BHK-21 細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)新城疫病毒

姬阿美，白春麗，葉 倩，周 燕*，劉旭平,2*，譚文松,2，劉志亮

（1. 華東理工大學(xué)生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200237；2. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203；

3.山東信得動(dòng)物疫苗有限公司，山東 諸城 262204）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由ND 病毒（NDV）感染所引起的一種禽類(lèi)急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病。該傳染病分布于世界各地，致死率極高，被國(guó)際獸醫(yī)局定為A 類(lèi)烈性傳染病[1-2]，是目前危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疫病之一。

接種疫苗是防控ND 最有效的策略。但采用傳統(tǒng)的雞胚工藝生產(chǎn)ND 疫苗，存在操作復(fù)雜、生產(chǎn)效率低、規(guī)模放大受限、SPF 級(jí)雞胚來(lái)源有限以及雞胚殘?bào)w處理困難等缺點(diǎn)[3]。而以動(dòng)物細(xì)胞作為病毒增殖的基質(zhì)生產(chǎn)疫苗，具有生產(chǎn)工藝易于放大、生產(chǎn)周期短、疫苗純度高、穩(wěn)定性好、抗原特性更接近自然株等優(yōu)勢(shì)[4]。近年來(lái)，一些原代細(xì)胞和細(xì)胞系已用于NDV 的增殖，包括雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）、雞胚肝臟（CEL）細(xì)胞、DF-1（源自CEF）細(xì)胞、非洲綠猴腎（Vero）細(xì)胞和乳倉(cāng)鼠腎細(xì)胞（BHK-21）[5-10]。但原代細(xì)胞生命周期有限，經(jīng)數(shù)次傳代后逐漸衰老，需要重新獲取。此外，這些細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的特點(diǎn)，不但影響生產(chǎn)過(guò)程的規(guī)?；?，而且培養(yǎng)過(guò)程常需添加5%～10%血清。由于血清成分復(fù)雜，含多種雜蛋白，可能攜帶病毒及支原體等污染源，導(dǎo)致生產(chǎn)過(guò)程不穩(wěn)定，進(jìn)而影響疫苗產(chǎn)品質(zhì)量。因此，建立基于無(wú)血清懸浮細(xì)胞培養(yǎng)工藝生產(chǎn)ND 疫苗是未來(lái)該產(chǎn)業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)。

工藝參數(shù)的合適與否會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、病毒的產(chǎn)量以及生產(chǎn)過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性。因此，參數(shù)優(yōu)化是病毒生產(chǎn)工藝建立過(guò)程中重要的環(huán)節(jié)。董炳梅等通過(guò)優(yōu)化NDV 在貼壁BHK-21 細(xì)胞中的增殖條件，從而建立NDV Lasota 株的貼壁細(xì)胞培養(yǎng)工藝，HA 效價(jià)達(dá)8 log2HAU/25 μL[9]。Shittu 等將懸浮培養(yǎng)的SciPC 細(xì)胞（源自雞胚胎）應(yīng)用于NDV 增殖，并探究了細(xì)胞接種密度、不同維持培養(yǎng)基對(duì)病毒產(chǎn)量的影響，最終獲得1.02×108EID50/mL 的高病毒效價(jià)[11]。在利用PBG.PK2.1 細(xì)胞擴(kuò)增甲型流感病毒的研究中，Gr?nicher等對(duì)MOI 和胰蛋白酶濃度優(yōu)化，并通過(guò)分批補(bǔ)料補(bǔ)充病毒生產(chǎn)期間的營(yíng)養(yǎng)，使病毒HA 效價(jià)提高至3.24 log10HAU/100 μL[12]。

