直接膽紅素和間接膽紅素對化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝病毒表面抗原的影響及解決方案

周 娟，趙志強(qiáng)

（1.蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院檢驗科，江蘇 蘇州 215003；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院檢驗科，江蘇 蘇州215001）

膽紅素是由含血紅素的蛋白質(zhì)在肝細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)代謝轉(zhuǎn)變而來，并隨膽汁分泌排泄，膽紅素分為直接膽紅素和間接膽紅素等，不同類型的膽紅素，其物理和化學(xué)特性不盡相同?；瘜W(xué)發(fā)光是指伴隨化學(xué)反應(yīng)過程產(chǎn)生光的發(fā)射現(xiàn)象，化學(xué)發(fā)光自動免疫分析具有自動化程度高、敏感性高和特異性強(qiáng)的特點，目前，已成為免疫檢測中應(yīng)用最為廣泛的分析技術(shù)[1-2]。盡管如此，我們在日常工作中發(fā)現(xiàn)有時黃疸標(biāo)本在用化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原時，雖然出現(xiàn)弱陽性結(jié)果，但用HBV-DNA定性驗證時，很多時候結(jié)果卻呈陰性。這使得檢驗人員在對臨床醫(yī)生及病人解釋時出現(xiàn)被動，甚至出現(xiàn)醫(yī)患糾紛，為了搞清楚究竟是直接膽紅素還是間接膽紅素影響化學(xué)發(fā)光法的乙肝表面抗原檢測，以及可能的解決方案，我們特定做了以下研究。

1 資料和方法

1.1 對象 選取2019年1月1日—2019年12月31日在蘇州市立醫(yī)院住院并且直接膽紅素水平超過200 μmol/L同時間接膽紅素水平低于50 μmol/L的患者100 例作為成人組，男60 例，女40 例，中位年齡60（55，70）歲。選取2019年1月1日—2019年12月31日在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院住院并且間接膽紅素水平超過200 μmol/L同時直接膽紅素低于50 μmol/L的患者300 例作為新生兒組，男166 例，女134 例，中位年齡6（4，12）d。

本研究經(jīng)蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院及蘇州市立醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準(zhǔn)，受試者及其家屬均簽署了知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 檢測流程：晨起空腹采集肘靜脈血3 mL，待凝固后3000 r/min離心5 min后，檢測總膽紅素和直接膽紅素，并計算間接膽紅素，用化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原，對陽性標(biāo)本檢測HBV-DNA，高速離心后第二次用化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原，對陽性標(biāo)本用藍(lán)光照射8 h后，第3次用化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原，對檢測陽性標(biāo)本均記錄患者的疫苗接種史及乙肝病毒感染情況。

1.2.2 檢測方法及試劑：總膽紅素和直接膽紅素用Hitachi7600及配套的FUJIFILM試劑進(jìn)行檢測，檢測原理為釩酸氧化法，間接膽紅素濃度用總膽紅素和直接膽紅素相減計算得出，成人直接膽紅素正常參考值為＜8.0 μmol/L，成人間接膽紅素正常參考值為1.6～21.0 μmol/L，我國兒童尚未建立直接膽紅素和間接膽紅素的參考范圍。乙肝表面抗原采用AutoLumo A2000儀器及配套的安圖生物試劑檢測，檢測方法為微粒子化學(xué)發(fā)光法，正常參考值為＜0.05 IU/mL。HBV-DNA檢測采用達(dá)安基因公司核算擴(kuò)增試劑盒，正常參考值為DNA＜100 IU/mL。高速離心為12 000 r/min離心10 min。藍(lán)光照射為采用450 nm波長光照射8 h。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。經(jīng)正態(tài)性檢驗，新生兒組與成人組年齡、直接膽紅素和間接膽紅素數(shù)值均為偏態(tài)分布，以中位數(shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 直接膽紅素和間接膽紅素檢測結(jié)果 新生兒組間接膽紅素檢測結(jié)果：200～260 μmol/L 25 例，260～320 μmol/L 36 例，320～380 μmol/L 23 例，380～440 μmol/L 9 例，＞440 μmol/L 7 例。成人組直接膽紅素檢測結(jié)果：200～260 μmol/L 156例，260～320 μmol/L 86 例，320～380 μmol/L 40例，380～440 μmol/L 12 例，＞440 μmol/L 6 例。

新生兒組診斷結(jié)果：新生兒高膽紅素血癥235例，新生兒肺炎36 例，其它疾病29 例（包括新生兒溶血、新生兒感染、新生兒低血鈣、早產(chǎn)兒等）。成人組診斷結(jié)果：肝癌16 例，梗阻性黃疸60例，其它疾病24 例（包括膽管惡行腫瘤、膽囊結(jié)石、上消化道出血等）。

2.2 化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原的結(jié)果及HBVDNA證實結(jié)果 成人組100 例化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原結(jié)果中，有5 例陽性，95 例陰性，同時此5 例陽性結(jié)果經(jīng)HBV-DNA復(fù)檢確證為陽性結(jié)果，不存在假陽性或假陰性。新生兒組300 例化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原結(jié)果中共15 例陽性，285 例陰性，此15 例陽性結(jié)果經(jīng)HBV-DNA復(fù)檢證實全為陰性，所以這15 例為化學(xué)發(fā)光法檢測的假陽性，經(jīng)高速離心后第二次用化學(xué)發(fā)光法檢測4 例轉(zhuǎn)為陰性，經(jīng)藍(lán)光照射8 h后第三次用化學(xué)發(fā)光法檢測又有8 例轉(zhuǎn)為陰性，至此，仍有3 例為陽性（第7、12和15號標(biāo)本），經(jīng)查閱病史及乙肝疫苗接種史，此3 例新生兒患者均已正常接種過乙肝疫苗，其母親均無乙肝病毒感染史。且經(jīng)8 周后的隨訪復(fù)查，均轉(zhuǎn)陰。（表1）

