激光掃描共聚焦顯微鏡對(duì)渦狀區(qū)和中央?yún)^(qū)角膜上皮基底神經(jīng)叢檢測(cè)一致性比較

于花 苗英彬 趙少貞

角膜上皮基底神經(jīng)叢在維持角膜的敏感性、保護(hù)角膜上皮的完整性及促進(jìn)上皮細(xì)胞的增殖和修復(fù)方面具有重要的作用[1]，其形態(tài)學(xué)觀察與分析對(duì)多種眼表疾病的診斷和療效評(píng)價(jià)具有重要意義。以往的研究通常利用激光掃描共聚焦顯微鏡(laser scanning confocal microscopy，LSCM)對(duì)中央?yún)^(qū)的角膜上皮基底神經(jīng)叢進(jìn)行分析。但是，由于LSCM觀察視野小，且缺乏定位功能，每次測(cè)量的確切位置并不明確，使得不同患者或同一患者在不同時(shí)間采集的圖像變異較大，可靠性較差。這種誤差在療效評(píng)價(jià)和隨訪研究中表現(xiàn)得尤為突出。因此，亟需挑選合理的檢查部位和查找目標(biāo)，提高設(shè)備參數(shù)的可靠性與可重復(fù)性，從而提升LSCM檢查的臨床指導(dǎo)價(jià)值。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，角膜上皮基底神經(jīng)叢呈放射狀向中央聚集，在角膜頂點(diǎn)的鼻下方形成一個(gè)渦狀結(jié)構(gòu)[2]。由于這一結(jié)構(gòu)形態(tài)特殊，能成為重復(fù)測(cè)量的良好標(biāo)志。本研究通過(guò)比較中央?yún)^(qū)和渦狀區(qū)角膜上皮基底神經(jīng)叢測(cè)量結(jié)果的一致性，篩選出更加合理可靠的檢查部位，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料前瞻性研究。2018年11月至2019年2月募集年齡在20～40歲的健康志愿者作為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～40歲；(2)眼壓正常；(3)裂隙燈檢查眼表無(wú)明顯炎癥，角膜光滑、透明。排除標(biāo)準(zhǔn)：干眼病史；角膜接觸鏡配戴史；眼外傷及眼部手術(shù)史；翼狀胬肉、圓錐角膜、過(guò)敏性結(jié)膜炎、感染性角結(jié)膜炎、青光眼病史或眼部持續(xù)用藥史者；以及患有任何影響神經(jīng)功能的系統(tǒng)性疾病者(如糖尿病、腦梗、甲狀腺功能亢進(jìn)等)。最終共納入受試者30人，其中男10人，女20人，年齡(30.53±4.93)歲。本研究經(jīng)山西省眼科醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(倫理號(hào)：201804b)，取得受試者知情同意后進(jìn)行檢查。

1.2 方法

1.2.1 LSCM檢查使用海德堡Ⅱ代激光斷層掃描系統(tǒng)(HRT-Ⅱ)(德國(guó)海德堡工程有限公司)的Rostock角膜模塊完成。入組受試者均選擇右眼為受檢眼。由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師共完成3次檢查。首先于檢查當(dāng)天由操作者A和操作者B各完成1次檢查，1周后再由操作者A重復(fù)檢查1次。檢查使用2 g·L-1卡波姆滴眼液(唯地息，德國(guó)格哈德博士曼醫(yī)藥化工有限公司)作為角膜接觸帽與鏡頭之間的耦合劑。受試者用2 g·L-1丙美卡因(愛爾凱因，美國(guó)愛爾康公司比利時(shí)分公司)表面麻醉后，左眼注視正前方。檢查者調(diào)整物鏡位置，使激光光束位于受檢者右眼角膜頂點(diǎn)。按照Patel等[2]報(bào)道的方法，囑受試者左眼注視以“米”字方式移動(dòng)的視標(biāo)，使用“section”模式采集中央約2 mm范圍內(nèi)的角膜上皮基底神經(jīng)叢圖像。然后緩慢向外上方移動(dòng)視標(biāo)，囑受試者左眼跟隨視標(biāo)移動(dòng)，LSCM觀察右眼角膜上皮基底神經(jīng)叢形態(tài)。觀察到渦狀結(jié)構(gòu)后，再以渦狀結(jié)構(gòu)地理中心處的視標(biāo)位置為中心，以“米”字方式移動(dòng)視標(biāo)，采集渦狀區(qū)約2 mm范圍內(nèi)的角膜上皮基底神經(jīng)叢圖像。

