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    刺梨GGP和DHAR基因序列多態(tài)性及其與果實(shí)維生素C含量的關(guān)聯(lián)分析

    2020-06-01 07:58:51李廣貴林國都胡玉乾張懷山白靜安華明魯敏
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2020年8期
    關(guān)鍵詞:維生素C關(guān)聯(lián)分析刺梨

    李廣貴 林國都 胡玉乾 張懷山 白靜 安華明 魯敏

    摘要:高含量的維生素C是刺梨果實(shí)的重要性狀,挖掘與維生素C含量相關(guān)聯(lián)的基因序列變異及單倍型對刺梨的品種改良具有指導(dǎo)意義。在21份野生刺梨資源中對GGP和DHAR基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序,分析基因序列多態(tài)性及其與果實(shí)維生素C含量的相關(guān)性。GGP基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為2 035 bp的同源序列,其中包含22處變異位點(diǎn),產(chǎn)生15種單倍型,在0.01顯著性水平上,3個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)及Hap15與刺梨果實(shí)高含量維生素C相關(guān);在0.05顯著性水平上,3個(gè)SNP及Hap7與刺梨果實(shí)低含量維生素C相關(guān);GGP基因單倍型存在網(wǎng)狀進(jìn)化。DHAR基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為1 609 bp的同源序列,其中包含69處變異位點(diǎn),產(chǎn)生9種單倍型,在0.05顯著性水平上,8個(gè)SNP、9個(gè)InDel及Hap9與刺梨果實(shí)中低含量維生素C相關(guān),1個(gè)SNP及單倍型Hap4~Hap6與刺梨果實(shí)中高含量維生素C相關(guān);DHAR基因單倍型呈現(xiàn)扇形進(jìn)化。GGP基因具有更高的單倍型多樣性,DHAR基因具有更高的DNA多態(tài)性;GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4共同存在于刺梨中時(shí),可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時(shí)存在于刺梨中時(shí),可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

    關(guān)鍵詞:刺梨;維生素C;GGP基因;DHAR基因;基因序列多態(tài)性;單倍型;關(guān)聯(lián)分析

    中圖分類號(hào): S661.203.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2020)08-0063-07

    收稿日期:2019-03-08

    基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(編號(hào):31660558);貴州省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(編號(hào):2018053);貴州大學(xué)SRT計(jì)劃(編號(hào):2018244)。

    作者簡介:李廣貴(1996—),男,貴州六盤水人,主要從事刺梨分子育種研究。E-mail:1119366514@qq.com。

    通信作者:魯?敏,博士,副教授,主要從事果樹生物技術(shù)與遺傳育種研究。E-mail:48181266@qq.com。

    刺梨(Rosa roxburghii Tratt.)為薔薇科薔薇屬植物,原產(chǎn)于中國,因果實(shí)富含維生素C而成為研究維生素C代謝的熱門材料。研究表明,在所有合成路徑中,L-半乳糖途徑的GDP甘露糖表異構(gòu)酶(GME)基因的表達(dá)變化最能反映維生素C積累速率的變化;超量表達(dá)RrGME基因的擬南芥葉片中維生素C平均濃度提高了6.2倍;而循環(huán)途徑的脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)基因的表達(dá)變化與維生素C的積累變化相似性最高,超量表達(dá)RrDHAR的擬南芥葉片中維生素C平均濃度提高了9.7倍[1]。筆者所在課題組研究發(fā)現(xiàn)刺梨中L-半乳糖途徑的半乳糖醛酸內(nèi)酯脫氫酶(GLDH)和GDP半乳糖磷酸化酶(GGP)基因的表達(dá)特點(diǎn)與維生素C積累高度一致,進(jìn)一步將它們在煙草中過量表達(dá)使煙草葉片中的維生素C含量分別提高了1.1倍和20倍[2-4]。從受體植物維生素C含量的增加程度來看,RrGGP和RrDHAR等2個(gè)基因應(yīng)優(yōu)先當(dāng)選為刺梨維生素C代謝的關(guān)鍵酶基因,但有關(guān)它們在基因序列上的差異與維生素C含量之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系并不清楚。