目前，ND 疫苗的生產(chǎn)在很大程度上依賴(lài)于雞胚，主要因?yàn)榛诩?xì)胞生產(chǎn)病毒的工藝不成熟且病毒產(chǎn)量低。為了提高病毒產(chǎn)量，本研究在無(wú)血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)BHK-21 細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)NDV，通過(guò)單克隆細(xì)胞株的篩選、病毒在細(xì)胞中的傳代適應(yīng)以及工藝參數(shù)（MOI、TPCK-胰酶用量、稀釋比例）的優(yōu)化，以建立基于BHK-21細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)體系中的NDV生產(chǎn)工藝，為ND細(xì)胞苗的規(guī)?；a(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒和細(xì)胞 雞胚適應(yīng)的NDV LaSota 株，TCID50值為8.0 log10TCID50/mL，由山東信得動(dòng)物疫苗有限公司提供。將其在細(xì)胞中傳代，以獲得適應(yīng)細(xì)胞的NDV 后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。懸浮培養(yǎng)的BHK-21 單克隆株（BHK-v002、BHK-v015、BHK-v011）及貼壁BHK-21 細(xì)胞由本研究室保存。

1.2 主要試劑與儀器 DMEM 培養(yǎng)基購(gòu)自上海倍諳基生物科技有限公司；SF201 培養(yǎng)基為本研究室自主研發(fā)的無(wú)血清培養(yǎng)基；胎牛血清（FBS）購(gòu)自Biosun；0.25%（w/v）胰蛋白酶、TPCK-胰酶及臺(tái)盼藍(lán)均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；IC1000 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Counter star）購(gòu)自上海睿鈺生物科技有限公司。

1.3 BHK-21 單克隆細(xì)胞株的篩選 將3 株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-21 單克隆細(xì)胞（BHK-v002、BHKv015、BHK-v011）以6.0×106個(gè)/mL 的活細(xì)胞密度（VCD）離心全換液接種至125 mL 搖瓶中，工作體積為30 mL（下同）。分別按0.1%、0.5%、1.0%的體積比接種雞胚適應(yīng)的NDV（8.0 log10TCID50/mL），并添加5 μg/mL TPCK-胰酶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中的搖床上，搖床轉(zhuǎn)速為130 r/min，培養(yǎng)96 h。每24 h 取樣，檢測(cè)VCD[13]及HA 效價(jià)[14]。其中VCD 通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色法采用IC1000 自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 BHK-v002 細(xì)胞的培養(yǎng) BHK-v002 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基SF201 中的懸浮批培養(yǎng)，即將BHK-v002細(xì)胞以0.8×106個(gè)/mL～1.0×106個(gè)/mL 的VCD 稀釋接種至搖瓶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每24 h取樣檢測(cè)VCD 和活率（Viability），直至細(xì)胞活率降至50%以下，結(jié)束培養(yǎng)?；盥实臋z測(cè)方法同VCD。

1.5 細(xì)胞適應(yīng)的NDV 的制備及病毒效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 將1.3 篩選出來(lái)的處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的BHK-v002細(xì)胞以4.0×106個(gè)/mL 的VCD 離心全換液接種至搖瓶中，按0.01%體積比接種雞胚適應(yīng)的NDV（8.0 log10TCID50/mL），并添加5 μg/mL TPCK-胰酶，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，每24 h 取樣，檢測(cè)細(xì)胞VCD 和病毒TCID50效價(jià)[15]。接毒后48 h（Hours post infection，hpi）收集的病毒液作為第一代（P1），將該病毒液以同樣條件接種至細(xì)胞中，收集本輪48 hpi 病毒液作為第二代（P2），如此連續(xù)傳5～6 代，根據(jù)每代檢測(cè)結(jié)果確定病毒在細(xì)胞中傳代所得最高TCID50效價(jià)，并重復(fù)該代次以制備大批量細(xì)胞適應(yīng)的NDV 用于后續(xù)試驗(yàn)。

TPCK-胰酶的優(yōu)化：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞離心全換液，使VCD 達(dá)到6.0×106個(gè)/mL 并接種至搖瓶，按MOI為0.005加入病毒液，分別添加0、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10.0 μg/mL 的TPCK-胰 酶。其它步驟同1.3。