1.2.2 圖像處理與分析兩名操作者各自負(fù)責(zé)自己所拍攝圖像的處理與分析。每一受檢眼采集300～400張清晰的圖像，用Adobe Photoshop圖像處理軟件分別將渦狀區(qū)和中央?yún)^(qū)的單張圖像進(jìn)行拼接，合成廣域的神經(jīng)形態(tài)圖；再在每個(gè)部位的形態(tài)圖上裁剪700 μm×700 μm大小的圖片用于分析。其中渦狀區(qū)要求以其地理中心為中心進(jìn)行裁剪；中央?yún)^(qū)要求以圖像中心為中心進(jìn)行裁剪。然后在Image J圖像分析軟件中打開裁剪圖，使用Neuron J插件進(jìn)行定量分析，得出神經(jīng)纖維總長(zhǎng)。再將所得數(shù)據(jù)根據(jù)圖像大小與像素的轉(zhuǎn)換單位換算出單位面積的神經(jīng)纖維長(zhǎng)度(nerve fiber length，NFL)(mm·mm-2)。最后根據(jù)NFL值分別計(jì)算渦狀區(qū)和中央?yún)^(qū)的觀察者內(nèi)和觀察者間一致性，用于比較LSCM對(duì)二者檢測(cè)的一致性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Medcalc統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。NFL以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。所有數(shù)據(jù)經(jīng)Kolmogrov-Smirnov正態(tài)性檢驗(yàn)。使用Bland-Altman分析和重復(fù)性系數(shù)(coefficient of repeatability，CoR)評(píng)估重復(fù)測(cè)量的一致性。Bland-Altman分析是一種圖示和數(shù)值相結(jié)合的一致性評(píng)價(jià)方法，首先通過(guò)計(jì)算兩次檢查結(jié)果的差值和均值，繪制差值對(duì)應(yīng)于均值的散點(diǎn)圖，再通過(guò)差值的均數(shù)±1.96標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)確定95%一致性區(qū)間(limit of agreement，LOA)。組間差值越接近于0，95%LOA越窄，說(shuō)明一致性越好；CoR則定義為兩次檢查差值的標(biāo)準(zhǔn)差除以兩次檢查均值的均數(shù)，用百分?jǐn)?shù)的形式表達(dá)。CoR低于10%被認(rèn)為具有很高的重復(fù)性，CoR低于5%則被認(rèn)為具有極高的重復(fù)性[3]。檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

所有受檢眼均可于角膜中央偏鼻下方查見渦狀結(jié)構(gòu)，該區(qū)域水平方向延伸(984.00±162.91)μm，垂直方向延伸(683.52±122.98)μm。渦狀結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為順時(shí)針和逆時(shí)針2種形態(tài)，其中29眼為順時(shí)針?lè)较颍?眼為逆時(shí)針?lè)较颉Ｖ貜?fù)檢查獲得的渦狀區(qū)圖像顯示角膜神經(jīng)形態(tài)穩(wěn)定，中央?yún)^(qū)圖像顯示角膜神經(jīng)形態(tài)變異較大。見圖1。

圖1 渦狀區(qū)與中央?yún)^(qū)LSCM圖像 A:操作者A第1次檢查渦狀區(qū)圖像；B:操作者B第1次檢查渦狀區(qū)圖像；C:操作者A第2次檢查渦狀區(qū)圖像；D:操作者A第1次檢查中央?yún)^(qū)圖像；E:操作者B第1次檢查中央?yún)^(qū)圖像；F:操作者A第2次檢查中央?yún)^(qū)圖像。觀察范圍均為700 μm×700 μm

操作者A第1次檢查渦狀區(qū)NFL為(26.44±4.86)mm·mm-2，第2次檢查為(25.97±4.80)mm·mm-2，操作者B第1次檢查為(26.70±4.89)mm·mm-2；操作者A第1次檢查中央?yún)^(qū)NFL為(13.95±4.86)mm·mm-2，第2次檢查為(14.37±5.05)mm·mm-2，操作者B第1次檢查為(12.21±4.43)mm·mm-2。兩個(gè)部位重復(fù)測(cè)量一致性參數(shù)見表1。渦狀區(qū)一致性分析觀察者內(nèi)CoR值為6.6%，觀察者間CoR值為6.1%，一致性很高；而中央?yún)^(qū)一致性分析觀察者內(nèi)CoR值為44.1%，觀察者間CoR值為31.8%，一致性較差。