    關(guān)聯(lián)分析(association analysis)是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ),研究群體基因型多態(tài)性與表型變異相關(guān)性,發(fā)掘和定位基因,并對基因及其等位基因進(jìn)行功能分析的重要工具[5]。根據(jù)掃描范圍,關(guān)聯(lián)分析可分為全基因組和候選基因2種途徑。湯佳樂等利用70對覆蓋全基因組的SSR引物,發(fā)現(xiàn)了與獼猴桃葉片及果實(shí)中的維生素C含量關(guān)聯(lián)的5個(gè)優(yōu)異標(biāo)記位點(diǎn)[6]。筆者所在課題組雖然前期也開發(fā)了大量SSR引物[7-11],但由于缺乏刺梨遺傳連鎖圖譜數(shù)據(jù),因此在SSR引物的選擇上具有隨機(jī)性,目前尚未篩選到與刺梨維生素C含量相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)。針對這種現(xiàn)狀,候選基因關(guān)聯(lián)分析是更適合刺梨的研究策略。而在蘋果上已有研究證明,GGP基因內(nèi)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)是影響果實(shí)維生素C含量的主要決定因素[12]。因此,本研究對候選基因RrGGP和RrDHAR進(jìn)行基因序列多態(tài)性分析,并進(jìn)一步與維生素C含量進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析,為刺梨遺傳改良提供理論依據(jù)和分子工具。

    1?材料與方法

    1.1?材料

    試驗(yàn)于2017、2018年8—9月進(jìn)行。從貴州省11個(gè)縣(市)采樣20份,四川省冕寧縣采樣1份(表1),樣本間距離大于50 m。每個(gè)采樣株均有全球定位系統(tǒng)(GPS)定位,并詳細(xì)記錄經(jīng)度、緯度、海拔高度。每株采取幼嫩葉片和成熟度及大小一致的有代表性的果實(shí),以株為單位裝入做好標(biāo)記的自封袋中,放在冰盒內(nèi),及時(shí)帶回實(shí)驗(yàn)室,經(jīng)液氮處理后于-70 ℃超低溫冰箱中冷凍保存,備用。

    1.2?DNA提取和PCR擴(kuò)增

    試驗(yàn)材料基因組DNA的提取采用CTAB法[13]。GGP基因擴(kuò)增引物序列為正向5′-CATGCCATGGATGTTGAGGATCAAGAGGGTTCCCACTAT-3′,反向5′-GCTCTAGAACATAAACCCAAACG-3′[4],DHAR基因擴(kuò)增引物序列為正向5′-CCACCTCATAAACTTGGCTGACA-3′,反向5′-TGTTTCTCTTCAGCGATGGTCTT-3′[1],交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系為40 μL,其中包括2×Mix 20 μL;ddH2O 16 μL;10 μmol/L的 Primer-F 及Primer-R各 1 μL;50 ng/μL的DNA模板2 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?94 ℃ 預(yù)變性4 min;然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)包括94 ℃變性40 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸 90 s;最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離,觀察拍照后送上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行雙向測序。將測序結(jié)果與GenBank中的序列利用BLAST工具(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行比對,以確認(rèn)擴(kuò)增結(jié)果的正確性。

    1.3?AsA含量測定

    參照白靜等的方法[14],AsA含量采用高效液相色譜法測定。

    1.4?數(shù)據(jù)分析

    利用Lasergene 7.0軟件對正反向序列進(jìn)行拼接,參照Chromas序列峰圖對誤讀點(diǎn)進(jìn)行人工校正,并用軟件Clustal X進(jìn)行多序列對比[15]。利用DnaSP v5.1軟件進(jìn)行GGP和DHAR基因核酸多態(tài)性分析和單倍型分析[16],以Network 5.0軟件構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖;利用Structure 2.3.4軟件計(jì)算其最佳群體值K=2,取此時(shí)的群體結(jié)構(gòu)Q值作為協(xié)變量,以Tassel 2.1軟件進(jìn)行GGP和DHAR基因核酸多態(tài)性與果實(shí)維生素C含量的關(guān)聯(lián)分析。

    2?結(jié)果與分析

    2.1?基因序列多態(tài)性分析

    GGP基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為2 035 bp的同源序列,其中包含22處變異位點(diǎn),11處為插入缺失標(biāo)記(Insert/Delete,InDel)類型,11個(gè)為SNP類型;DHAR基因在21份野生刺梨中共擴(kuò)增出長度為 1 609 bp 的同源序列,其中包含69處變異位點(diǎn),53處為InDel類型,16個(gè)為SNP類型(表2)。DHAR基因具有較高的DNA多態(tài)性,多態(tài)性核苷酸位點(diǎn)數(shù)量、核苷酸差異平均數(shù)(k)、核苷酸多樣度(Pi)等參數(shù)分別為69、5.123 81和0.003 29。而GGP基因具有更高的單倍型多樣性,單倍型數(shù)量(Ha)、單倍型多樣度(Hd)等參數(shù)分別為15和0.900。

