基于麻味成分的頂壇花椒HPLC指紋圖譜研究

敖厚豫，李欣，余天華*，楊慶雄

(1.貴州師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550001；2.貴州師范大學(xué) 喀斯特研究院 國(guó)家喀斯特石漠化防治 工程技術(shù)研究中心，貴陽(yáng) 550001；3.貴州師范大學(xué) 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴陽(yáng) 550001)

貴州頂壇花椒(Zanthoxylumplanispinumvar.dingtanensis)系蕓香科花椒屬植物竹葉花椒的一個(gè)變種[1]，由于適宜生長(zhǎng)在喀斯特干熱河谷地區(qū)，被選為貴州石漠化治理地區(qū)生態(tài)治理的重要經(jīng)濟(jì)植物，特別是在以黔西南地區(qū)貞豐縣為中心的石漠化地區(qū)，種植面積超過(guò)5萬(wàn)畝，產(chǎn)量穩(wěn)定，已經(jīng)成為當(dāng)?shù)刂匾耐撂剞r(nóng)產(chǎn)品，并通過(guò)了國(guó)家質(zhì)檢總局地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的論證(DB52/T 542-2016)。頂壇花椒是一個(gè)區(qū)域性特有品種，它區(qū)別于花椒(Z.bungeanum)、青花椒(Z.schinifolium)、竹葉花椒(Z.armatum)等花椒市場(chǎng)上常見(jiàn)和分布地域廣的幾個(gè)主要品種，并由于具有“麻味重”、“香味濃”的特點(diǎn)，形成了較為獨(dú)特的特色產(chǎn)品，是在貴州省石漠化地區(qū)多年推廣后逐漸培育成的一個(gè)具備較大產(chǎn)量規(guī)模并形成地區(qū)特色產(chǎn)業(yè)的重要特色農(nóng)產(chǎn)品。貴州省的石漠化地區(qū)目前正在進(jìn)一步大規(guī)模推廣，已經(jīng)成為“黔貨出山”的重要品種。

目前，按照林業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(LY/T 1652-2005)、國(guó)標(biāo)GB/T 30391-2019等，對(duì)花椒質(zhì)量等級(jí)的分級(jí)，主要包括感官評(píng)價(jià)和理化指標(biāo)評(píng)價(jià)，其中感官指標(biāo)包括色澤、氣味、味道和果形特征等，理化指標(biāo)包含揮發(fā)油含量、水分和固體雜質(zhì)等，并無(wú)對(duì)花椒中最具特征的麻味物質(zhì)的定性定量測(cè)定評(píng)價(jià)，對(duì)花椒的質(zhì)量評(píng)價(jià)還缺乏整體性，難以反映其內(nèi)在品質(zhì)。關(guān)于不同花椒的麻味成分已有較多的報(bào)道[2-5]，特別是通過(guò)對(duì)比不同植物來(lái)源花椒麻味成分組成分析發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成麻味成分的不飽和脂肪酸酰胺類組分可作為花椒來(lái)源的判斷依據(jù)和花椒品質(zhì)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[6-9]，紅花椒、青花椒、竹葉花椒等不同的花椒品種，具有不同的麻味成分構(gòu)成指紋圖譜。基于花椒的麻味物質(zhì)基礎(chǔ)，在一些花椒主產(chǎn)地，已經(jīng)開(kāi)始制訂定量測(cè)定麻味成分的地方標(biāo)準(zhǔn)[10]，作為花椒產(chǎn)品質(zhì)量的重要指標(biāo)。

頂壇花椒中富含不飽和長(zhǎng)鏈脂肪酸酰胺和黃酮等多種成分[11,12]。頂壇花椒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)目前僅限于外形的判斷和產(chǎn)地的來(lái)源等初步方法，未能構(gòu)建其合理有效的質(zhì)量控制體系，作為名優(yōu)特產(chǎn)產(chǎn)品的貴州頂壇花椒，亟需建立一種可以從特色風(fēng)味物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行質(zhì)量控制，并能特征性區(qū)別于其他花椒產(chǎn)品的有效方法，作為其地理標(biāo)志產(chǎn)品的鑒別以及品牌的塑造的技術(shù)支撐。指紋圖譜是一種從整體上研究復(fù)雜物質(zhì)體系的技術(shù)，在花椒品種識(shí)別中也有報(bào)道[13,14]。但頂壇花椒的識(shí)別模式和麻味組分的特征未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)收集地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)范圍內(nèi)和周邊地區(qū)的頂壇花椒產(chǎn)品，研究其基于麻味成分的HPLC指紋圖譜，同時(shí)對(duì)其中主要麻味成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，為貴州頂壇花椒質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了科學(xué)依據(jù)，支撐特色名優(yōu)農(nóng)產(chǎn)品的特征性標(biāo)識(shí)和品牌保護(hù)。

