變，用免疫組化法檢測Bax、caspase-3蛋白表達。結(jié)果 蛭龍活血通瘀各藥物組大鼠行為學(xué)改變較模型組減輕;Bax、caspase-3蛋白表達均有不同程度降低，其中高劑量組最為明顯，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論 蛭龍活血通瘀膠囊可能通過降低PD大鼠Bax、caspase-3蛋白表達起到治療帕金森病的作用。

【關(guān)鍵詞】蛭龍活血通瘀膠囊;PD;Bax;caspase-3

【中圖分類號】R749.2 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】ISSN.2095.6681.2020.9..02

帕金森?。≒arkinsonS disease，PD）又被稱為“震顫麻痹”（Paralysis Agitans）[1]。神經(jīng)細胞凋亡被證實為該病的主要病理表現(xiàn)，本研究通過觀察?？圃簝?nèi)制劑蛭龍活血通瘀膠囊對PD大鼠腦組織凋亡相關(guān)蛋白Bax、caspase-3的表達，探尋該藥治療帕金森病的作用機制。

1 材料與方法

1.1? 動物及分組

清潔級健康雄性SD大鼠50只，體重180±20 g，購于成都達碩生物有限公司，普通飼料喂養(yǎng)，室溫22±2℃，濕度30～40%，自由攝食、飲水。按隨機數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、蛭龍活血通瘀低劑量組（ZL低劑量組）、蛭龍活血通瘀中劑量組（ZL中劑量組）、蛭龍活血通瘀高劑量組（ZL高劑量組），每組10只。

1.2? 造模及給藥

模型組每日頸背部皮下注射魚藤酮溶液（溶解于二甲基亞砜、聚乙二醇-300）2 mg/kg/d，共4周[2];假手術(shù)組僅注射二甲基亞砜及聚乙二醇-300混合溶液;ZL低、中、高劑量組分別于注射魚藤酮溶液后1周灌胃蛭龍活血通瘀膠囊（溶解于3 mL生理鹽水）0.3 g/kg/d、0.6 g/kg/d、1.2 g/kg/d;假手術(shù)組及模型組同步每日灌胃等體積的生理鹽水。

1.3? 行為學(xué)觀察

大鼠給藥4周后觀察行為學(xué)改變 [3]。是否拘捕行為減弱;是否毛色變臟變黃、弓背，主動活動減少;是否動作遲緩、震顫或步態(tài)不穩(wěn);是否出現(xiàn)單側(cè)旋轉(zhuǎn);是否癱瘓，行走或進食困難;是否死亡等。

1.4? Bax、caspase-3蛋白表達

大鼠深度麻醉，經(jīng)過0.9%生理鹽水、4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后，剝?nèi)∧X組織浸泡于4%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片后再經(jīng)二甲苯、梯度乙醇、蒸餾水脫蠟，熱修復(fù)后封閉，一抗及二抗孵育，漂洗后顯色，蘇木素復(fù)染，稀鹽酸分化，碳酸鋰反藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。采用光學(xué)顯微鏡觀察中腦黑質(zhì)區(qū)相應(yīng)蛋白的表達（×200），Image-Pro Plus圖像分析軟件計算Bax、caspase-3陽性細胞數(shù)作定量分析。

1.4? 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗數(shù)據(jù)由SPSS 13.0統(tǒng)計軟件分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。采用采用方差分析（One-way ANOVA），LSD及Dunnett法作多重比較，以P<0.01認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1? 各組行為學(xué)比較

模型組給藥1周左右出現(xiàn)活動減少，進食減少，毛色光澤度下降，發(fā)黃變臟，繼續(xù)給藥后出現(xiàn)動作遲緩，姿勢呈弓背狀，繼而出現(xiàn)頭部震顫，身體偏向一側(cè)，行走不穩(wěn)，向單側(cè)轉(zhuǎn)圈;假手術(shù)組無上述行為學(xué)改變;ZL各藥物組較模型組行為學(xué)改變程度減輕，高劑量組最為明顯。

2.2? 各組Bax、Caspase-3表達

ZL各藥物組與模型組比較，均有不同程度降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;ZL高劑量組與低、中劑量組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

