羊口瘡病毒B2L、F1L 基因融合真核表達(dá)質(zhì)粒誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答及IL-2 對(duì)其作用影響的研究

鮮思美，張 友，李 婷，楊 倩，饒?bào)w宇，吳伯梅，包濤濤，閔德省，包細(xì)明，張 益

（1. 貴州大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；2. 貴州省動(dòng)物疫病研究所，貴州 貴陽(yáng) 550025）

羊傳染性膿皰病由羊口瘡病毒（Orf virus，OrfV）所致的一種人獸共患傳染病[1-2]，該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率高，以羔羊最為易感；病羊口唇等部位的皮膚及粘膜出現(xiàn)紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍是Orf的常見癥狀[3-4]。用于預(yù)防Orf 的疫苗主要有滅活苗和弱毒疫苗，均能在一定程度上降低疾病的感染率，但是滅活苗不能有效激發(fā)細(xì)胞免疫，弱毒疫苗存在毒力返強(qiáng)等潛在的風(fēng)險(xiǎn)。隨著規(guī)模化養(yǎng)羊業(yè)的快速發(fā)展，Orf 的危害越發(fā)嚴(yán)重，因此，利用基因工程技術(shù)研發(fā)一種新型疫苗對(duì)防治Orf 具有重大意義[5]。DNA 疫苗作為一種新型疫苗，沒有毒力返強(qiáng)，同時(shí)具有制備簡(jiǎn)單、成本低廉、質(zhì)粒性質(zhì)穩(wěn)定、便于運(yùn)輸和保存等優(yōu)點(diǎn)。

OrfV 的B2L 和F1L 基因是兩個(gè)重要的免疫原性基因，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生良好的免疫反應(yīng)。馮平等通過將B2L 和F1L 基因串聯(lián)，并在昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)獲得了部分分泌型的B2L 和F1L 串聯(lián)重組蛋白[6]。趙魁構(gòu)建了pCDNA3.1-ORFV 011（B2L）、pCDNA3.1-ORFV 059（F1L）和pCDNA3.1-ORFV 011（B2L）-linker-ORFV（F1L）質(zhì)粒，通過免疫小鼠表明了pCDNA3.1-ORFV 011（B2L）-linker-ORFV（F1L）質(zhì)粒免疫效果優(yōu)于pCDNA3.1-ORFV 011（B2L）、pCDNA3.1-ORFV 059（F1L）質(zhì)粒[7]。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了真核表達(dá) 質(zhì) 粒pVAX1-IL-2、pVAX1-F1L 和pVAX1-B2L，并通過免疫小鼠證明其具有良好的免疫原性[8]。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建了OrfV pVAX1-B2L-F1L 融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒，并以pVAX1-IL-2 為細(xì)胞因子佐劑免疫小鼠，評(píng)價(jià)其誘導(dǎo)小鼠的免疫應(yīng)答效果。以期為后續(xù)試驗(yàn)核酸疫苗PVAX1-B2L-F1L 免疫宿主動(dòng)物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-IL-2、pVAX1-B2L-F1L 由貴州省動(dòng)物疫病研究室構(gòu)建、鑒定并保存；OrfV 陽(yáng)性高免兔血清、MDBK 細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存；165 只5 周齡～6 周齡KM 系小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量18 g～20 g。購(gòu)自中國(guó)人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 主要試劑 RNA 提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；脂質(zhì)體2000（Lipofatamiane 2000）購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；FITC 標(biāo)記的羊抗兔IgG 購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；DMSO、ConA、MTT 購(gòu)自美國(guó)Solarbio 公司；無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒、紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自天根深化科技（北京）有限公司；OrfV 抗體（OrfV-Ab）酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；小鼠IL-2、IFN-γ、IL-4 和IL-6 ELISA 定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢基因美公司。

1.3 融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L-F1L 在MDBK 細(xì)胞中的表達(dá) 參照Lipofectamine 2000 說明書，將pVAX1-B2L-F1L、pVAX1 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染MDBK 細(xì)胞，48 h 后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞；采用RT-PCR 從mRNA 水平檢測(cè)pVAX1-B2L-F1L 轉(zhuǎn)錄情況[9]；以O(shè)rfV 陽(yáng) 性 高 免 兔 血 清（1∶50）1 為 一 抗；羊 抗 兔IgG-FITC（1∶500）為二抗，采用間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）檢 測(cè)pVAX1-B2L-F1L 在MDBK 細(xì) 胞 中 的 表達(dá)。同時(shí)以pVAX1 空載體和正常細(xì)胞作為對(duì)照。

