采用Mini-Flotac 和PCR 方法檢測圈養(yǎng)野生動物腸道寄生蟲

范克偉，張 寧,，孫曉雙,，楊 飛,3，魏 濤，陳小麗，唐 耀，傅文源，陳騰騰，陳志穎，劉佳悅，吳 然，黃翠琴*，周東輝*

（1. 龍巖學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/福建省家畜傳染病防治與生物技術(shù)重點實驗室，福建 龍巖 364012；2.福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/福建省動物藥物工程實驗室，福建 福州 350002；3. 西藏農(nóng)牧學(xué)院 動物科學(xué)學(xué)院，西藏 林芝 860000；4. 福州市動物園管理處，福建 福州 350012；5. 福建梅花山華南虎繁育研究所，福建 龍巖 364201）

近年來，野生動物的疾病研究呈上升趨勢，而越來越多的研究顯示寄生蟲病是危害野生動物的主要疾病之一。寄生于動物腸道的寄生蟲種類主要有線蟲、吸蟲、絳蟲和原蟲，直接憑借形態(tài)通過顯微鏡觀察可有效地檢測到直徑較大的寄生蟲蟲卵或卵囊，但一些蟲體微小的原蟲，如芽囊原蟲（Blastocystis.sp），其空泡型平均直徑僅為4 μm～15 μm[1]，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢測方法敏感度較差，目前主要是利用分子生物學(xué)的方法進行檢測與鑒定。近期的研究發(fā)現(xiàn)，珍稀野生動物在人和動物的芽囊原蟲感染過程中具有公共衛(wèi)生隱患[2]。

福建地區(qū)具有豐富的野生動物資源，本研究通過采用Mini-Flotac 對福建圈養(yǎng)野生動物糞便進行寄生蟲蟲卵或卵囊檢測，并采用基于SSU rRNA 基因序列的PCR 檢測對福建地區(qū)于野生動物芽囊原蟲進行種群結(jié)構(gòu)分析，旨在了解福建地區(qū)圈養(yǎng)野生動物腸道寄生蟲感染情況，并評估人獸共患風(fēng)險，以期為有效防治野生動物寄生蟲病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與保存 2018年3月至4月，分別在福建省梅花山華南虎繁育研究所和福州市動物園共采集70 份新鮮糞樣（含28 種野生動物），每份約20 g，置于一次性塑料袋中，并標(biāo)注動物種類、收集地點及日期。每份樣品分裝成兩份，一份直接存放于4 ℃，用于Mini-Flotac 檢測，一份置于2.5%的重鉻酸鉀溶液后存放于4 ℃保存，用于分子檢測。

1.2 主要試劑 飽和NaCl 溶液和糞便基因組E.Z.N.A?DNA 提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；rTaq DNA 酶、10×rTaq buffer、2.5 mmol/L dNTP、25 mmol/L MgCl2購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；6×Loading Buffer和DL 2000 DNA Marker 購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成；Mini-Flotac kit 購自意大利那不勒斯菲里德里克第二大學(xué)（University of Naples Federico II）動物醫(yī)學(xué)學(xué)院寄生蟲學(xué)和寄生蟲病系。

1.3 Mini-Flotac 檢測糞便寄生蟲 按照Mini-Flotac kit 說 明（www.parassitologia.unina.it）進 行 組 件 裝配，樣品處理及實驗操作。對兩個計數(shù)室的卵囊數(shù)量進行計數(shù)，采用公式OPG/EPG=兩個計數(shù)室里的卵囊個數(shù)之和×10，即可得到每克糞便中的卵囊數(shù)或蟲卵數(shù)。

1.4 糞便樣品基因組DNA 提取 每份糞便取200 mg置于2 mL 離心管中，加入雙蒸水，混勻，12 000 r/min離心1 min，棄上清，重復(fù)步驟至清洗干凈表面的重鉻酸鉀；將含有糞便樣品的離心管置于100 ℃水浴中靜置5 min 后置于-80 ℃5 min，反復(fù)凍融5 次后，按照糞便基因組提取試劑盒說明書提取DNA后置于-20 ℃保存待用。

1.5 PCR 擴增及測序 參照文獻[3]PCR 擴增芽囊原蟲小亞基核糖體RNA（SSU rRNA），PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化后由廣州擎科生物技術(shù)有限公司進行雙向測序。

1.6 SSU rRNA 序列分析及種系發(fā)育分析 應(yīng)用Clustal X 1.83 將測序獲得的兩條正反互補核苷酸序列進行比對校正，獲得校正的完整序列，拼接的完整序列在NCBI 的Blast 上進行相似性搜索，下載同源性最高的序列與獲得的序列進行比對，確定序列是否是芽囊原蟲的基因組，分析序列差異。利用Mega5.0 軟件，選擇鄰接法（Neighbor-joining，NJ 法）中的Kimura-2-parameter 模型，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。進化樹的可靠性用Bootstrap 分析進行檢測，進行1 000 個重復(fù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 野生動物腸道寄生蟲感染率及感染強度Mini-Flotac 檢測結(jié)果顯示，27 種野生動物共70 份新鮮糞便樣品中，有42 份為寄生蟲陽性糞便樣品，總感染率為60.00%，最低感染強度（EPG 或OPG 值）為100，最高達34 800，表明福建地區(qū)野生動物腸道寄生蟲感染較嚴(yán)重。其中靈長類動物感染率為56.25%（9/16），松鼠猴的感染較為嚴(yán)重，主要為線蟲與球蟲混合感染，線蟲蟲卵EPG 值達2000，其它靈長類動物以球蟲感染為主；食肉目動物感染率為38.46%（5/13），1 份華南虎糞便為等孢球蟲類[4]和線蟲混合感染，1 份為線蟲感染，感染強度均較高（球蟲OPG 達9150，線蟲EPG 達9 600），其它食肉目動物均為球蟲感染；禽類動物感染率為50.00%（8/16），均為球蟲感染，其中雉雞感染球蟲OPG 值高達34 800；偶蹄目動物感染率為81.82%（18/22），以梅花鹿感染最為嚴(yán)重（88.24%，15/17），最高OPG 值達8750；奇蹄目動物球蟲感染率為100.00%（3/3），最高OPG 值為9 600，各種動物腸道寄生蟲感染率和感染強度見表1。這些數(shù)據(jù)表明，寄生蟲病是危害野生動物的主要疾病之一，應(yīng)定期監(jiān)測和制定科學(xué)合理的驅(qū)蟲方案。