1 材料

1.1 儀器與試劑

LC-MS 2020高效液相色譜-質(zhì)譜儀(帶PDA檢測(cè)器) 日本島津公司；Sartorius BP211D電子天平 德國(guó)賽多利斯公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲儀 昆山市超聲儀器有限公司；N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海埃朗公司；WND-500A型高速中藥粉碎機(jī) 浙江省蘭溪市偉能達(dá)電器有限公司；超純水機(jī) 美國(guó)Millipore公司；LGJ-20F冷凍干燥機(jī) 北京松源華興生物技術(shù)有限公司。

羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、γ-山椒素對(duì)照品(純度>98%)：均購(gòu)自成都麥德生中藥對(duì)照品有限公司；甲醇(色譜純)：購(gòu)自默克股份公司；其他試劑：均為分析純。

1.2 植物樣品

頂壇花椒樣品采集自以貴州省貞豐縣北盤(pán)江鎮(zhèn)、平街鄉(xiāng)、者相鎮(zhèn)、白層鎮(zhèn)4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)現(xiàn)轄行政區(qū)域?yàn)橹行牡捻攭ń返乩順?biāo)志產(chǎn)品保護(hù)地區(qū)范圍及其周邊地區(qū)擴(kuò)大種植的鄉(xiāng)鎮(zhèn)，樣品標(biāo)本統(tǒng)一收藏于貴州師范大學(xué)喀斯特研究院標(biāo)本室，頂壇花椒植物樣品均由貴州師范大學(xué)楊慶雄教授統(tǒng)一鑒定。其他品種花椒購(gòu)自國(guó)內(nèi)其他花椒主產(chǎn)區(qū)。其中樣品S1～S15為當(dāng)?shù)夭杉筮M(jìn)行曬干處理得到，S16～S32為頂壇花椒采集后1 d內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室冷凍干燥得到。不同批次花椒樣品信息見(jiàn)表1。

表1 不同批次花椒樣品信息Table 1 Information of different batches of Zanthoxylum bungeanum samples

續(xù) 表

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相甲醇(A)-水(B)，梯度洗脫(0～30 min，65%～80% A；30～40 min，80% A)，流速0.7 mL/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，進(jìn)樣體積5 μL。

共有峰的質(zhì)譜數(shù)據(jù)由LC-MS 2020的單四極桿質(zhì)譜儀采集得到，ESI離子源，正負(fù)離子模式同時(shí)采集，掃描分子量范圍200～800 m/z；質(zhì)譜條件：甲醇-水為流動(dòng)相梯度洗脫(A：水、B：甲醇，0～30 min：67%～80% B，30～45 min：80% B)，洗脫流速0.5 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm，柱溫30 ℃；干燥N2流量15 L/min；接口溫度350 ℃，DL溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃；接口電壓4.5 kV。

2.2 溶液制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

分別精密稱取羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、γ-山椒素對(duì)照品適量，置于容量瓶中，加入色譜甲醇溶解并定容，得到濃度分別為6.733，7.333，7.133，6.853，8.000，6.667 μg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)實(shí)驗(yàn)需要，分別稱取不同體積的各標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，稀釋得到不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

稱取花椒粉末(過(guò)40目篩)約0.025 g，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度，超聲30 min，冷卻至室溫后再定容，經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.3.1 精密度考察

稱取花椒粉末(S1)約0.025 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，以羥基-α-山椒素為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<1.5%，相對(duì)峰面積的RSD<2.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性考察

稱取同一供試品溶液(S1)花椒粉末(S1)6份，每份約0.025 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，以羥基-α-山椒素為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果所有共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD<1.5%，相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明此方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性考察