1.4 小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 將160只小鼠隨機(jī)分成4組，40只/組，采用腿部肌肉注射途徑免疫重組質(zhì)粒，各組免疫的質(zhì)粒與劑量見表1。間隔一周以相同劑量、途徑加強(qiáng)免疫，共免疫3 次。免疫后4 組小鼠每周眼球采血，每組每周采5 只小鼠，共采血8 周，分離血清，-20 ℃保存。眼球采血后，頸椎脫臼法迫殺小鼠，無(wú)菌采集其脾臟，用于小鼠脾細(xì)胞增殖試驗(yàn)。

1.5 免疫小鼠血清中特異性抗體水平檢測(cè) 參照小鼠OrfV-Ab ELISA 試劑盒說明書檢測(cè)各組小鼠首免后不同時(shí)間段小鼠血清中OrfV 特異性抗體（該試劑盒中，當(dāng)檢測(cè)樣品濃度＜2 pg/mL 時(shí)，判為陰性）。所得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

表1 小鼠實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Mouse experimental design

1.6 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 每周每組取5只小鼠眼球采血后斷頸迫殺小鼠，酒精浸泡5 min，制備脾淋巴細(xì)胞懸液：將無(wú)菌采集的脾臟放入有1640 的無(wú)菌EP 管中，將其剪碎，用200 目細(xì)胞篩研磨制成細(xì)胞懸液，室溫離心10 min，棄上清；加入2 mL 無(wú)菌紅細(xì)胞裂解液重懸細(xì)胞沉淀，37 ℃放置15 min 后，室溫離心10 min，棄上清；加入1640 重懸細(xì)胞沉淀，室溫離心10 min；加入含10%胎牛血清的1640 培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)達(dá)1×106個(gè)/mL。用終濃度為50 μg/mL 的ConA 誘導(dǎo)，采用MTT 法[9]檢測(cè)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖情況。酶標(biāo)儀測(cè)定各孔OD490nm值。所得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.7 免疫小鼠血清中Th1/ Th2 型細(xì)胞因子檢測(cè)將各組小鼠首免后不同時(shí)間段分離的血清，通過ELISA 方法測(cè)定小鼠血清中Th1 型（IL-2、IFN-γ）、Th2 型（IL-4、IL-6）細(xì)胞因子含量。所得數(shù)據(jù)用SPSS 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1 融合基因轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果 提取細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR 方法檢測(cè)B2L-F1L 融合基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pVAX1-B2L-F1L的細(xì)胞經(jīng)PCR 擴(kuò)增出約2 181 bp 的目的條帶，與預(yù)期一致。但pVAX1 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果為陰性（圖1）；通過間接免疫熒光（IFA）檢測(cè)pVAX1-B2L-F1L 重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVAX1-B2L-F1L 的細(xì)胞可見綠色熒光，同形對(duì)照組[8]（不加一抗，只加二抗）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞未見綠色熒光，轉(zhuǎn)染pVAX1 空載體的細(xì)胞和正常細(xì)胞也未見綠色熒光（圖2）。表明融合基因B2L-F1 能夠在MDBK 細(xì)胞中表達(dá)。

圖1 B2L-F1L 基因mRNA 在MDBK 細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.1 mRNA transcription of eukaryotic expression plasmid pVAX1-B2L-F1L in MDBK cells

2.2 免疫小鼠血清特異性抗體水平檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA方法檢測(cè)小鼠血清中OrfV特異性抗體。結(jié)果顯示，pVAX1-B2L-F1L 免疫組和pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠在首免后第1 周迅速產(chǎn)生抗體，兩組特異性抗體水平均在首免后第5 周時(shí)達(dá)到最高；首免后第1～8周，pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠產(chǎn)生OrfV 特異性抗體水平均高于pVAX1-B2L-F1L免疫組，其中首免后第4～6周pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2免疫組小鼠OrfV特異性抗體水平極顯著高于pVAX1-B2L-F1L 免疫組（p＜0.01），而pVAX1 組和生理鹽水對(duì)照組小鼠自始至終都沒有產(chǎn)生OrfV 特異性抗體（圖3）。結(jié)果表明，融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L-F1L 能夠有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生OrfV 特異性抗體，且pVAX1-IL-2 作為免疫佐劑能夠有效增強(qiáng)pVAX1-B2L-F1L的體液免疫應(yīng)答水平。

圖2 融合基因表達(dá)的IFA 檢測(cè)（400×）Fig.2 IFA test results(400×)