稀釋比例的優(yōu)化：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按VCD 為6.0×106個(gè)/mL、工作體積為30 mL 計(jì)算需要吸取的體積，離心并收集上清液，按上清液∶新鮮培養(yǎng)基為3∶1、2∶1、1∶1、1∶2的比例稀釋?zhuān)?0 mL稀釋好的上清液重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)入搖瓶。將離心全換液（ME）組設(shè)置為對(duì)照組。按MOI為0.005加入病毒液，并添加5.0 μg/mL TPCK-胰酶，其它步驟同1.3。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究數(shù)據(jù)表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，采用雙尾獨(dú)立t 檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。p＞0.05為不顯著；* ：p＜0.05 為顯著；**：p＜0.01 為極顯著；***：p＜0.001 為極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 BHK-21 單克隆細(xì)胞株的篩選結(jié)果 將BHKv002、BHK-v015、BHK-v011 細(xì)胞株按照不同體積比接種NDV，檢測(cè)各個(gè)細(xì)胞株的VCD 及NDV 的HA效價(jià)。結(jié)果顯示，無(wú)論采用哪種體積比，BHK-v015和BHK-v011 細(xì)胞在24 hpi 后VCD 均開(kāi)始下降；而B(niǎo)HK-v002 細(xì)胞在該時(shí)間仍然維持較高的VCD，48 hpi 后VCD 逐漸下降。當(dāng)接種病毒體積比為0.1%、0.5%和1.0%時(shí)，BHK-v002 細(xì)胞接種的NDV 最高HA效價(jià)分別為8.3 log2HAU/25μL、8 log2HAU/25μL、8.3 log2HAU/25μL，顯著高于其它兩株細(xì)胞（p＜0.05，p＜0.01）（圖1）?？紤]到經(jīng)濟(jì)性，采用BHK-v002 細(xì)胞以0.1%的體積比接種NDV 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 BHK-v002 細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果 在無(wú)血清培養(yǎng)基SF201 中分別利用懸浮批培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)兩種模式培養(yǎng)BHK-v002 細(xì)胞，并檢測(cè)兩種培養(yǎng)模式下細(xì)胞的VCD 和活率，并計(jì)算傳代培養(yǎng)細(xì)胞的μ。結(jié)果顯示，當(dāng)進(jìn)行懸浮批培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞接種密度約為1.0×106個(gè)/mL，培養(yǎng)至72 h 達(dá)到最高VCD，為12.0×106個(gè)/mL。此后，VCD 開(kāi)始下降，培養(yǎng)至96 h 之前，活率均維持在95%以上（圖2A）。當(dāng)進(jìn)行懸浮傳代培養(yǎng)時(shí)，按VCD 為0.8×106個(gè)/mL～1.0×106個(gè)/mL 接種細(xì)胞，每48 h 傳代一次，連續(xù)傳8 代，各代次細(xì)胞生長(zhǎng)最高密度均達(dá)到9.5×106個(gè)/mL ～9.8×106個(gè)/mL，μ維持在1.0 d-1～1.1 d-1（圖2B）。可見(jiàn)，BHK-v002 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基SF201中連續(xù)傳代，其生長(zhǎng)具有穩(wěn)定性。

2.3 細(xì)胞適應(yīng)的NDV 的制備及病毒效價(jià)的測(cè)定結(jié)果 將雞胚適應(yīng)的NDV 按0.01%體積比在BHK-v002細(xì)胞中傳代，確定傳代代次，并制備適應(yīng)BHKv002 細(xì)胞的NDV。結(jié)果顯示，前3 代細(xì)胞，48 hpi后VCD 開(kāi)始下降；而P4～P6 代細(xì)胞，24 hpi 后VCD即開(kāi)始下降，且最高VCD 要低于P1～P3 代（圖3A）。隨著病毒在細(xì)胞中的傳代，收獲的P1～P4 代病毒液的TCID50逐漸提高，至P4 代時(shí)病毒液的TCID50為8.6 log10TCID50/mL，極顯著高于前3 代（p＜0.01），P5代趨于穩(wěn)定。但從P6 代開(kāi)始，TCID50效價(jià)呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（圖3B）。重復(fù)P4 代（Re-P4）制備細(xì)胞適應(yīng)的NDV。將P3 代收獲的病毒液接入細(xì)胞培養(yǎng)物，48 hpi 收獲病毒液200 mL，分裝于凍存管中，-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＝?jīng)測(cè)定，制備的細(xì)胞適應(yīng)的NDV TCID50為8.8 log10TCID50/mL。

