糖尿病模型兔眼結(jié)膜損傷的病理機(jī)制研究

葛 健, 朱彩紅, 吳彥霖, 吳永杰

(1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院眼科, 上海200025;2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院, 上海市高血壓研究所,上海市高血壓重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海200025)

糖尿病患者角膜知覺(jué)減退，可能是糖尿病患者的感覺(jué)神經(jīng)病變引起的; 糖尿病患者角膜的愈合能力下降，角膜上皮易出現(xiàn)點(diǎn)狀上皮的缺損; 同時(shí)基礎(chǔ)淚液的分泌量減少，更易出現(xiàn)結(jié)膜和角膜表面的干燥; 從而使眼表微環(huán)境發(fā)生變化，損害眼表組織[1-2]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用人工誘導(dǎo)的糖尿病兔模型來(lái)檢測(cè)其結(jié)膜的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)的表達(dá)，結(jié)合結(jié)膜的病理檢查探討糖尿病兔眼表微環(huán)境改變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

普通級(jí)雄性日本大耳白兔20只, 8周齡, 體質(zhì)量2.66 ～3.44 kg, 由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供[SCXK滬2017-0005] 。20只兔隨機(jī)分成2組,每組10只。對(duì)照組全程給予兔專用配合普通飼料喂養(yǎng); 實(shí)驗(yàn)組給予高脂高糖飼料(普通基礎(chǔ)飼料53%，豬油10%，蔗糖37%)喂養(yǎng)8 周后，以2%鏈脲佐菌素制備糖尿病模型。兔飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部[SYXK滬2018-0027]。

1.2 主要試劑和儀器

MMPs 和TIMPs 的ELISA試劑盒購(gòu)自上海明睿生物有限公司。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)添加劑(FGS)購(gòu)自北京裕恒豐生物科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基和胰蛋白酶溶液均購(gòu)自上海博谷生物科技有限公司。多克隆抗兔一抗試劑盒購(gòu)自北京博奧申生物工程有限公司。多克隆抗兔二抗二步法檢測(cè)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)有限公司。ELX808 酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Tec 公司；Moti-cam3000 顯微攝影成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Motic 公司；倒置顯微鏡購(gòu)自日本Olympus 公司。

1.3 糖尿病模型的制備[3]

高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周的實(shí)驗(yàn)組兔10只，進(jìn)行口服糖耐量試驗(yàn)及胰島素釋放試驗(yàn)，對(duì)出現(xiàn)胰島素抵抗的兔禁食12 h。以3%戊巴比妥鈉按30 mL/kg 體質(zhì)量麻醉后，經(jīng)耳緣靜脈注射現(xiàn)配2%鏈脲佐菌素溶液(65 mL/kg 體質(zhì)量)，72 h 后再次注射同等劑量鏈脲佐菌素溶液。每2 周測(cè)1 次空腹血糖，連續(xù)2 次血糖高于11.0 mmol/L 視為造模成功。本研究中糖尿病實(shí)驗(yàn)組最終造模成功9 只。造模成功后的糖尿病實(shí)驗(yàn)組兔與正常對(duì)照組一樣喂以專用配合普通飼料。

1.4 組織取材及處理

實(shí)驗(yàn)組造模成功后2周，2組兔以3%戊巴比妥鈉(30 mL/kg 體質(zhì)量)麻醉后，逐一將每只兔的雙眼經(jīng)消毒鋪巾后，每一眼球取結(jié)膜2 mm×3 mm 組織，縫合結(jié)膜傷口。同時(shí)將左眼球結(jié)膜剪成2 片1 mm×3 mm 大小，置于4 ℃冰箱保存；右眼球結(jié)膜組織置于體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液中備用。結(jié)膜組織解剖上可分為球結(jié)膜和瞼結(jié)膜，球結(jié)膜便于手術(shù)取材，本實(shí)驗(yàn)所取結(jié)膜均為兔球結(jié)膜組織。

1.5 球結(jié)膜組織的病理檢查

將2組兔右球結(jié)膜組織19份在體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切片，HE 染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄。