稱取花椒粉末(S1)約0.025 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別于0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 h測(cè)定峰面積，以羥基-α-山椒素為參照峰，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果所有共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1.0%，相對(duì)峰面積的RSD均<3.0%，表明花椒供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 精密度試驗(yàn)

精密吸取羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、γ-山椒素混合對(duì)照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品峰面積的RSD均<1.5%，表明本方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性試驗(yàn)

分別稱取供試品(S1)6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析。供試品溶液中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、γ-山椒素的峰面積RSD均<2.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取同一供試品溶液(S1)，分別于0，0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 h進(jìn)行檢測(cè)，記錄指紋圖譜，供試品溶液中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、γ-山椒素的峰面積RSD均<2.5%，表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5，1.25，2.5，4，5 mL于5 mL量瓶中，搖勻，即得系列混合對(duì)照品溶液。精密吸取系列對(duì)照品溶液5 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。分別以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量(對(duì)照品質(zhì)量濃度×進(jìn)樣體積)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到6種麻味素的工作曲線：羥基-α-山椒素為Y=16272000X+4234.5(R2=0.99993)，線性范圍為0.673～134.6 μg/mL；羥基-β-山椒素為Y=12007600X+13597.5(R2=0.9993)，線性范圍為0.733～146.6 μg/mL；羥基-γ-山椒素為Y=16972300X+5682.4(R2=0.99993)，線性范圍為0.713～142.6 μg/mL；羥基-ε-山椒素為Y=6946540X-568.1(R2=0.99988)，線性范圍為0.6853～137.06 μg/mL；羥基-γ-異山椒素為Y=17699900X+16504.3(R2=0.9996)，線性范圍為0.8～160 μg/mL；γ-山椒素為Y=3646520X+658.9(R2=0.99991)，線性范圍為0.67～134 μg/mL。結(jié)果表明，6種麻味成分在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4.5 加樣回收試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)定含量的花椒樣品(S1)共6份，每份約0.1 g，精密稱定后，分別加入混合對(duì)照品溶液0.8，1，1.2 mL(其中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-ε-山椒素、羥基-γ-異山椒素、γ-山椒素的質(zhì)量濃度分別685.3，673.3，733.3，713.3，800，666.7 μg/mL)，每種加入量平行測(cè)定2份。按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各組分的加樣回收率和RSD。羥基-ε-山椒素、羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素、羥基-γ-山椒素、羥基-γ-異山椒素、γ-山椒素的平均回收率分別為98.7%、110.7%、107.9%、111.62%、109.3%、99.82%。RSD均<3.0%，表明該方法準(zhǔn)確度較好。

2.4.6 含量測(cè)定結(jié)果

對(duì)采集自貴州頂壇花椒地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)范圍區(qū)域內(nèi)的15批次(S1～S15)自然晾干的頂壇花椒樣品、17批次(S16～S32)冷凍干燥的頂壇花椒、新鮮頂壇花椒(S33)及購(gòu)買(mǎi)自其他地方的花椒(S34～S37)，粉碎過(guò)40目篩，精密稱定0.025 g，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定分析，采用外標(biāo)法測(cè)定樣品中6種麻味成分的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同批次花椒樣品(0.025 g)中 6種麻味素含量測(cè)定結(jié)果Table 2 The detection results of content of 6 kinds of numb-taste components in different batches of Zanthoxylum bungeanum samples (0.025 g)

續(xù) 表

由表2可知，頂壇花椒麻味組分的總含量各批次之間有波動(dòng)，組成麻味的各個(gè)組分出現(xiàn)較強(qiáng)的規(guī)律。其中麻味強(qiáng)度大的γ-山椒素含量普遍偏低，含量最高的單組分為羥基-α-山椒素，其次為羥基-β-山椒素。通過(guò)冷凍干燥的方法得到頂壇花椒(S16～S32)，其中γ-山椒素和羥基-α-山椒素的含量顯著高于曬干頂壇花椒(S1～S15)，而羥基-β-山椒素的含量低于曬干產(chǎn)品。

2.5 聚類分析

2.5.1 基于HPLC圖譜共有峰的聚類分析

稱取花椒粉末(S1～S37)各約0.025 g，精密稱定，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，記錄各樣品色譜圖，見(jiàn)圖1。