圖1 接種不同體積比的NDV 后3 株BHK-21 單克隆細(xì)胞的VCD（A）和HA 效價(jià)（B）檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Result of viable cell density(A)and HA titer(B)of three BHK-21 monoclonal cells after inoculating with different volume ratios of NDV

圖2 無(wú)血清懸浮培養(yǎng)下BHK-v002 細(xì)胞的批培養(yǎng)生長(zhǎng)曲線(xiàn)（A）和連續(xù)傳代生長(zhǎng)曲線(xiàn)（B）Fig.2 Batch culture grow curve(A)and continuous passage grow curve(B)of BHK-v002 cells in serum-free suspension culture

2.4 MOI 的優(yōu)化結(jié)果 將NDV 以不同的MOI 接種至BHK-v002 細(xì)胞后，檢測(cè)VCD 和病毒HA 效價(jià)，并計(jì)算Svy。結(jié)果顯示，MOI 越低，接種病毒后所能達(dá)到的VCD 越高，最高HA 效價(jià)（HAmax）出現(xiàn)時(shí)間越晚；相反，MOI 越高，HAmax出現(xiàn)時(shí)間越早。MOI 為0.0001 和0.005 時(shí)，HAmax較高，分別為9.7 log2HAU/25 μL、9.6 log2HAU/25 μL。進(jìn)一步比較各組的Svy顯示，當(dāng)MOI 為0.0005 和0.005 時(shí)，結(jié)果較其它組高，分別為2 566.9、2 514.7 病毒顆粒/細(xì)胞（圖4），但均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。綜合考慮HAmax和Svy 值，選擇MOI 0.005 進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.5 TPCK-胰酶濃度的優(yōu)化結(jié)果 添加不同濃度的TPCK-胰酶，檢測(cè)接毒后細(xì)胞VCD 和病毒HA 效價(jià)。結(jié)果顯示，當(dāng)不添加TPCK-胰酶時(shí)，24 hpi 后VCD 開(kāi)始下降且檢測(cè)不到病毒HA 效價(jià)；2.5 μg/mL TPCK-胰酶組較5.0 μg/mL～10.0 μg/mL TPCK-胰酶組，細(xì)胞生長(zhǎng)及產(chǎn)毒均較差；其中5.0 μg/mL TPCK-胰酶組的HAmax為9.2 log2HAU/25 μL，均高于其它組的HAmax，并且顯著高于2.5 μg/mL TPCK-胰酶組（p＜0.05）（圖5）。后續(xù)試驗(yàn)將TPCK-胰酶濃度設(shè)置為5.0 μg/mL，既能保證病毒具有較強(qiáng)的感染力，也可獲得較高的病毒產(chǎn)量。

圖4 不同MOI 對(duì)NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中增殖的影響結(jié)果Fig.4 Effect of different MOI on proliferation of NDV in BHK-v002 cells

圖5 TPCK-胰酶濃度對(duì)NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中增殖的影響結(jié)果Fig.5 Effect of TPCK-trypsin concentration on proliferation of NDV in BHK-v002 cells