1.6 免疫組織化學(xué)法測(cè)定球結(jié)膜的MMP-1、MMP-3 和MMP-9

將2 組19 份兔左球結(jié)膜組織經(jīng)切片常規(guī)脫蠟，在3%H2O2中孵育10 min，用PBS 沖洗2 min共3 次; 將切片放入枸櫞酸鹽緩沖液(pH=6)，微波爐中加熱5 min 共2 次，間隔10 min，冷卻至室溫；滴加一抗，4 ℃冰箱放置10 h，PBS沖洗2 min共3 次,再滴加二抗，37 ℃孵育30 min，沖洗2 min 共3 次；DBA 顯色5～10 min，蒸餾水充分沖洗，再用蘇木精復(fù)染1 min，常規(guī)脫水至透明，中性膠封片。最后用Motic3000 顯微攝影系統(tǒng)在400 倍下攝片，采用Image-pro plus6.0病理圖像分析系統(tǒng)對(duì)陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行定量分析，以積分吸光度代表蛋白相對(duì)的表達(dá)量，記錄列表。,

1.7 ELISA法檢測(cè)球結(jié)膜組織細(xì)胞培養(yǎng)上清液中TIMP-1 和TIMP-3[4-5]

將2組19份左眼球結(jié)膜組織經(jīng)清洗干凈，修剪組織小于1 mm2后，放入6 孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中待干，以后將板翻轉(zhuǎn)后浸入4 mL 含青霉素-鏈霉素，10%胎牛血清和0.1%FGS的DMEM培養(yǎng)液中。每2 日換培養(yǎng)液1 次；同時(shí)用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，用免疫熒光法對(duì)成纖維細(xì)胞的特異性蛋白進(jìn)行檢測(cè)，以此鑒別成纖維細(xì)胞。然后選取4～6 代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，把生長(zhǎng)至90%的細(xì)胞消化后，用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液；再以3×105個(gè)/mL 細(xì)胞密度接種在24 孔板上，每孔注液1 mL。培養(yǎng)24 h 后，更換無(wú)血清的DMEM 培養(yǎng)液，每孔1 mL，置于含5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h 后收集各孔的培養(yǎng)液，經(jīng)高速離心機(jī)以800 r/min 離心25 min；取上清液放入無(wú)菌EP管中，分裝置-20 ℃冷凍保存。最后用試劑ELISA 盒，在酶標(biāo)儀的450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度(A)值; 利用標(biāo)準(zhǔn)品的A 值和其相對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度，以A 值為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，把樣本的A 值代入計(jì)算得相應(yīng)的樣本質(zhì)量濃度(ng/mL)，記錄列表。

1.8 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 23.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理，計(jì)量資料以表示；組間比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察

糖尿病實(shí)驗(yàn)組中可見(jiàn)眼結(jié)膜上皮排列整齊，上皮下組織明顯減少，結(jié)膜組織疏松，可見(jiàn)萎縮的筋膜組織，結(jié)膜固有層細(xì)胞松散，且細(xì)胞間炎性細(xì)胞增多，甚至出現(xiàn)多量的炎性細(xì)胞局灶狀聚集，少見(jiàn)有彈力纖維 (圖A)。正常對(duì)照組可見(jiàn)結(jié)膜上皮層排列整齊，上皮層下組織致密且組織層次清晰，結(jié)膜組織細(xì)胞間炎性細(xì)胞少見(jiàn)(圖B)。

圖1 兔球結(jié)膜組織學(xué)觀察

2.2 MMPs表達(dá)

對(duì)照組10 只兔球結(jié)膜的MMP-1、MMP-3 和MMP-9 表達(dá)值分別為(465.32± 76.78) ng/mL、(687.15±82.34) ng/mL 和(697.45±89.56) ng/mL;實(shí)驗(yàn)組9 只兔球結(jié)膜MMP-1、MMP-3 和MMP-9 表達(dá)值分別為(1 565.48± 98.78) ng/mL、(1 789.45±90.26) ng/mL 和(1 679.35± 103.12) ng/mL，實(shí)驗(yàn)組兔球結(jié)膜的MMPs 表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.3 TIMPs 表達(dá)

對(duì)照組10只兔球結(jié)膜TIMP-1 和TIMP-3含量分別為(0.53±0.01) ng/mL 和(0.23 ± 0.01) ng/mL;實(shí)驗(yàn)組9 只兔球結(jié)膜細(xì)胞TIMP-1 和TIMP-3 含量分別為(0.65±0.01) ng/mL 和(0.13 ± 0.01) ng/mL。