圖1 不同批次(A)曬干、(B)冷凍干燥頂壇花椒 和(C)其他花椒樣品的色譜圖對(duì)比Fig.1 The comparison of chromatograms of different batches of (A)sun-dried,(B)freeze-dried Z. planispinum var. dingtanensis and (C)the other Zanthoxylum bungeanum samples

注：references為混合麻味素對(duì)照品；1為羥基-ε-山椒素；2為羥基-α-山椒素；3為羥基-β-山椒素；4為羥基-γ-山椒素；5為羥基-γ-異山椒素；6為γ-山椒素。

由圖1可知，與花椒中常見(jiàn)的麻味混合對(duì)照品HPLC圖對(duì)比，并結(jié)合HPLC圖譜中主要色譜峰的UV光譜圖和質(zhì)譜圖分子離子峰，花椒樣品的HPLC色譜圖中，保留時(shí)間在8 min以前的色譜峰均不是麻味素類成分，可能為花椒中的黃酮等酚類成分。出峰時(shí)間比γ-山椒素(tR=35 min)還長(zhǎng)的位置已經(jīng)未能明顯檢出麻味素組分。將不同批次的頂壇花椒樣品HPLC色譜圖導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A版)，并根據(jù)麻味組分的出峰時(shí)間進(jìn)行溶劑峰(8 min)和尾峰(40 min)切除。以S1為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間寬度設(shè)定為0.10 min，多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，計(jì)算色譜峰匹配結(jié)果，選取37個(gè)樣品中匹配數(shù)大于30的色譜峰，以含量最高的羥基-α-山椒素(tR=18.7 min)做參照峰，計(jì)算其余色譜峰的相對(duì)峰面積。另外，考慮到S34、S35兩個(gè)樣品的色譜峰中出現(xiàn)了tR=13.5 min的典型色譜峰，與其他大部分樣品的色譜圖具有顯著性差異，故將該色譜峰也作為指標(biāo)進(jìn)行聚類分析。以這些匹配峰的相對(duì)峰面積作為變量，采用組間聯(lián)接法，以歐式距離的平方為測(cè)度，運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析，見(jiàn)圖2。

圖2 37批花椒基于HPLC共有峰的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of 37 batches of Zanthoxylum bungeanum based on the common peaks of HPLC spectra

由圖2可知，當(dāng)類間距離為25時(shí)，37批花椒可以分為兩類：(S34、S35)為一類，其余為另一類；當(dāng)類間距離為5時(shí)，則分為三大類：(S1～S15、S36、S37)、(S16～S33)和(S34、S35)；當(dāng)類間距離小于2時(shí)，(S1～S15、S36、S37)這個(gè)集合中的幾個(gè)樣本(5，7，11，15)又被單獨(dú)聚為一小類，區(qū)別于集合中其他樣本。

37個(gè)花椒樣品中，S34、S35兩者分別是購(gòu)自四川和山東的紅花椒，S1～S15為自然曬干的頂壇花椒，S16～S32為冷凍干燥的頂壇花椒，S33為新鮮的頂壇花椒，S36、S37為分別購(gòu)自甘肅和陜西的紅花椒。對(duì)比聚類分析后得到的各類典型HPLC色譜圖發(fā)現(xiàn)，(S34、S35)組的色譜圖與文獻(xiàn)中紅花椒的典型指紋圖譜基本相同，與其他所有樣品具有顯著性的差異，而S36、S37同樣作為紅花椒，卻在不同的分類層次中，曬干的頂壇花椒處于同一組。這個(gè)結(jié)果與S34、S35色譜圖中的tR=13.5 min特征峰有關(guān)，同時(shí)，由于購(gòu)自市場(chǎng)上的紅花椒的植物來(lái)源無(wú)法明確鑒定，因而同為紅花椒的S36、S37與文獻(xiàn)中的竹葉花椒的指紋圖譜較為相似，甘肅和陜西為竹葉花椒的主產(chǎn)區(qū)之一，購(gòu)自陜西和甘肅的S36、S37可能的植物來(lái)源與此有關(guān)。33批頂壇花椒樣品采集自相同的地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)的區(qū)域，范圍相對(duì)比較集中，來(lái)源明確，所以色譜圖的差異較小。但從聚類結(jié)果看，干燥方法的差異將同樣來(lái)源于頂壇花椒的樣品分成了兩大類，其中冷凍干燥的頂壇花椒(S16～S32)的羥基-α-山椒素組分，在其色譜圖中表現(xiàn)為麻味成分的最主要組成，其他麻味素色譜峰占比很小。相較于曬干的頂壇花椒(S1～S15)比重更大，而后者中羥基-β-山椒素的比重顯著上升。在曬干組中，又進(jìn)一步地分為兩個(gè)小組，有可能是由于曬干條件的差異導(dǎo)致了小的變化。