表1 福建部分圈養(yǎng)野生動物腸道寄生蟲感染率及感染強度Table 1 Infection rates and intensity of intestinal parasites in part of wild animals from Fujian province

續(xù)表

Barda 等通過3 種方法對腸道寄生蟲進行檢測，發(fā)現(xiàn)Mini-Flotac 是蠕蟲感染最敏感的檢測方法，也是一種有效、敏感且成本低廉的替代技術(shù)[5]。Mini-Flotac 檢測方法的優(yōu)點在于時間上更加的高效，操作流程更加的便捷，對蟲卵的鑒定也更加的準(zhǔn)確，最主要的優(yōu)點是可在400 倍顯微鏡下觀察，其材質(zhì)為聚碳酸酯無定形熱塑性塑料，不易將其打碎造成不必要的損失，且該裝置是圓形封閉式的裝置，置于顯微鏡下時，液體不易溢出污染顯微鏡臺。本研究在國內(nèi)首次采用Mini-Flotac 對福建圈養(yǎng)野生動物進行糞便漂浮法檢查。

2.2 糞便中芽囊原蟲SSU rRNA 基因的PCR 擴增結(jié)果 70 份野生動物糞便樣品中，擴增出10 份約為600 bp 的陽性樣品（圖1），測序結(jié)果顯示，擴增出的10 份樣品均為芽囊原蟲陽性樣品，總感染率為14.29%（10/70），陽性樣品分別來源于7 份梅花鹿、1 份赤猴、1 份孔雀和1 份獼猴，表明這些野生動物存在芽囊原蟲感染。

圖1 部分野生動物糞便中芽囊原蟲PCR 鑒定Fig.1 Electrophoresis of PCR amplification for Blastocystissp.SSU rRNA of part of wildlife faecal samples

2.3 芽囊原蟲SSU rRNA 的序列分析及亞型分布通過序列比對拼接，10 個陽性序列歸類為5 個不同的序列，上傳至NCBI 數(shù)據(jù)庫，獲得登錄號為MK357782～MK357786，并構(gòu)建了SSU rRNA 基因序列的進化樹。結(jié)果顯示，本研究獲得的10 個芽囊原蟲陽性分離株處于5 個不同的分支，分布于5 種不同基因亞型（圖2），其中7 份梅花鹿源芽囊原蟲中，1 份屬于ST 14 亞型，6 份為ST 10，表明芽囊原蟲ST 10 在梅花鹿中感染普遍，這與其它文獻[6]中報道的ST10 為偶蹄動物的優(yōu)勢亞型一致。其它芽囊原蟲樣品中，赤猴源為ST 3 亞型、孔雀源為ST 6 亞型、獼猴源為ST 1 亞型。這些亞型中，ST1、ST3 和ST6 為人獸共患亞型，其中ST1 在非人類靈長類中感染最多，ST10 和ST14 為動物特異性亞型[6]。

圖2 基于SSU rRNA基因片段的芽囊原蟲亞型NJ系統(tǒng)進化分析Fig. 2 Phylogenetic analysis of Blastocystis subtypes based on the SSU rRNA gene fragment using the neighbor-joining method

研究分析表明，福建地區(qū)野生動物芽囊原蟲存在人獸共患亞型，因此需要采集更多的樣品進行檢測，進一步分析該地區(qū)和不同種類的野生動物芽囊原蟲種群結(jié)構(gòu)，確定該原蟲最初是人源還是動物源[6]，為其防治提供更科學(xué)的參考依據(jù)。

本次檢測結(jié)果顯示福建地區(qū)野生動物主要感染的腸道寄生蟲為原蟲類和線蟲類，其中原蟲類感染最為嚴(yán)重，可采用氨丙啉、妥曲珠利、磺胺類藥等藥物進行驅(qū)蟲；其次為線蟲感染，可采用左咪唑、阿苯達唑、丙硫咪唑、阿維菌素等藥物進行驅(qū)蟲，同時應(yīng)加強圈養(yǎng)野生動物的地面，圈舍的消毒，及時處理野生動物產(chǎn)生的糞便，防止投喂的食物接觸糞便，做好防鼠措施，避免鼠，貓竄入圈舍，容易導(dǎo)致寄生蟲的傳播和感染。此外，本次調(diào)查結(jié)果表明，福建省野生動物芽囊原蟲存在人獸共患風(fēng)險，在飼養(yǎng)和接觸過程中應(yīng)當(dāng)注意防范，加強環(huán)境衛(wèi)生和個人衛(wèi)生，防止食源性污染是降低感染的有效途徑。