表1 化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原的結(jié)果及HBV-DNA證實結(jié)果

3 討論

我們在工作中發(fā)現(xiàn)有部分血樣標(biāo)本會出現(xiàn)弱陽性結(jié)果，當(dāng)再次用中和實驗或HBV-DNA核酸實驗復(fù)檢后，并未檢測到乙肝病毒的存在，而且在這些標(biāo)本中，大部分標(biāo)本為高膽紅素標(biāo)本，為了搞清膽紅素與化學(xué)發(fā)光法檢測表面抗原的假陽性之間的關(guān)系，我們進(jìn)行的研究得出了以下結(jié)果。

我們認(rèn)為既然化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原時這些標(biāo)本顯示弱陽性，那么在此時的檢測杯中就應(yīng)有發(fā)光的微粒子存在，由于纖維蛋白和破碎細(xì)胞殘片留在杯中，有可能滯留發(fā)光的微粒子，我們在實驗前處理時能否通過高速離心來去除這些因素呢[3-4]。我們進(jìn)行12 000 r/min高速離心共10 min，使纖維蛋白與別的雜質(zhì)被充分離心沉降，當(dāng)?shù)诙位瘜W(xué)發(fā)光檢測時，就有4 例轉(zhuǎn)陰，說明離心確實可以降低部分假陽性。

由于膽紅素分為直接膽紅素和間接膽紅素，那么這兩種膽紅素是否都會干擾化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原呢？我們專門收集了100 份高直接膽紅素標(biāo)本和300 份高間接膽紅素標(biāo)本，實驗結(jié)果顯示高直接膽紅素標(biāo)本中有5 例陽性，而且通過HBV-DNA核酸復(fù)檢確證，無一例假陽性，所以可得出結(jié)論直接膽紅素不會影響化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原，而在300 例高間接膽紅素標(biāo)本中，有15 例弱陽性標(biāo)本，但HBV-DNA復(fù)檢均為陰性，說明這15 例弱陽性標(biāo)本均為假陽性。

為什么高直接膽紅素不會引起假陽性，而高間接膽紅素卻能引起假陽性呢？我們只能從直接膽紅素和間接膽紅素的結(jié)構(gòu)與特性上找原因了。直接膽紅素是經(jīng)過肝臟加工過的膽紅素，結(jié)合了1-2葡萄糖醛酸分子，易溶于水；而間接膽紅素未經(jīng)肝臟加工，也未醛酸化，而是結(jié)合了白蛋白，通過氫鍵的作用，將親水基團(tuán)包裹在內(nèi)部，而表現(xiàn)為易溶于脂類，難溶于水，會不會是由于直接膽紅素和間接膽紅素的這種差別引起了化學(xué)發(fā)光法檢測表面抗原的假陽性呢？我們設(shè)計了藍(lán)光照射實驗，根據(jù)現(xiàn)有的研究與實踐[5-7]，我們知道藍(lán)光照射可以破壞間接膽紅素內(nèi)部的氫鍵，使其被包裹的親水基團(tuán)外露，使其從難溶于水變?yōu)橐兹苡谒?，而且易于從體內(nèi)排泄。從實驗結(jié)果可知，通過藍(lán)光照射，有8 份弱陽性標(biāo)本轉(zhuǎn)為了陰性，說明藍(lán)光照射確實可以降低化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原的假陽性，那么這其中的道理究竟是什么呢？我們推測可能是由于大量的間接膽紅素存在時，在血清中形成了類似顆粒的物質(zhì)，而這些顆粒結(jié)合了一些化學(xué)發(fā)光法中的微粒子，而且這些被結(jié)合的微粒子無法通過高速離心去除，而藍(lán)光實驗通過打斷氫鍵，改變了間接膽紅素的疏水性，正好破壞了這些顆粒，同時加速了間接膽紅素的代謝，從而減少了假陽性的結(jié)果。

在本次實驗進(jìn)行中有3 例標(biāo)本無論是用高速離心還是藍(lán)光照射都無法使結(jié)果轉(zhuǎn)陰，但查詢患者病史發(fā)現(xiàn)這3 例新生兒的母親均無感染乙肝病毒的病史，且這3 例新生兒均有乙肝疫苗接種史，經(jīng)過電話隨訪，2 個月后，這3 例新生兒乙肝病毒表面抗原轉(zhuǎn)陰，根據(jù)已有的研究[8-10]可知，由于這3 例新生兒的母親并無乙肝病毒感染，且這3 例新生兒均已正常接種了乙肝疫苗，這就排除了母嬰垂直傳播的可能，而且由于結(jié)果呈現(xiàn)是弱陽性，并于8 周后復(fù)查轉(zhuǎn)為陰性，所以這應(yīng)該是乙肝疫苗接種后的一過性陽性。

通過本次研究，我們掌握了直接膽紅素和間接膽紅素對化學(xué)發(fā)光法檢測乙肝表面抗原的可能影響及解決的方法，使得在工作中可以避免這些錯誤，減少不必要的投訴，增加臨床科室及患者對檢驗科室的信任，那么高速離心和藍(lán)光照射是否能夠減少間接膽紅素對化學(xué)發(fā)光法檢測別的項目產(chǎn)生的假陽性呢？這就有待進(jìn)一步的研究了。