黑曲霉菌對天然橡膠的降解作用初探 *

龔英， 陳繼平， 陳漢菊， 張海霞， 孫琪

(云南師范大學 化學化工學院，云南 昆明 650500)

天然橡膠膠乳是一種天然高分子混合物，由聚異戊二烯(25%～35%)、蛋白質(zhì)(1%～1.8%)、碳水化合物(1%～2%)、脂類化合物(0.9%～1.7%)、無機成分(0.4%～0.6%)、氨基酸(0.4%)和水(50%～70%)組成.天然橡膠具有優(yōu)良的回彈性、絕緣性、隔水性及可塑性，應(yīng)用領(lǐng)域廣泛[1].在過去的15年間，全球天然橡膠的產(chǎn)量和需求量雙雙增長，由此帶來的天然橡膠廢棄物的處置和降解問題也引發(fā)學者的廣泛關(guān)注.雖然微生物能分解天然橡膠中的蛋白質(zhì)[2-3]，但是自身難降解的天然橡膠聚異戊二烯分子仍帶來了廢棄物管理方面的挑戰(zhàn)[4].

研究發(fā)現(xiàn)，一些特殊來源的微生物對于天然橡膠具有一定的生物降解作用，例如從廢水處理廠污泥中分離的放線菌能在天然橡膠液體培養(yǎng)基中生長，并降低天然橡膠的分子量[5]；從橡膠種植土壤中分離出的Gordoniapolyisoprenivoransstrains[6]和放線菌[7]對于膠乳具有降解作用；利用產(chǎn)黃青霉分泌的蟲漆酶和錳過氧化物酶能生物降解橡膠[8].尋找來源廣泛且質(zhì)量安全的可降解橡膠的微生物成了研究的熱點.

黑曲霉是一類廣泛分布于自然環(huán)境、價廉且易培養(yǎng)的工業(yè)菌種[9]，能分泌酸性蛋白酶及纖維素酶等多種酶，被用來降解植物中沒食子酸單寧[10]等成分.據(jù)此推測，黑曲霉菌具有降解天然橡膠中蛋白質(zhì)及其他組分的潛力.研究將詳細考察黑曲霉菌對天然橡膠的降解能力，為天然橡膠的生物降解提供一些參考.

1 實驗部分

1.1 實驗材料

黑曲霉菌種(ATCC10582)、改良馬丁培養(yǎng)基和瓊脂購自上海通派生物科技有限公司.一次性天然橡膠手套為桂林紫竹乳膠制品有限公司生產(chǎn).泰國三棵樹天然橡膠膠乳購自東莞成一橡膠有限公司.

1.2 實驗步驟

1.2.1 菌種的復(fù)蘇和復(fù)壯

向黑曲霉干菌種(0代)中加入0.5 mL滅菌的改良馬丁液體培養(yǎng)基，制成菌懸液，然后將菌懸液轉(zhuǎn)入裝有50 mL滅菌的改良馬丁液體培養(yǎng)基的搖瓶中，在28 ℃搖床震蕩培養(yǎng)5 d，得到復(fù)蘇的黑曲霉菌(1代).然后將黑曲霉孢子懸液加入改良馬丁瓊脂平板培養(yǎng)基表面復(fù)壯，在28 ℃恒溫恒濕箱中培養(yǎng)5 d，得到復(fù)壯的黑曲霉菌(2代，圖1).收集黑曲霉菌，用滅菌的蒸餾水制成菌懸液，置于4 ℃保存，用于后續(xù)的天然橡膠降解實驗.采用稀釋平板菌落計數(shù)法(圖2)，測得菌懸液中黑曲霉菌數(shù)量為72 000 CFU/mL.

圖1 改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)壯的黑曲霉菌 圖2 稀釋平板法培養(yǎng)的黑曲霉菌

Fig.1 The rejuvenation ofAspergillusnigerusing modifiedMartinagarmedium Fig.2 The cultivation ofAspergillusnigerbydilutionplatemethod

1.2.2 天然橡膠樣品的準備

天然橡膠樣品有兩種，分別取自天然橡膠手套掌心位置的樣品和利用天然橡膠膠乳在50 ℃干燥后自制的橡膠膜.這兩種橡膠膜樣品的大小均為5 cm×5 cm，厚度均為0.5 mm.

1.2.3 天然橡膠的降解實驗

天然橡膠的降解實驗分為兩部分.

第一部分：根據(jù)正交試驗法，設(shè)計黑曲霉單一菌種溶液對天然橡膠的降解實驗，考察的因素和水平如表1所示.將橡膠樣品用細繩串在一起，然后浸入黑曲霉菌溶液中，在規(guī)定的溫度和pH值條件下降解30 d.每隔10 d更換一次黑曲霉菌溶液.根據(jù)公式(1)計算橡膠膜的質(zhì)量損失率，以此為據(jù)優(yōu)化降解條件.每個實驗條件做三個平行樣，取平均值為實驗結(jié)果.