    2.2?基因序列多態(tài)性及其與果實(shí)AsA含量的關(guān)聯(lián)分析

    對于GGP基因而言(表3),在0.01顯著性水平上,所檢測22處變異位點(diǎn)中,有3個(gè)SNP(267 T/A,305 T/G,420 G/T)與刺梨果實(shí)維生素C含量相關(guān),解釋率為0.319 1,在267 bp處為A堿基,305 bp 處為G堿基,420 bp處為T堿基是Hap15特有變異,它對應(yīng)的材料ZY-29在所有材料中維生素C含量最高,為 2 590.47 mg/100 g,表明Hap15可能控制刺梨果實(shí)高維生素C含量。在0.05顯著性水平上,有5處變異與刺梨果實(shí)維生素C含量相關(guān),其中3處為InDel類型(639-/G,989-/T,1 215-/T),2處為SNP類型(1 354 C/G,1 355 T/C),在639 bp處為G堿基,1 354 bp 處為G堿基,1 355處為C堿基是Hap7的特有變異,它對應(yīng)的材料LD-7中維生素C含量僅為987.59 mg/100 g,屬偏低水平,表明Hap7可能控制刺梨果實(shí)低維生素C含量。

    對于DHAR基因而言(表4),在0.05顯著性水平上,所檢測的69處變異位點(diǎn)中,有19處與刺梨果實(shí)維生素C含量相關(guān),其中9處為InDel類型(399A/-,1 370-1 377 TCTGTAAG/—),10處為SNP類型(20 T/G,382 G/C,497 T/G,581 C/T,720 T/G,837 G/T,1 397 A/T,1 440 T/C,1 595 C/A,1 596 C/T,1 597 G/A);在20 bp處為G堿基,382 bp 處為C堿基,399 bp處為缺失,497 bp處為G堿基,581 bp處為T堿基,720 bp處為G堿基,1 370~1 377 bp處插入TCTGTAAG,1 397 bp處為T堿基,1 595 bp處為A堿基,1 597 bp處為A堿基是單倍型Hap9的特有變異,它對應(yīng)的材料為 LD-7、XY-24、BJ-3、AL-20,維生素C含量范圍982.62~1 543.1 mg/100 g,平均值1 171.15 mg/100 g,屬中偏低水平,表明單倍型Hap9控制中低水平的AsA含量;1 440 bp處為C堿基是單倍型Hap4~Hap6的共有變異,對應(yīng)的材料ZY-29、MN-7、AL-17中AsA含量分別為2 590.47、1 652.57、1 668.35 mg/100 g,屬中偏高水平,表明單倍型Hap4~Hap6可能控制中高水平AsA含量。

    綜合GGP基因和DHAR基因核苷酸多態(tài)性及單倍型結(jié)果來看(表3、表4),GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4同時(shí)在高含量維生素C材料ZY-29中檢測到,表明這2種單倍型共同存在于刺梨中時(shí),可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時(shí)存在于低含量維生素C材料 LD-7中,表明這2種單倍型共同存在于刺梨中時(shí),可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

    2.3?單倍型間的進(jìn)化分析

    將所檢測到的15條野生刺梨GGP基因和9條DHAR基因單倍型序列,通過Network軟件構(gòu)建了Median Joining網(wǎng)絡(luò)聚類(圖1、圖2)。對于GGP基因而言,單倍型存在網(wǎng)狀進(jìn)化,Hap1位于網(wǎng)絡(luò)圖輻射化的中心,且包含了7個(gè)個(gè)體(表3),占試驗(yàn)材料的33.33%,分布最廣,是主要單倍型,可推測該單倍型為原始單倍型或祖先單倍型,其余Hap2~Hap15均為特有單倍型,僅存在于1個(gè)個(gè)體中(表3),Hap2、Hap5、Hap7、Hap8、Hap10、Hap11、Hap14、Hap15位于發(fā)散網(wǎng)絡(luò)圖的末端,說明它們是較晚發(fā)生變異而產(chǎn)生的單倍型。對于DHAR基因而言,單倍型進(jìn)化軌跡類似扇形,Hap1位于扇狀圖起始位點(diǎn),包含8個(gè)個(gè)體(表4),占試驗(yàn)材料的38.10%,分布最廣,是主要單倍型,可推測該單倍型為原始單倍型或祖先單倍型,Hap3、Hap8、Hap9為共享單倍型,Hap2、Hap4~Hap7為特有單倍型,僅存在于1個(gè)個(gè)體中(表4),Hap2、Hap6、Hap7、Hap9位于發(fā)散網(wǎng)絡(luò)圖的末端,說明它們是較晚發(fā)生變異而產(chǎn)生的單倍型。GGP基因和DHAR基因網(wǎng)絡(luò)圖中出現(xiàn)的mv均表明一些單倍型在進(jìn)化過程中發(fā)生了丟失。