兩個(gè)部位重復(fù)測(cè)量Bland-Altman分析結(jié)果詳見圖2。渦狀區(qū)觀察者內(nèi)和觀察者間測(cè)量差值均聚集于“0”刻度線附近，且95%LOA較窄，均在平均NFL的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的區(qū)間內(nèi)，一致性良好；中央?yún)^(qū)觀察者內(nèi)和觀察者間測(cè)量差值分布較分散，95%LOA較寬，為兩次檢查平均NFL標(biāo)準(zhǔn)差的2～3倍，一致性較差。

表1 渦狀區(qū)與中央?yún)^(qū)NFL重復(fù)測(cè)量一致性參數(shù)

一致性參數(shù)渦狀區(qū)AV1-AV2AV1-BV1中央?yún)^(qū)AV1-AV2AV1-BV1兩次檢查NFL差值的均數(shù)/mm·mm-20.47-0.26-0.421.74兩次檢查NFL差值的標(biāo)準(zhǔn)差/mm·mm-21.731.626.244.16兩次檢查NFL均值的均數(shù)/mm·mm-226.2126.5714.1613.08兩次檢查NFL均值的標(biāo)準(zhǔn)差/mm·mm-24.814.754.163.85Bland-Altman 95%LOA/mm·mm-2-2.92～3.86-3.43～2.91-12.66～11.82-6.41～9.88CoR6.6%6.1%44.1%31.8%

注：AV1：操作者A第1次檢查；BV1：操作者B第1次檢查；AV2：操作者A第2次檢查

圖2 重復(fù)測(cè)量Bland-Altman散點(diǎn)圖 A:同一操作者不同時(shí)間渦狀區(qū)NFL值Bland-Altman散點(diǎn)圖；B:同一操作者不同時(shí)間中央?yún)^(qū)NFL值Bland-Altman散點(diǎn)圖；C:不同操作者同一時(shí)間渦狀區(qū)NFL值Bland-Altman散點(diǎn)圖；D:不同操作者同一時(shí)間中央?yún)^(qū)NFL值Bland-Altman散點(diǎn)圖。藍(lán)色實(shí)線表示兩次測(cè)量差值的均數(shù)，橙色虛線表示“0”刻度線，暗紅色虛線表示95%LOA的上限和下限。AV1：操作者A第1次檢查結(jié)果；BV1：操作者B第1次檢查結(jié)果；AV2：操作者A第2次檢查結(jié)果

3 討論

角膜上皮基底神經(jīng)叢走行于角膜上皮基底細(xì)胞與前彈力層之間，是角膜神經(jīng)分布最為致密的部位[4]。由于其厚度均一，走行平直，比較容易成像；因此，也是研究最多的角膜神經(jīng)結(jié)構(gòu)[5]。LSCM作為一種無(wú)創(chuàng)性的檢查目前已被廣泛應(yīng)用于觀察角膜上皮基底神經(jīng)叢。研究發(fā)現(xiàn)多種疾病可以引起角膜上皮基底神經(jīng)叢改變，如干眼、圓錐角膜、青光眼、糖尿病等[6]。隨著研究的不斷深入，越來(lái)越多的學(xué)者應(yīng)用LSCM對(duì)角膜上皮基底神經(jīng)叢進(jìn)行定量分析，主要的觀察指標(biāo)包括神經(jīng)纖維密度、神經(jīng)分支密度、NFL和神經(jīng)纖維彎曲度。其中，NFL的變異性最小，可靠性最好[7-8]。因此，本研究選擇NFL作為測(cè)量指標(biāo)。以往的研究通常選擇角膜中央?yún)^(qū)對(duì)角膜上皮基底神經(jīng)叢進(jìn)行分析，但是，由于不同位置角膜上皮基底神經(jīng)叢的形態(tài)及密度不同[9]，且LSCM觀察視野小、缺乏定位功能，不能保證對(duì)同一位置進(jìn)行重復(fù)測(cè)量，使得不同患者或同一患者不同時(shí)間采集的圖像變異較大，無(wú)法進(jìn)行比較[10]。因此，亟需挑選合理的檢查部位或查找目標(biāo)，提高設(shè)備參數(shù)的可靠性與可重復(fù)性。