圖3 免疫小鼠血清中OrfV 特異性抗體動(dòng)態(tài)變化Fig.3 Dynamic variation of specific antibodies against OrfV in serum of immunized mice

2.3 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)免疫后不同時(shí)間段迫殺的小鼠取脾經(jīng)分離培養(yǎng)小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行非特異性刺激后，采用MTT 法檢測(cè)其增殖情況。結(jié)果顯示：首免后第2 周～第8 周，pVAX1-B2L-F1L 免疫組與pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞OD490nm值均極顯著高于pVAX1 組和生理鹽水（p＜0.01）組；pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞OD490nm值高于pVAX1-B2L-F1L免疫組，其中首免后第2周和第6周，前者脾淋巴細(xì)胞OD490nm值極顯著高于后者（p＜0.01），首免后第5 周二者差異顯著（p＜0.05）（圖4）。結(jié)果表明，pVAX1-B2L-F1L 真核表達(dá)質(zhì)粒免疫小鼠后能夠刺激小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖，且pVAX1-IL-2 能夠促進(jìn)pVAX1-B2L-F1L 質(zhì)粒誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖。

圖4 免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic variation of splenic lymphocyte proliferation in immunized mice

2.4 免疫小鼠血清中Th1 型細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果

2.4.1 免疫小鼠血清中IL-2 的檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA 方法檢測(cè)各組小鼠不同時(shí)間段血清中IL-2 的含量。結(jié)果顯示，pVAX1-B2L-F1L 免疫組和pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠在首免后第1 周即開始迅速分泌IL-2，在首免后第1 周～第8 周前者小鼠IL-2的分泌量均比后者的分泌量高，其中首免后第1周二者之間差異顯著（p＜0.05）；首免后第2周～第7周二者差異均極顯著（p＜0.01）；在首免后第8 周時(shí)二者差異不顯著（p＞0.05）；與pVAX1 空載體和生理鹽水對(duì)照組相比，在首免后第1 周～第8 周二者差異極顯著（p＜0.01）（圖5）。結(jié)果表明，pVAX1-IL-2 能夠促進(jìn)pVAX1-B2L-F1L 誘導(dǎo)的小鼠機(jī)體中IL-2 的分泌。

圖5 免疫小鼠血清中IL-2 動(dòng)態(tài)變化Fig.5 Dynamic variation of serum IL-2 in immunized mice

2.4.2 免疫小鼠血清中IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA 方法檢測(cè)各組小鼠不同時(shí)間段血清中IFN-γ 的含量。結(jié)果顯示，在首免后第1 周～第8 周，pVAX1-B2L-F1L 免 疫 組 和pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠血清中分泌IFN-γ 的量均極顯著高于pVAX1 組和生理鹽水組（p＜0.01）；首免后第1 周pVAX1-B2L-F1L 免疫組小鼠IFN-γ分泌量顯著高于pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組（p＜0.05），首免后第2 周二者之間差異不顯著，但首免后第3 周～第8 周后者IFN-γ分泌量極顯著高于前者（p＜0.01）（圖6）。結(jié)果表明，pVAX1-IL-2 能夠促進(jìn)pVAX1-B2L-F1L 誘導(dǎo)小鼠機(jī)體中IFN-γ的分泌。

圖6 免疫小鼠血清中IFN-γ動(dòng)態(tài)變化Fig.6 Dynamic variation of serumIFN-γ in immunized mice

2.5 免疫小鼠血清中Th2 型細(xì)胞因子的檢測(cè)結(jié)果

2.5.1 免疫小鼠血清中IL-4 的檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA 方法檢測(cè)各組小鼠不同時(shí)間段血清中IL-4 的含量。結(jié)果顯示，pVAX1-B2L-F1L 免疫組和pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組首免后1 周內(nèi)能夠刺激小鼠機(jī)體迅速分泌IL-4，首免后第1 周～第6 周二者均極顯著高于pVAX1 組和生理鹽水組（p＜0.01），首免后第7 周4 個(gè)組小鼠IL-4 的分泌量差異不顯著（p＞0.05）；首 免 后 第1 周、2 周、3 周、6 周pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠IL-4 分泌量均極顯著或顯著高于pVAX1-B2L-F1L 免疫組（p＜0.01；p＜0.05）；在首免后第4 周、5 周、8 周后者小鼠血清中IL-4 分泌量高于前者，其中首免后第4 周和第8 周 二 者 差 異 顯 著（p＜0.05）（圖7）。結(jié) 果 表 明，pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫和pVAX1-B2LF1L 免疫均夠能刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生IL-4，但pVAX1-IL-2 對(duì)pVAX1-B2L-F1L 誘導(dǎo)小鼠機(jī)體分泌IL-4 的效果不顯著。