2.6 稀釋比例的優(yōu)化結(jié)果 在基于細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)生產(chǎn)NDV的過(guò)程中，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物被大量消耗，代謝副產(chǎn)物不斷產(chǎn)生，并最終影響細(xì)胞生長(zhǎng)和病毒生產(chǎn)，因此，培養(yǎng)過(guò)程中需要補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基。由于全換液（ME）操作繁瑣，所以采用新鮮培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞液的方式補(bǔ)充病毒生產(chǎn)期間所需營(yíng)養(yǎng)物，并降低代謝副產(chǎn)物濃度。結(jié)果顯示，補(bǔ)加的新鮮培養(yǎng)基越多，接種病毒后細(xì)胞的生長(zhǎng)越接近于ME 對(duì)照組。培養(yǎng)上清液與新鮮培養(yǎng)基以2∶1～1∶2比例稀釋時(shí)，病毒HAmax均能達(dá)到8.5 log2HAU/25 μL。當(dāng)培養(yǎng)上清液與新鮮培養(yǎng)基的比例為2∶1 和1∶1 時(shí)，二者的Svy 相當(dāng)，分別為1 724.5 和1 749.3 病毒顆粒/細(xì)胞（圖6）。考慮到生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性，選擇細(xì)胞液與培養(yǎng)基的比例為2∶1（20 mL 細(xì)胞液+10 mL 培養(yǎng)基），即將細(xì)胞從9.0×106個(gè)/mL稀釋到6.0×106個(gè)/mL接種病毒。

圖6 稀釋比例對(duì)NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中增殖的影響結(jié)果Fig.6 Effect of dilution ratio on proliferation of NDV in BHK-v002 cells

2.7 無(wú)血清懸浮培養(yǎng)NDV 工藝的建立 將20 mL 生長(zhǎng)至48 h 約9.0×106個(gè)/mL 的BHK-v002 細(xì)胞接種至搖瓶，補(bǔ)充10 mL 新鮮培養(yǎng)基。按MOI 0.005 加入病毒液，并添加5.0 μg/mL 的TPCK-胰酶，檢測(cè)接毒后VCD、HA效價(jià)及TCID50效價(jià)。結(jié)果顯示，接種病毒后24 h達(dá)最高VCD，此后逐漸下降，培養(yǎng)至144 h；接毒后，病毒HA效價(jià)逐漸升高，至接種病毒后144 h達(dá)最高水平，為8.5 log2HAU/25 μL，TCID50在細(xì)胞培養(yǎng)至96 h，即接毒后48 h 達(dá)最大值，為7.9 log10TCID50/mL（圖7）。通過(guò)計(jì)算，Svy 為1 685.9 病毒顆粒/細(xì)胞?？傊瑧腋HK-v002 細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基SF201 中具備高密度生長(zhǎng)能力以及優(yōu)異的產(chǎn)毒能力，可能成為ND疫苗工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)秀候選細(xì)胞。

圖7 在NDV 最適增殖條件下，BHK-v002 細(xì)胞的VCD 及NDV 的效價(jià)檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Results of VCD and titers of NDV in BHK-v002 cells under optimal proliferation conditions

3 討 論

在基于細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)NDV 過(guò)程中，細(xì)胞株、病毒種子來(lái)源及工藝參數(shù)等諸多因素影響病毒產(chǎn)量。本研究結(jié)果顯示，NDV 在3 株BHK-21 單克隆細(xì)胞株中的增殖存在差異，其中BHK-v002 細(xì)胞中NDV 的增殖能力最強(qiáng)。張良艷等從制備的97 株單克隆化MDCK 細(xì)胞中，篩選到一株甲型H1N1 流感病毒高度適應(yīng)性的單克隆細(xì)胞株[16]。其中原因，可能是細(xì)胞表面病毒受體的類(lèi)型和數(shù)量存在個(gè)體差異所致[17]，也可能因?yàn)椴煌?xì)胞中病毒復(fù)制效率存在差異。

鑒于病毒在細(xì)胞中增殖存在適應(yīng)過(guò)程，本研究將NDV 在BHK-v002 細(xì)胞中連續(xù)傳代，傳至P4 和P5代，病毒效價(jià)逐漸穩(wěn)定，P6 代病毒效價(jià)開(kāi)始下降；P1～P3 代病毒在48 hpi 達(dá)到最高VCD，而P4～P6 代病毒最高VCD 提前24 h，并且低于前3 代。這一結(jié)果與Yurchenko 等的研究結(jié)果相似，將4 株不同來(lái)源的NDV 在貼壁Vero 細(xì)胞中傳至P7 或P8 代后，病毒效價(jià)趨于穩(wěn)定；傳代過(guò)程中除了TCID50效價(jià)的增加，細(xì)胞單層中死細(xì)胞的聚集（病毒作用的表現(xiàn)）更明顯且出現(xiàn)的時(shí)間更早[18]。