質(zhì)量損失率(%)=

(1)

表1 正交試驗的因素和水平

第二部分：在優(yōu)化的降解實驗條件下，開展天然橡膠樣品的黑曲霉菌降解實驗，降解時間為60 d.每隔10 d更換一次黑曲霉菌溶液，并取出三塊樣品，觀察橡膠樣品的表面，測定橡膠樣品的質(zhì)量損失率，取平均值為實驗結(jié)果.

1.3 天然橡膠交聯(lián)密度的測定

采用甲苯溶脹法測定天然橡膠的交聯(lián)度.取一定體積的降解前或降解后膜樣品，浸入30 ℃甲苯中72 h直至膜樣品完全膨脹.然后除去甲苯，測量膜樣品的體積，根據(jù)Flory-Rehner方程[11-12]，計算橡膠樣品的交聯(lián)密度.

其中，ve為天然橡膠的交聯(lián)密度；vr為膜樣品完全膨脹后體積分數(shù)；Vs為甲苯溶劑的摩爾體積，105.91cm3/mol；x為天然橡膠和甲苯溶劑的相互作用參數(shù)，0.43.

2 結(jié)果與討論

2.1 黑曲霉菌降解實驗條件的優(yōu)化

采用極差法分析正交試驗的結(jié)果.天然橡膠膜和天然橡膠手套的降解實驗結(jié)果分別如表2和表3所示.兩類橡膠樣品的最大質(zhì)量損失率分別為4.5%和2.3%，并且降解實驗的影響因素主次關(guān)系均是溫度影響最大，其次是pH值，接著是黑曲霉菌濃度和通氣量.對于兩類橡膠樣品，正交試驗所獲得的優(yōu)化實驗條件均為A2B3C3D2，即降解溫度為32 ℃，pH值為6，黑曲霉菌濃度為1 500 CFU/mL，通氣量為15 L/min.

表2 天然橡膠膜降解正交試驗的結(jié)果

表3 天然橡膠手套降解正交試驗的結(jié)果

2.2 優(yōu)化條件下天然橡膠的降解

在優(yōu)化條件下開展天然橡膠膜和天然橡膠手套的降解實驗，結(jié)果如表4所示.經(jīng)過30 d的降解，天然橡膠膜和天然橡膠手套的質(zhì)量損失率分別為4.9%和2.7%，略高于正交試驗中測得的最高質(zhì)量損失率.經(jīng)過60 d的降解，天然橡膠膜和天然橡膠手套的質(zhì)量損失率分別達到6.2%和3.4%.根據(jù)天然膠乳的組成特點分析可知，不僅天然橡膠中蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂類化合物、氨基酸等這些易于降解的組分發(fā)生了降解，聚異戊二烯橡膠烴也開始發(fā)生降解.降解后橡膠膜表面照片如圖3和圖4所示.降解后橡膠膜的表面出現(xiàn)了小孔，并且隨著降解時間的延長，孔洞數(shù)量和尺寸不斷增加，說明天然橡膠中聚異戊二烯橡膠烴發(fā)生了持續(xù)降解.

表4 優(yōu)化條件下降解實驗結(jié)果

20 d 40 d 60 d

圖3 天然橡膠膜的降解圖片

Fig.3 The degraded natural rubber films

20 d 40 d 60 d

圖4 天然橡膠手套的降解圖片

Fig.4 The degraded natural rubber gloves

2.3 討 論

交聯(lián)密度反映了橡膠交聯(lián)鍵的多少.在優(yōu)化條件下，經(jīng)過60 d降解后，天然橡膠膜和天然橡膠手套的交聯(lián)密度如表5所示.降解后，天然橡膠膜和天然橡膠手套的交聯(lián)密度分別降低了29.4%和9.3%，說明黑曲霉菌破壞了天然橡膠中部分交聯(lián)鍵，有助于天然橡膠的進一步降解.

表5 交聯(lián)密度測定結(jié)果

從質(zhì)量損失率、膜表面孔洞及交聯(lián)密度這些變化可知，黑曲霉菌對自制的天然橡膠膜的降解作用明顯強于天然橡膠手套.自制的天然橡膠膜僅含有天然橡膠膠乳組分，且通過低溫干燥制備，橡膠烴分子的交聯(lián)程度較低.天然橡膠手套中含有硫化劑等組分[13]，交聯(lián)程度更高.據(jù)此推測，黑曲霉菌對交聯(lián)程度較低的天然橡膠膜的降解能力更強.建議在制備天然橡膠制品時，經(jīng)過適當程度的交聯(lián)處理能滿足天然橡膠的應(yīng)用要求即可.這樣，不過度交聯(lián)的天然橡膠分子將更有利于后續(xù)橡膠廢棄物的生物降解處理.

3 結(jié) 語

黑曲霉菌對天然橡膠中多種組分均具有良好的降解作用，能破壞天然橡膠中的交聯(lián)鍵，并在膜表面形成孔洞，以促進天然橡膠的生物降解.采用正交試驗法，優(yōu)化的天然橡膠降解條件如下：降解溫度為32 ℃，pH值為6，黑曲霉菌濃度為1 500 CFU/mL，通氣量為15 L/min.