2.5.2 免疫小鼠血清中IL-6 檢測(cè)結(jié)果 采用ELISA方法檢測(cè)各組小鼠不同時(shí)間段血清中IL-6 的含量。結(jié)果顯示，pVAX1-B2L-F1L 免疫組和pVAX1-B2LF1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠首免后1 周內(nèi)均能夠刺激小鼠機(jī)體快速分泌IL-6，首免后第1 周、2 周、3周、6 周、7 周二者分泌IL-6 水平均極顯著高于pVAX1 空載體組和生理鹽水對(duì)照組（p＜0.01）；在首免后第1 周、2 周，pVAX1-B2L-F1L 免疫組小鼠血清中IL-6 的分泌量極顯著高于pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免 疫 組（p＜0.01），首 免 后 第4 周、5周、8 周前者分泌IL-6 量也高于后者，但是二者之間差異不顯著（p＞0.05）；在首免后第3 周、6 周、7周，pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫組小鼠血清中IL-6 的分泌量高于pVAX1-B2L-F1L 免疫組，但二者之間差異不顯著（p＞0.05）（圖8）。結(jié)果表明，pVAX1-B2L-F1L+pVAX1-IL-2 免疫和pVAX1-B2LF1L 免疫均能夠刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生IL-6，但pVAX1-IL-2 對(duì)pVAX1-B2L-F1L 誘導(dǎo)小鼠機(jī)體分泌的IL-6無(wú)明顯作用。

圖7 免疫小鼠血清中IL-4 動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Dynamic variation of IL-4 in sera of immunized mice

圖8 免疫小鼠血清中IL-6 動(dòng)態(tài)變化Fig.8 Dynamic variation of IL-6 in sera of immunized mice

3 討 論

Orf 呈世界性分布，給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙畜牧業(yè)發(fā)展。OrfV不僅能感染羊，近年來也有關(guān)于其感染貓和家養(yǎng)馴鹿的報(bào)道[10]；同時(shí)也對(duì)人類健康造成威脅，具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[11]。國(guó)內(nèi)外對(duì)Orf 的研究已經(jīng)證明OrfV 是一種變異性較強(qiáng)的病毒，各地分離的病毒在致病性上均存在著較大差異[12]。OrfV 感染動(dòng)物后，機(jī)體能產(chǎn)生很強(qiáng)的免疫反應(yīng)，包括中性粒細(xì)胞、皮膚樹突細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞、CD4+T 細(xì)胞和少量的CD8+T 細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒作用。OrfV 具有高度的嗜上皮性，介導(dǎo)的是細(xì)胞免疫應(yīng)答，體液免疫應(yīng)答水平低下，并且主要以局部免疫為主[13-14]。

DNA 疫苗具有能表達(dá)天然蛋白抗原，主要誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫應(yīng)答的特點(diǎn)。外源性抗原進(jìn)入機(jī)體后，與B 細(xì)胞膜上的SIg 特異性結(jié)合，活化B 細(xì)胞，啟動(dòng)體液免疫應(yīng)答。由于激活B 細(xì)胞，需要經(jīng)過細(xì)胞分化、增殖等過程，所以初次免疫應(yīng)答產(chǎn)生抗體水平較低；再次加強(qiáng)免疫后，B 細(xì)胞分泌的抗體量增加，且分泌快速[15]。本研究通過ELISA 檢測(cè)免疫前后不同時(shí)間段小鼠血清中OrfV 特異性抗體水平，結(jié)果表明，pVAX1-B2L-F1L 能夠有效刺激小鼠機(jī)體產(chǎn)生OrfV 特異性抗體，且加強(qiáng)免疫后小鼠血清中OrfV 特異性抗體水平開始升高，在首免后第5 周達(dá)到峰值，第6 周開始抗體水平緩慢下降，但是在第8 周時(shí)的抗體水平仍然為陽(yáng)性，這一檢測(cè)結(jié)果與趙魁構(gòu)建的質(zhì)粒pCDNA3.1-OrfV011（B2L）-linker-OrfV059（F1L）免疫小鼠產(chǎn)生抗體水平動(dòng)態(tài)一致[16]。利用ConA 對(duì)不同時(shí)間段分離培養(yǎng)的小鼠脾淋巴細(xì)胞進(jìn)行非特異性刺激，MTT 法檢測(cè)其增殖情況，結(jié)果與前期研究的pVAX1-B2L、pVAX1-F1L 單獨(dú)免疫小鼠后的脾淋巴增殖試驗(yàn)相比，在首免后第1 周～第8 周，pVAX1-B2L-F1L 免疫組小鼠脾淋巴細(xì)胞OD490nm值 顯 著 高 于pVAX1-B2L[17]、pVAX1-F1L 免 疫組[18]，表明OrfV 雙基因融合真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L-F1L 促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖的能力高于單基因真核表達(dá)質(zhì)粒。