MOI 是感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。MOI 過(guò)低，感染細(xì)胞的病毒數(shù)量不夠，易造成大量細(xì)胞浪費(fèi)；而高M(jìn)OI 意味著需要準(zhǔn)備大量的病毒。為了獲得足夠多的病毒，必然要反復(fù)增殖病毒，不僅制備過(guò)程繁瑣，而且會(huì)帶來(lái)病毒學(xué)上的“代次效應(yīng)”，也就是連續(xù)擴(kuò)增而使病毒活性下降的問(wèn)題。此外，有研究顯示，缺陷干擾病毒顆粒會(huì)影響正常病毒的增殖，在高M(jìn)OI 條件下這種現(xiàn)象尤為明顯[19]。因此，MOI 的優(yōu)化是工藝建立過(guò)程中重要的步驟。本研究結(jié)果顯示，MOI 越高，病毒HAmax出現(xiàn)的時(shí)間越早；而MOI 越低，病毒HAmax的延遲期越長(zhǎng)。在Shittu[11]和Audsley[19]的研究中同樣也觀(guān)察到這一現(xiàn)象，高M(jìn)OI 導(dǎo)致病毒同步生長(zhǎng)，比低MOI 更早達(dá)到病毒效價(jià)的峰值。NDV 弱毒株感染細(xì)胞時(shí)常需添加適量的胰酶，這是因?yàn)橐让改軐DV 的融合蛋白（F）不具活性的前體F0 水解成有活性的F1 和F2，從而介導(dǎo)病毒包膜與細(xì)胞膜的融合[20]。本研究結(jié)果顯示，不添加TPCK-胰酶組檢測(cè)不到病毒HA 效價(jià)。因此，胰酶的添加是NDV 弱毒株感染細(xì)胞所必須的。流感病毒的增殖也需要添加胰酶，病毒才能有效的增殖[21]。隨著胰酶濃度的提高，5.0 μg/mL 實(shí)驗(yàn)組的HA 效價(jià)顯著高于2.5 μg/mL 實(shí)驗(yàn)組，而7.5 μg/mL 和10 μg/mL 實(shí)驗(yàn)組的病毒HA 效價(jià)出現(xiàn)下降的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊囊让笗?huì)使病毒降解[21]。

本研究篩選了適于NDV 增殖的BHK-21 單克隆細(xì)胞株，并將雞胚適應(yīng)的NDV 在篩選獲得的細(xì)胞株（BHK-v002）中傳至P4 代，又獲得細(xì)胞適應(yīng)的NDV。在確定的最佳病毒增殖條件下，HAmax達(dá)到8.5 log2HAU/25 μL，Svy 達(dá)1 685.9 病 毒 顆 粒/細(xì) 胞，最高TCID50效價(jià)為7.9 log10TCID50/mL。在達(dá)到相當(dāng)TCID50效價(jià)條件下，本研究利用懸浮培養(yǎng)BHK-v002細(xì)胞生產(chǎn)的NDV 比貼壁BHK-21 細(xì)胞培養(yǎng)的NDV 高0.5 log2HAU/25 μL[9]。目前關(guān)于ND 細(xì)胞苗的研究多集中在貼壁細(xì)胞培養(yǎng)上，因此，在無(wú)血清培養(yǎng)基中具備高密度生長(zhǎng)能力和優(yōu)異的病毒增殖能力的BHK-v002 細(xì)胞，有望成為ND 疫苗生產(chǎn)的理想候選細(xì)胞。

本研究把懸浮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)應(yīng)用于ND 疫苗的制備，建立了基于BHK-21 細(xì)胞無(wú)血清懸浮培養(yǎng)體系中的NDV 生產(chǎn)工藝，為ND 細(xì)胞苗的工業(yè)化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持，也為不同細(xì)胞系中其它病毒疫苗的生產(chǎn)提供方法借鑒。