裸鼠皮下移植瘤及其血清DcR3表達與腫瘤大小相關(guān)性分析

李敬瑜 萬光升 張淑華 彭卓龍（通訊作者）

（1開平市中心醫(yī)院 廣東 開平 529300）

（2上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院 上海 200333）

（3南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院增城分院 廣東 廣州 511300）

（4中國中醫(yī)科學(xué)院 北京 100700）

大腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤。最新數(shù)據(jù)顯示腸癌已經(jīng)成為我國第三大高發(fā)惡性腫瘤[1]。根治性切除術(shù)是目前唯一可能治愈大腸癌的療法，但臨床上有許多患者由于各種原因未能行根治術(shù)。為此，對患者進行系統(tǒng)全面的檢查，以求制定合理的姑息治療策略顯得尤為重要。Liang QL等[2]發(fā)現(xiàn)大腸癌組織DcR3的表達與細胞分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分期等存在相關(guān)性。Zong L等[3]進一步發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中DcR3過表達可作為患者預(yù)后較差的標志物。然而，癌組織DcR3含量與瘤體大小的相關(guān)性，以及血清DcR3含量的意義，目前尚未有相關(guān)報道。鑒于此，本實驗進行癌組織和血清DcR3與腫瘤大小的相關(guān)性研究，以期為日后的進一步臨床研究提供必要的實驗依據(jù)。

1.資料與方法

1.1 材料及動物

人大腸癌多藥耐藥細胞株HCT-8/VCR，購于南京購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，檢測該細胞的多重耐藥性，對至少三種不同的化療藥物產(chǎn)生耐藥性。細胞培養(yǎng)液、血清、胰蛋白酶等試劑購于美國Gibco公司，SPF級BALB/c裸小鼠，平均每只20g左右，雌雄各半，購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司（許可證號為scxk (滬)：2012-0016）。人大腸癌多藥耐藥細胞株HCT-8/VCR所需的培養(yǎng)液為RPMI-1640培養(yǎng)液（含有青霉素100 U/ml、鏈霉素鏈霉素100μg/ml、長春新堿濃度為2g/L、10%胎牛血清的），生長環(huán)境為5% CO2培養(yǎng)箱，37℃培養(yǎng)。中藥復(fù)方健脾解毒方，組成為：生黃芪、生白術(shù)、黨參、豬苓、八月札、薏苡仁、野葡萄藤、紅藤，含生藥濃度為1.46g/ml，由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院監(jiān)制。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng) HCT8/VCR細胞生長在上述濃度的培養(yǎng)液中，穩(wěn)定傳代。取處于對數(shù)生長期的細胞，常規(guī)胰蛋白酶消化制備單細胞懸液。用生理鹽水重懸細胞，計數(shù)調(diào)整細胞濃度為1×107/ml。

1.2.2細胞的接種 接種方法參考《細胞培養(yǎng)》[4]，將上述懸浮的細胞快速接種于4-6周齡BALB/c裸鼠右側(cè)腋下。接種之前常規(guī)酒精消毒，用1ml微量注射器及23號針頭吸取人大腸癌耐藥細胞株HCT8/V單細胞懸液，確定針頭位于裸鼠右側(cè)近前肢皮下后，注入0.2m1制備好的單細胞懸液，細胞數(shù)約為2×106個，共接種10只裸鼠。

1.2.3觀察 將接種后的裸鼠繼續(xù)在SPF級隔離籠內(nèi)生長，每日可見裸鼠接種部位逐漸長大，觀察至30天時，共有7只裸鼠成瘤，裸鼠皮下腫瘤大小約為0.5～2.6cm。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附試驗 將上述生長大小不一的裸鼠測量異位移植瘤大小，脫頸處死，取瘤，稱重，摘眼球取血。取血后室溫靜置2小時，離心（15min，3000r/min）分離血清，每只裸鼠約可取出60～150ul淡黃色血清。ELISA法檢測7只裸鼠DcR3的表達水平，嚴格按照試劑說明書進行。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（±s）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.結(jié)果

2.1 各組裸鼠大小及重量、血清組織DcR3表達見表。

2.2 異位移植瘤的重量與血清及組織的DcR3相關(guān)性分析

表 裸鼠大小質(zhì)量與血清組織DcR3表達

多藥耐藥裸鼠異位移植瘤組織與裸鼠血清的DcR3存在一定的相關(guān)性，移植瘤大小越大，其DcR3的表達越高，僅第三組異位移植瘤重量與組織中DcR3表達存在一定差異，這可能與該裸鼠組織壞死程度高有一定關(guān)系。

3.討論

誘騙受體3（DcR3）是近些年新發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體超家族成員。DcR-3編碼基因定位于人染色體20q13.3，它和另外3個基因共同構(gòu)成基因簇，它與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。據(jù)研究[5]，DcR3可通過介導(dǎo)LIGHT途徑、TLIA途徑、Fas/FasL途徑的免疫細胞毒性作用，阻斷細胞細胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細胞清除減少，誘導(dǎo)免疫耐受。臨床證據(jù)[2]也顯示，DcR3在人體組織中的信使陽性表達率顯著高于癌旁組織，并有望成為新的腫瘤標志物，運用于腫瘤的鑒別診斷。但考慮到組織DcR3獲取途徑僅能通過活檢，臨床上難以重復(fù)多次檢查以動態(tài)觀察，這大大限制了DcR3的臨床運用。為此，本研究從無胸腺的裸鼠入手，排除腫瘤免疫對實驗的影響，并分析了腫瘤大小與癌組織、血清中DcR3之間的關(guān)系，初步分析了腫瘤的大小與DcR3的相關(guān)性，為日后進一步的血清DcR3臨床研究提供必需的實驗依據(jù)。此外，本研究的第三組中組織DcR3存在一定的差異，可能與腫瘤的壞死程度關(guān)系密切，后續(xù)可進一步分析DcR3與腫瘤壞死程度的關(guān)系，并擬從進一步分析DcR3與細胞凋亡的相關(guān)性及凋亡通路，為臨床上進一步診斷治療提供實驗依據(jù)。