抑制奶牛乳房炎源金黃色葡萄球菌的乳酸菌的篩選

陳宏偉，姜 云，郭雪峰，張秀萍*

（1. 塔里木大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2. 新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團第二師畜牧獸醫(yī)工作站，新疆 鐵門關(guān) 841000）

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是奶牛乳房炎最主要的病原菌。它所引起的奶牛乳房炎占所有細(xì)菌性乳房炎的30%～50%[1]。細(xì)菌性乳腺炎導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能下降，牛奶品質(zhì)不佳，嚴(yán)重威脅人類健康。臨床上多采用抗生素方法治療奶牛乳房炎，隨著抗生素的使用，耐藥性菌株大量出現(xiàn)，特別是耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）流行株的逐年增多，常導(dǎo)致奶牛乳房炎慢性和復(fù)發(fā)性感染，使臨床治療更加困難。奶牛養(yǎng)殖業(yè)是新疆地區(qū)重要的產(chǎn)業(yè)之一，目前新疆流行的臨床型奶牛乳房炎MRSA 優(yōu)勢序列型主要是ST188、ST9、 ST63、 ST2700、 ST968、 ST2373、 ST398、ST2393、t034、t189，多重耐藥率高，而且從牛乳中分離到人源性ST188，ST9[2-3]，這說明MRSA 可在不同的宿主物種之間傳播、進化、感染。因此，尋找綠色安全的控制策略具有重要的公共衛(wèi)生意義。

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）具有防治奶牛乳房炎的功效。S.aureus 能黏附、內(nèi)吞到乳腺上皮細(xì)胞，借助各種表面蛋白和毒力因子侵入乳腺組織內(nèi)部定植并增殖，刺激炎癥應(yīng)答反應(yīng)。LAB 抑制乳房炎性S.aureus 的機理主要有兩種機制：一種是黏附、競爭和內(nèi)吞抑制機制，另一種是炎癥免疫抑制機制[4]。LAB 防治奶牛乳房炎已經(jīng)取得了一定的臨床效果，而且從乳與乳制品中分離出的LAB 治療乳房炎更具有其獨特的同源性優(yōu)勢。

新疆不同牧區(qū)鮮牛乳和哈薩克族傳統(tǒng)乳制品酸奶疙瘩中蘊含豐富的LAB 資源[5]，從中開發(fā)高效、穩(wěn)定、安全的天然抗病原菌株對防治本地常發(fā)病奶牛乳房炎和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)牛奶具有極大的研究和應(yīng)用價值。因此，本研究以前期工作中分離到的奶牛乳房炎源S.aureus N2作為指示菌，從新疆巴音布魯克牧區(qū)乳品原料中篩選對其具有抗菌作用的LAB，為研發(fā)LAB 生物防控制劑提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 從新疆和靜縣巴音布魯克牧區(qū)無菌采集新鮮牛乳4 份，傳統(tǒng)發(fā)酵成品酸奶疙瘩4 份，加冰袋放入保溫箱迅速帶回實驗室。以前期研究分離到的奶牛乳房炎S.aureus N2作為抑菌檢測指示菌，該分離株具有廣泛的耐藥性，對苯唑西林高度敏感，具有較強的生物被膜（BF）形成能力，攜帶7 個BF 形成相關(guān)基因（icaA、icaD、icaR、sigB、sarA、rbf、sasG）和4 種腸毒素基因sea、sec、seg、sei，由兵團南疆環(huán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室保存[6]。