3 討 論

PD在中醫(yī)學(xué)中屬“顫證”范疇。中醫(yī)典籍《皇帝內(nèi)經(jīng)》中載有“諸風(fēng)掉眩”、“行則振掉”、“掉振鼓栗”等，提出本病主要臨床表現(xiàn)為肢體搖動[4]。PD病因病機較為復(fù)雜，臨證多以滋補肝腎、補腎活血、益氣養(yǎng)血、熄風(fēng)止顫、養(yǎng)肝柔筋為治法遣方用藥[5]。蛭龍活血通瘀膠囊具有益氣活血、祛風(fēng)通絡(luò)功效，臨床治療帕金森病具有良好療效[6]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證實細胞凋亡在PD病的發(fā)病機制中起重要作用[7]。Caspase-3在中腦黑質(zhì)神經(jīng)元的缺失是PD的主要病理特點[8]。細胞在受到凋亡刺激信號后趨向于凋亡，bax蛋白呈高表達，進而調(diào)節(jié)caspase-3活化，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷增加細胞凋亡[9]。文獻報道[10、11]，魚藤酮具有較強親脂性可通過血腦屏障，選擇性抑制線粒體復(fù)合物Ⅰ的活性，引起氧化應(yīng)激和細胞凋亡，其誘導(dǎo)的PD模型能夠重現(xiàn)行為學(xué)改變及病理學(xué)特征，接近人類PD疾病表現(xiàn)，因此本課題采用魚藤酮進行PD大鼠模型制備，觀察凋亡相關(guān)蛋白表達情況。本實驗研究表明，蛭龍活血通瘀膠囊能夠改善PD大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)，減少凋亡相關(guān)蛋白Bax、Caspase-3在中腦黑質(zhì)區(qū)域的表達，由此可見，蛭龍活血通瘀膠囊可能通過降低凋亡相關(guān)蛋白在腦內(nèi)的表達從而發(fā)揮治療帕金森病的作用。

參考文獻

[1] 中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會帕金森病及運動障礙學(xué)組.中國帕金森病治療指南（第三版）[J].中華神經(jīng)科雜志.2014.47（6）：428.

[2] 姜? ?新.蟲草素對魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型多巴胺能神經(jīng)元的保護作用及其抗凋亡機制研究[D].揚州大學(xué)，2017.

[3] 侯曉麗.人參皂苷-Rg3對帕金森病模型大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元保護作用機制研究[D].揚州大學(xué)，2012.

[4] 吳勉華，王新月.中醫(yī)內(nèi)科學(xué)[M].第3版.北京：中國中醫(yī)藥出版社，2012：441-446.

[5] 李? ?哲，胡瀛宇.等.帕金森病中醫(yī)治療進展[J].中醫(yī)藥現(xiàn)代化.2014.16（4）：909.

[6] 王? ?蔚，沈宏萍，楊思進，杜? ?淵.蛭龍活血通瘀膠囊治療帕金森病臨床療效觀察[J].光明中醫(yī).2019，34（18）：2803-2805.

[7] Ferro M M，Bellissimo M L，Anselmo-Franci J A，et al.Comparison of bilaterally 6-OHDA and MPTP-lesioned rats as models of the early phase of Parkinsons disease：histological，neurochemical，motor and memory alteratins[J].J Neurosci Methods.2005，148（1）：78.

[8] 吳建軍，肖? ?清，劉? ?凱，等.細胞凋亡學(xué)說在帕金森病發(fā)病機制的理論探索[J].中國老年學(xué)雜志.2009，29：2135.

[9] Cregan S P，Maclautin J G，Craig C G，et al.Bax-dependentcaspase-3 activiation is a key determinant in p53-induced apoptosisin neurons [J].J Neurosci，1999，19（18）：7860-7869.

[10] Hollingworth R M，Ahammadsahib K I，Gadelhak G，et al.New inhibitors of complex Ⅰ of the mitochondrial electron transport chain with activity as pesticides[J].Biochem Soc Trans.1994，22（1）：230-233.

[11] Li N，Ragheb K，Lawler G，et al.Mitochondrial complex Ⅰ inhibitor rotenone induces apoptosis through enhancing mitochondrial reactive oxygen species production[J].J Biol Chem.2003，278（10）：8516-8525.

基金項目：西南醫(yī)科大學(xué)校級科研項目，2014QN-039

通訊作者：杜 淵，郵箱：345569502@qq.com