效應(yīng)T 細(xì)胞主要有輔助性T 細(xì)胞（Th）和細(xì)胞毒性T 細(xì)胞（Tc）兩大類，Th 細(xì)胞根據(jù)功能分為兩個(gè)亞群Th1 和Th2，Th1 細(xì) 胞 主 要 分 泌IL-2、IFN-γ、IL-12 和IL-18 等細(xì)胞因子，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2 細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-6 和IL-10 等細(xì)胞因子，主要促進(jìn)B 細(xì)胞增殖、分化成漿細(xì)胞，分泌特異性抗體，介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答[19-20]。通過ELISA 檢測(cè)OrfV 融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L-F1L 免疫小鼠血清中Th1（IL-2、IFN-γ）型和Th2 型（IL-4、IL-6）細(xì)胞因子含量，結(jié)果顯示免疫組小鼠經(jīng)特異性抗原刺激后，分泌產(chǎn)生的IL-2 和IFN-γ細(xì)胞因子含量明顯升高，且首免后第1 周～第8 周分泌的IL-2和IFN-γ水平均極顯著高于本實(shí)驗(yàn)室前期研究的pVAX1-B2L、pVAX1-F1L 單獨(dú)免疫的小鼠；而分泌IL-4 的量與pVAX1-B2L、pVAX1-F1L 單獨(dú)免疫組相比差異不顯著[21]；pVAX1-B2L-F1L 組誘導(dǎo)小鼠分泌IL-6 在首免后第2、3、4、6 周均極顯著高于pVAX1-B2L 單獨(dú)免疫組，在首免后第1 周～第5 周極顯著高于pVAX1-F1L 單獨(dú)免疫組；小鼠總體Th1 型細(xì)胞因子分泌量大于Th2 型細(xì)胞因子分泌量，該結(jié)果與趙魁的研究結(jié)果一致，表明構(gòu)建的OrfV pVAXB2L、pVAX-F1L、pVAX-B2L-F1L 質(zhì)粒主要誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生Th1 型細(xì)胞免疫應(yīng)答。

IL-2 在動(dòng)物機(jī)體的抗病毒、抗毒素、抗腫瘤等方面發(fā)揮重要作用[22]。許多研究表明IL-2 作為佐劑在增強(qiáng)疫苗免疫效果的同時(shí)，還可以促進(jìn)機(jī)體抗體分泌，緩解臨床癥狀[23]。本研究將pVAX1-IL-2 作為細(xì)胞因子免疫佐劑，聯(lián)合pVAX1-B2L-F1L 免疫小鼠，首免后1～8 周其產(chǎn)生OrfV 特異性抗體水平和脾淋巴細(xì)胞增殖水平均高于pVAX1-B2L-F1L 免疫組，且前者小鼠血清中分泌的IL-2和IFN-γ細(xì)胞因子含量均高于后者，表明pVAX1-IL-2 能夠促進(jìn)pVAX1-B2L-F1L 誘導(dǎo)小鼠機(jī)體中Th1 型細(xì)胞因子的分泌；pVAX1-IL-2 對(duì)pVAX1-B2L-F1L 誘導(dǎo)小鼠機(jī)體分泌IL-4 先有促進(jìn)作用，后表現(xiàn)為抑制作用，而pVAX1-IL-2 對(duì)pVAX1-B2L-F1L 誘導(dǎo)小鼠機(jī)體分泌IL-6 無(wú)明顯促進(jìn)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究的OrfV 融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX1-B2L-F1L 免疫小鼠與本實(shí)驗(yàn)室前期研究的pVAX1-B2L、pVAX1-F1L 單獨(dú)免疫小鼠相比，在誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞增殖和Th1、Th2 型細(xì)胞因子分泌試驗(yàn)中，前者的免疫效果明顯好于單基因真核表達(dá)質(zhì)粒，表明構(gòu)建的OrfV 雙基因融合真核表達(dá)質(zhì)粒比單基因真核表達(dá)質(zhì)量更能增強(qiáng)機(jī)體的免疫效果。