MRS 培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基、TSB 培養(yǎng)基、Nisin A 標(biāo)準(zhǔn)品（效價1×106IU/g）和透析袋MD34（3500）均購自青島海博生物技術(shù)有限公司；2×Easy Tap PCR SuperMix、DL2000 DNA Marker 和瓊脂糖均購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 LAB 的分離純化及抑菌能力的檢測 樣品以10 倍梯度連續(xù)稀釋，取10-4、10-5、10-63 個梯度稀釋液涂布于MRS 固體培養(yǎng)基上，于5%CO237 ℃培養(yǎng)48 h。觀察記錄菌落形態(tài)特征，在MRS 平板上劃線分離純化。將純化后革蘭染色陽性、過氧化氫酶試驗陰性的菌落接種至MRS 斜面。采用雙層瓊脂擴散法進行分離株抑菌能力的檢測[7]：將50 ℃左右TSB軟瓊脂倒入滅菌平皿，冷卻后放置3 個牛津杯，傾倒含有S.aureus N2的TSB 軟瓊脂，在牛津杯孔中加入分離株培養(yǎng)液，于37 ℃培養(yǎng)24 h，用游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。對分離菌進行菌體形態(tài)觀察。

1.3 LAB 16S rDNA 基因測序 選取有抑菌能力的分離株接種于MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，提取基因組DNA，利用細(xì)菌通用引物27F：5'-AGAGTTTGATCMTGGTCAG-3'和1492R：5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'，PCR 擴 增16S rDNA 基 因 片 段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序菌株16S rDNA基因序列與NCBI 中已知序列進行同源性比對，確定測序菌株的屬種。

1.4 LAB 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定 利用待測LAB 24 h 的培養(yǎng)液，以3%的接種量接入MRS 液體培養(yǎng)基，于5%CO237 ℃恒溫培養(yǎng)36 h。每隔2 h測定培養(yǎng)液OD600nm值和pH 值，每次測定3 個重復(fù)，取平均值，分別以O(shè)D600nm平均值和pH 平均值為縱坐標(biāo)，以時間為橫坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線及產(chǎn)酸曲線。

1.5 LAB 細(xì)菌素提取與效價檢測

1.5.1 LAB 細(xì)菌素的提取 將培養(yǎng)20 h 的菌株培養(yǎng)液4 ℃離心取上清液，加入等量飽和度60%硫酸銨溶液，4 ℃攪拌過夜，離心，沉淀用3.5 ku 透析袋透析24 h。然后4 ℃離心，收集沉淀，真空冷凍干燥。1.5.2 LAB 細(xì)菌素的效價檢測 準(zhǔn)確稱取0.1 g Nisin 標(biāo)準(zhǔn)品溶于1 mL 0.02 mol/L 的稀鹽酸中，得到效價為105IU/mL 的標(biāo)準(zhǔn)液。采用濃度為0.02 mol/L 的稀鹽酸進行2 倍稀釋，使得溶液的終濃度分別達到5×104IU/mL、2.5×104IU/mL、1.25×104IU/mL、6.25×103IU/mL、3 125 IU/mL、1 562.5 IU/mL，按雙層瓊脂擴散法測定抑菌活性，各濃度梯度設(shè)3 個重復(fù)，以平均抑菌圈直徑為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的效價對數(shù)值為橫坐標(biāo)，繪制Nisin 效價標(biāo)準(zhǔn)曲線。

細(xì)菌素凍干粉用PBS（pH 7.0）緩沖液溶解配制成濃度為10 mg/mL 的使用液，檢測其抑菌活性，細(xì)菌素測定液設(shè)3 個重復(fù)，將抑菌圈直徑平均值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式，計算LAB 粗細(xì)菌素效價。

2 結(jié) 果

2.1 LAB 的分離及抑菌活性的檢測 本次研究從新疆和靜縣巴音布魯克牧區(qū)采集的4 份鮮乳，4 份傳統(tǒng)酸奶疙瘩中分離到18 株細(xì)菌，經(jīng)雙層瓊脂擴散法篩選到5 株對指示菌S. aureus 具有明顯抑制作用的LAB，觀察對應(yīng)菌體形態(tài)顯示有革蘭陽性桿菌2株，球菌3 株（圖1）。

圖1 5 株分離菌的抑菌試驗結(jié)果及菌體形態(tài)特征(革蘭染色100×10）Fig.1 Inhibitory effects and morphological characteristics of five isolates