    3?討論

    在21份刺梨野生種質(zhì)中,ZY-29采于貴州省遵義市,位于最東端,在GGP基因和DHAR基因中呈現(xiàn)特異單倍型,分別為Hap15和Hap4;MN-7采于四川省冕寧縣,位于最西端,在GGP基因和DHAR基因中也呈現(xiàn)特異單倍型,分別為Hap8和Hap5。對GGP基因而言,東西兩端的試驗(yàn)材料ZY-29和MN-7對應(yīng)的單倍型Hap15和Hap8在系統(tǒng)進(jìn)化圖上也位于相反的分枝上,表明GGP基因單倍型的進(jìn)化可能與地理位置具有一定的相關(guān)性;而對DHAR基因而言,東西兩端的試驗(yàn)材料ZY-29和MN-7對應(yīng)的單倍型Hap4和Hap5在系統(tǒng)進(jìn)化圖上位于同一分枝,并進(jìn)化出Hap6(圖2),說明DHAR基因單倍型的進(jìn)化可能不受地理?xiàng)l件的影響。

    維生素C積累的遺傳調(diào)控非常復(fù)雜,對維生素C代謝通路中的關(guān)鍵酶或限速步驟的研究即使在同一植物中也會(huì)存在差異[17-18],在刺梨中也有相同的情況發(fā)生,從表觀遺傳學(xué)的角度,GGP和DHAR基因是爭議的焦點(diǎn)[1,4]。本研究通過分析刺梨GGP和DHAR基因在不同種質(zhì)中DNA序列的差異,從DNA水平研究2個(gè)基因與果實(shí)維生素C含量的關(guān)聯(lián)性,在0.01水平上,僅GGP基因中的3個(gè)SNP顯著地影響刺梨果實(shí)維生素C含量,但這3個(gè)位點(diǎn)均發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域;在0.05水平上,則GGP和DHAR基因均存在與果實(shí)維生素C含量顯著關(guān)聯(lián)的變異位點(diǎn),證明GGP和DHAR都是影響刺梨果實(shí)維生素C含量的關(guān)鍵基因,它們在DNA水平和表觀遺傳學(xué)方面都發(fā)揮了積極作用,在表觀遺傳學(xué)上,GGP基因是合成途徑的關(guān)鍵基因,而DHAR基因是循環(huán)再生途徑的關(guān)鍵基因。從DNA水平上來說,GGP基因具有更高的單倍型多樣性,DHAR基因具有更高的DNA多態(tài)性。DHAR基因在21個(gè)材料中產(chǎn)生了69處變異位點(diǎn),其中53處為InDel類型(表2),涉及2段ATGCTATTCAAATGAATGAAGT序列,但這2段變異并未與刺梨果實(shí)維生素C含量顯著關(guān)聯(lián)(表4),而當(dāng)TCTGTAAG序列存在于DHAR基因時(shí),刺梨果實(shí)可能維生素C含量較低??傊?,刺梨果實(shí)維生素C含量可能由GGP和DHAR基因共同控制,當(dāng)GGP基因特異單倍型Hap15和DHAR基因特異單倍型Hap4共同存在于刺梨中時(shí),可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為高的狀態(tài);而GGP基因特異單倍型Hap7和DHAR基因單倍型Hap9同時(shí)存在于刺梨中時(shí),可以使果實(shí)維生素C含量表現(xiàn)為低的狀態(tài)。

    目前,刺梨在貴州的種植面積已達(dá) 13.33萬hm2,并計(jì)劃到2020年增加到 33.33萬hm2,但真正用于栽培的僅貴農(nóng)5號(hào),隨著刺梨高端產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,市場需求更高AsA含量的品種,但以此為育種目標(biāo)的品質(zhì)改良尚未真正開展,因此,本研究將對培育我國專用刺梨品種、加快刺梨品質(zhì)育種進(jìn)程起到一定的推動(dòng)作用。

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