TIMP-1 的表達(dá)略高于對(duì)照組，但組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TIMP-3 的表達(dá)實(shí)驗(yàn)組明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討論

糖尿病以高血糖為最主要臨床表現(xiàn)，高血糖可以使組織細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子發(fā)生改變，從而改變細(xì)胞代謝, 使細(xì)胞的原有功能發(fā)生改變[6-8]。高血糖可以使眼表的角膜知覺(jué)度降低，眼表的淚湖高度減低。本實(shí)驗(yàn)主要觀察了高血糖和球結(jié)膜MMPs 和TIMPs 表達(dá)間的關(guān)系，進(jìn)一步從球結(jié)膜病理上說(shuō)明了球結(jié)膜MMPs 和 TIMPs的表達(dá)和糖尿病實(shí)驗(yàn)組兔結(jié)膜的損害之間的聯(lián)系。

MMP-1 主要水解纖維類的膠原，MMP-3 能溶解蛋白多糖、纖連蛋白、彈性蛋白等多種膠原蛋白。高血糖也能促進(jìn)結(jié)膜MMP-3 和MMP-9 的高表達(dá)[9-10]。MMP-9 有明膠酶活性，可水解變性的膠原和Ⅳ、Ⅴ型膠原蛋白[11]。

糖尿病實(shí)驗(yàn)組的兔球結(jié)膜MMP-1、MMP-3和MMP-9 都高于對(duì)照組，說(shuō)明這些膠原酶釋放出成纖維細(xì)胞較多，使原細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存減少。球結(jié)膜TIMP-1 和TIMP-2 具有抑制MMP-1、MMP-3和 MMP-9 的活性作用，正常結(jié)膜組織的彈性和組織形態(tài)的維護(hù)需要MMP-1/TIMP-1 平衡處于正常狀態(tài)。但糖尿病實(shí)驗(yàn)組球結(jié)膜TIMP-1的表達(dá)與正常對(duì)照組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明MMP-1/TIMP-1 的平衡被破壞。另外，糖尿病實(shí)驗(yàn)組兔球結(jié)膜TIMP-3 的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，說(shuō)明釋放到成纖維細(xì)胞外的膠原酶減少了，MMP-3/TIMP-3 的平衡也被破壞[12]。這些MMPs/TIMPs 失衡過(guò)程使球結(jié)膜下組織，眼筋膜組織產(chǎn)生過(guò)度的降解，造成結(jié)膜組織的損害，從而臨床上出現(xiàn)結(jié)膜松弛[13]; 結(jié)膜松弛可造成淚液膜的不穩(wěn)定，也造成了淚湖的實(shí)際容積量減少，從而使角膜結(jié)膜組織表面出現(xiàn)干糙，結(jié)膜上皮出現(xiàn)易損現(xiàn)象。結(jié)膜角膜組織的干燥、淚液膜的不穩(wěn)定和結(jié)膜松弛都會(huì)進(jìn)一步促進(jìn)結(jié)膜和角膜的炎癥發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組兔結(jié)膜在光鏡下可以觀察到結(jié)膜上皮下組織明顯減少、結(jié)膜組織疏松、筋膜組織萎縮、結(jié)膜固有層細(xì)胞松散，且細(xì)胞間炎性細(xì)胞增多。

本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)組兔結(jié)膜實(shí)驗(yàn)取材時(shí)并沒(méi)有出現(xiàn)結(jié)膜炎癥的表現(xiàn)，但是病理上證實(shí)有不同程度的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，這與Ward 等[14]的發(fā)現(xiàn)有異，然而作者認(rèn)為早期的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度可能和MMP-9 的表達(dá)程度有關(guān)，也可認(rèn)為是早期的炎性細(xì)胞變化促進(jìn)了MMPs 的表達(dá)，從而更促進(jìn)了后期球結(jié)膜下組織和眼筋膜組織的降解過(guò)程。高血糖促進(jìn)了兔結(jié)膜MMPs 的表達(dá)，促進(jìn)實(shí)驗(yàn)兔的結(jié)膜和眼筋膜出現(xiàn)彈力纖維的減少，結(jié)膜上皮下組織疏松，結(jié)膜松弛；從而改變了糖尿病兔的眼表微環(huán)境，出現(xiàn)結(jié)膜角膜的干糙和角膜結(jié)膜組織的損害。