2.2 LAB 16S rDNA 基因測序 利用細(xì)菌通用引物對所提取的5 株分離株的16S rDNA 基因組進行PCR擴增，均獲得約1 500 bp 片段（圖2）。PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)測序后進行分析比對，結(jié)果顯示分離株與希氏乳桿菌（Lactobacillus hilgardii）、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）及乳酸乳球菌亞種（Lactococcus lactis subsp.）各自同源性均為100%。表明本次分離到的5 株LAB 為希氏乳桿菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌、戊糖片球菌及乳酸乳球菌亞種。

2.3 LAB 生長曲線和產(chǎn)酸曲線的測定 通過分光光度計法測得5 株LAB 的生長曲線，呈現(xiàn)了快、中、慢3 種趨勢：希氏乳桿菌生長曲線高于其它4種，表明該菌增殖速度較快數(shù)量多；干酪乳桿菌、糞腸球菌和乳酸乳球菌3 種細(xì)菌增殖能力相當(dāng)，戊糖片球菌生長曲線低于其它4 種菌，表明該菌增殖速度較慢（圖3）。

5 株LAB pH 值變化規(guī)律顯示培養(yǎng)液接種2 h 左右開始產(chǎn)酸，pH 值由6.0 降到5.5 左右，培養(yǎng)15 h 后pH 值降到5.0 以下，保持在3.8～5.0。希氏乳桿菌、干酪乳桿菌的曲線在底端，表明它們產(chǎn)酸速率快、產(chǎn)酸能力強（圖4）。

圖2 5 株分離菌的16S rDNA 基因組PCR 擴增結(jié)果Fig.2 Results of 16S rDNA gene PCR amplicons of five isolates

圖3 5 個分離株生長曲線的測定結(jié)果Fig.3 Growth curves of five isolates

圖4 5 個 分 離 株36 h 內(nèi)pH 變 化Fig.4 Dynamic change of pH value of the five isolates in 36 hours

綜合以上結(jié)果顯示，5 株LAB 的生長規(guī)律和產(chǎn)酸規(guī)律存在對應(yīng)關(guān)系：0～2 h 為停滯期，菌體濃度無明顯增加，pH 有微小幅度下降（0.2～0.5）；2 h 后進入對數(shù)生長期，菌體生長代謝旺盛，產(chǎn)生大量有機酸，pH 迅速下降；20 h 左右達到生長穩(wěn)定期，菌體濃度逐漸趨于穩(wěn)定，pH 也逐步趨于穩(wěn)定；30 h 后進入衰亡期，pH 有微幅上升，但低于4.8。生長曲線和產(chǎn)酸趨勢表明分離到的5 株LAB 的生長速率和產(chǎn)酸速率呈正相關(guān)關(guān)系。

2.4 LAB 細(xì)菌素提取與效價檢測 對5 株LAB 培養(yǎng)20 h 培養(yǎng)液離心后采用飽和度60%硫酸銨溶液鹽析，提取到分子量在3.5 ku 內(nèi)的粗細(xì)菌素，其平均抑菌圈直徑分別為：25.0 mm、27.0 mm、26.0 mm、28.5 mm和27.0 mm。通過制作Nisin 效價標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸方程：Y=5.7619X-9.6762，R2=0.992，經(jīng)計算5株LAB的粗提物的效價分別為：希氏乳桿菌457 IU/mL，干酪乳桿菌1 023 IU/mL，糞腸球菌676 IU/mL，戊糖片球菌1 862 IU/mL，乳酸乳球菌1 023 IU/mL。抑菌結(jié)果表明5株LAB的粗細(xì)菌素具有抑菌作用。

3 討 論

雖然國內(nèi)外已有用于防治牛乳房炎的LAB 制劑，但效果明顯的產(chǎn)品種類很少，而且對LAB 與病原菌的相關(guān)性，LAB 與宿主機體之間的互作機理研究尚處于初級階段。本研究從新疆草原地區(qū)新鮮牛乳及發(fā)酵乳品中分離到的5 株LAB，活菌和提取物細(xì)菌素均有穩(wěn)定的抑菌特性，表明分離株符合篩選目標(biāo)。益生菌可以提高畜禽機體免疫力，生產(chǎn)實踐中直接給畜禽飼喂LAB 制劑，可以調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境，改善腸道黏膜免疫系統(tǒng)狀態(tài)。有研究報道干酪乳桿菌、乳酸乳球菌亞種、戊糖片球菌和糞腸球菌屬于應(yīng)用效果好的菌種之列[8]，與本實驗分離菌種一致。