Patel等[2]在2005年首次發(fā)現(xiàn)角膜上皮基底神經(jīng)叢呈放射狀向中央聚集，最終在角膜頂點(diǎn)鼻下方 1～2 mm處聚集形成一個(gè)旋渦狀集合，稱為渦狀結(jié)構(gòu)。此后，又有多項(xiàng)研究先后驗(yàn)證了渦狀結(jié)構(gòu)的存在[11-14]。我們的研究也證實(shí)，渦狀結(jié)構(gòu)在健康人角膜上皮基底神經(jīng)叢中普遍存在。其旋渦形態(tài)表現(xiàn)為順時(shí)針和逆時(shí)針兩種方向，且以順時(shí)針?lè)较蚨嘁?96.7%)。本研究受試者渦狀區(qū)水平方向延伸(984.00±162.91)μm，垂直方向延伸(683.52±122.98)μm，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果基本一致[2，14]。

由于渦狀結(jié)構(gòu)形態(tài)特殊，位置固定，可能成為角膜上皮基底神經(jīng)叢定量評(píng)估的理想?yún)^(qū)域。Utsunomiya等[15]針對(duì)糖尿病患者的研究也顯示，渦狀區(qū)NFL值較中央?yún)^(qū)變異小，能更精確地反映糖尿病角膜神經(jīng)損傷的程度。但是，也有研究認(rèn)為，渦狀區(qū)與中央?yún)^(qū)的NFL在評(píng)估糖尿病周圍神經(jīng)病變嚴(yán)重程度方面具有相同的效力[16]。為了評(píng)估LSCM對(duì)渦狀結(jié)構(gòu)檢測(cè)的一致性,明確渦狀區(qū)在角膜上皮基底神經(jīng)叢定量評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值，本研究對(duì)比了渦狀區(qū)和中央?yún)^(qū)NFL在LSCM重復(fù)檢查中的一致性。由于LSCM單張圖像的觀察視野只有400 μm×400 μm，不能代表整體的情況[17-18],本研究同時(shí)引入圖像合成技術(shù)，將單張圖片拼接形成廣域的神經(jīng)形態(tài)圖，再根據(jù)渦狀區(qū)的延伸范圍，選擇以渦狀結(jié)構(gòu)為中心的700 μm×700 μm大小的圖像進(jìn)行分析，從而最大限度地減少了測(cè)量誤差。

我們首先對(duì)在同一操作者不同時(shí)間(間隔1周)采集的渦狀區(qū)和中央?yún)^(qū)角膜上皮基底神經(jīng)叢圖像進(jìn)行分析，比較觀察者內(nèi)的一致性。結(jié)果顯示，渦狀區(qū)CoR值為6.6%，Bland-Altman散點(diǎn)圖兩次檢查差值分布集中于“0”刻度線附近，且95%LOA較窄(在平均NFL的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的區(qū)間內(nèi))，表明其一致性良好；而中央?yún)^(qū)CoR值為44.1%，Bland-Altman散點(diǎn)圖兩次檢查差值分布較分散，95%LOA較寬(約為平均NFL標(biāo)準(zhǔn)差的3倍)，表明其重復(fù)測(cè)量波動(dòng)較大，一致性較差。同樣,在不同操作者同一時(shí)間采集的圖像分析中(觀察者間一致性)也顯示，渦狀區(qū)一致性指標(biāo)良好(CoR值為6.1%，Bland-Altman 95%LOA較窄，在平均NFL的1個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差的區(qū)間內(nèi))；而中央?yún)^(qū)一致性指標(biāo)較差(CoR值為31.8%，Bland-Altman 95%LOA較寬，約為平均NFL標(biāo)準(zhǔn)差的2倍)。由此可見，渦狀區(qū)重復(fù)測(cè)量指標(biāo)一致性好，具有良好的再現(xiàn)性；而中央?yún)^(qū)指標(biāo)重復(fù)性差，測(cè)量參數(shù)容易出現(xiàn)較大的變異，結(jié)果可靠性差，無(wú)法用于角膜上皮基底神經(jīng)叢重復(fù)測(cè)量的定量分析。

綜上所述，本研究利用LSCM對(duì)健康志愿者角膜上皮基底神經(jīng)叢進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)渦狀結(jié)構(gòu)普遍存在，且位置固定，形態(tài)易于辨認(rèn)，因此能夠作為重復(fù)檢查的定位標(biāo)志，從而大大提高LSCM的定位功能。同時(shí)，通過(guò)系統(tǒng)比較渦狀區(qū)和中央?yún)^(qū)重復(fù)測(cè)量的一致性，證明渦狀區(qū)圖像再現(xiàn)性良好，可以推廣應(yīng)用于角膜上皮基底神經(jīng)叢的定量分析，尤其適用于疾病療效評(píng)價(jià)和隨訪等縱向研究，可顯著提高LSCM的臨床指導(dǎo)價(jià)值。