產(chǎn)酸能力是LAB 發(fā)揮抑制病原作用的重要因素之一。本次分離到的5 株LAB 的生長速率和產(chǎn)酸速率呈正相關(guān)，培養(yǎng)15 h 后pH 值降到5.0 以下，之后保持在3.8～5.0，根據(jù)細(xì)菌素的分泌規(guī)律，即一般都是在細(xì)菌的對數(shù)生長期中期開始合成并分泌，且隨著細(xì)菌數(shù)量的增多而增加分泌，直到生長平臺期的早期達到分泌的最高峰，本次研究在20 h 時對培養(yǎng)液進行提取細(xì)菌素，此時活菌數(shù)量最多，推測產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物生物活性效果應(yīng)該最佳。通過提取細(xì)菌素檢測抑菌效果，結(jié)果5 株LAB 均具有良好的抑菌活性，這與其他研究者認(rèn)為LAB 在培養(yǎng)液pH 4.0～5.0 時具有抑菌能力，但當(dāng)pH≥5 時對部分致病菌無抑菌性的試驗結(jié)論相一致，表明分離株抑菌活性作用的發(fā)揮要在一定的酸性范圍。

本次分離株戊糖片球菌雖然生長緩慢，產(chǎn)酸能力較弱，但是粗提細(xì)菌素的效價最高，這可能與戊糖片球菌和S.aureus 的近緣性有關(guān)。分離株希氏乳桿菌的生長性能和產(chǎn)酸性能均較強，但與其他4 種LAB 相比，希氏乳桿菌粗提細(xì)菌素的效價最低，說明希氏乳桿菌的代謝抑菌物質(zhì)可能存在其他機酸產(chǎn)物，或者飽和度60% 硫酸銨溶液鹽析不是最佳提取條件。希氏乳桿菌是一種厭氧菌，對營養(yǎng)要求不高，常致發(fā)酵食品和酒精飲料腐敗，但是近年研究發(fā)現(xiàn)它能抑制黃曲霉的生長和黃曲霉毒素B1（AFB1）的產(chǎn)生[9]，對革蘭陰性桿菌如成團腸桿菌、陰溝腸桿菌、肺炎克雷伯菌亞種有抑制作用，但對革蘭陽性菌沒有抑制作用[10]。本次分離株希氏乳桿菌增殖和產(chǎn)酸速率快，國內(nèi)首次證明對S.aureus 有抑制作用。

篩選拮抗奶牛乳房炎病原菌的菌株應(yīng)具備以下特性：能黏附到乳腺上皮細(xì)胞（bMEC）、定殖、形成生物膜、疏水性、自凝集性、產(chǎn)生抗菌代謝產(chǎn)物等。目前一些干酪乳桿菌分離株和乳酸乳球菌亞種分離株被證明具有顯著的抑制S.aureus 粘附、侵入bMEC 的能力，如CI2、BL23、CIRM-BIA 667，CRL 1655，LMG 7930，V7，DPC 3251 等[11-16]。龔虹，Espeche 等認(rèn)為戊糖片球菌疏水性、自凝集性和生物膜的形成能力均較弱，不適合作候選菌株[17-18]。糞腸球菌也被認(rèn)為是奶牛乳房炎的致病菌之一，但生成生物膜能力強，對bMEC 黏附能力強[19]，有希望通過基因工程改造為有益菌。因此，后續(xù)研究將檢測分離株對bMEC 的黏附能力。

從新疆巴音布魯克牧區(qū)鮮乳和酸奶疙瘩中篩選到5 株LAB 即希氏乳桿菌、干酪乳桿菌、糞腸球菌、戊糖片球菌和乳酸乳球菌，分離株通過在低酸環(huán)境下產(chǎn)生細(xì)菌素發(fā)揮抑制S.aureus 生長的作用。