聚類分析結(jié)果提示，不同干燥方法對(duì)頂壇花椒的品質(zhì)和風(fēng)味特征具有顯著的影響。冷凍干燥花椒麻味組分的色譜圖與新鮮花椒(S33)的色譜圖更為接近。

2.5.2 基于麻味組分含量的聚類分析

根據(jù)2.4.6中得到的6種麻味素含量測(cè)定結(jié)果，以含量最高的羥基-α-山椒素作為參照，分別計(jì)算37批花椒樣品中的6種麻味素的相對(duì)含量。以6種麻味素的相對(duì)含量作為變量，采用組間聯(lián)接法，以歐式距離的平方為測(cè)度，運(yùn)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析，見(jiàn)圖3。

圖3 37批花椒基于麻味成分相對(duì)含量的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of 37 batches of Zanthoxylum bungeanum based on the relative content of numb-taste components

由圖3可知，與以上的聚類分析結(jié)果類似，當(dāng)類間距離為25時(shí)，37批花椒同樣被分成了兩類，但與2.5.1中的結(jié)果不同，S34、S35由于在測(cè)定過(guò)程中未考慮特征色譜峰(tR=13.5 min)對(duì)麻味成分的貢獻(xiàn)(為定量測(cè)定)，使得兩者被并入了曬干頂壇花椒(S1～S15、S36、S37)這一大組中，說(shuō)明這兩種花椒的不同麻味組分間的相對(duì)含量，在不包括特征峰的貢獻(xiàn)時(shí)，與曬干頂壇花椒樣品類似。改變類間距離后，曬干組頂壇花椒最后可以聚類為3個(gè)小組，與之前的聚類結(jié)果有一定的差距，可能是外標(biāo)法含量測(cè)定結(jié)果計(jì)算的不同使組分間的相對(duì)含量與相對(duì)峰面積的數(shù)值有一定的差別。但冷凍干燥組和新鮮花椒(S16～S33)穩(wěn)定地被聚為一大類，也提示溫和的冷凍干燥方法對(duì)頂壇花椒產(chǎn)品的品質(zhì)控制有利。

兩種基于不同變量的聚類分析結(jié)果說(shuō)明，頂壇花椒由于采集后干燥方法的差異，導(dǎo)致其中麻味成分的組成特征發(fā)生了較為顯著的變化。

2.6 頂壇花椒HPLC指紋圖譜的建立

2.6.1 頂壇花椒指紋圖譜測(cè)定

根據(jù)聚類分析結(jié)果，頂壇花椒樣品根據(jù)干燥方法的不同顯著地分成了兩組。這兩組間的特征，可以反映頂壇花椒產(chǎn)品的麻味組分的差異。從頂壇花椒最終產(chǎn)品的質(zhì)量控制角度考慮，分別對(duì)這兩種類型的頂壇花椒產(chǎn)品建立指紋圖譜。

根據(jù)2.5.1中得到的HPLC色譜圖，將兩個(gè)批次頂壇花椒樣品分別導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2004A版)，并根據(jù)麻味組分的出峰時(shí)間進(jìn)行溶劑峰起初和尾峰切除。以S1作為S1～S15、S16為S16～S32的參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間寬度設(shè)定為0.10 min，多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配生成指紋圖譜，見(jiàn)圖4。

曬干頂壇花椒(S1～S15)的共有模式對(duì)照指紋圖譜中，標(biāo)定了7個(gè)麻味成分的共有峰(見(jiàn)圖4中A和表2)，通過(guò)對(duì)比對(duì)照品的保留時(shí)間和質(zhì)譜圖，分別鑒定出已知的麻味素羥基-ε-山椒素(峰2)、羥基-α-山椒素(峰4)、羥基-β-山椒素(峰5)，共有峰3具有與羥基-ε-山椒素、羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素相同的分子量，則可以認(rèn)為是這3個(gè)麻味素的另一個(gè)同分異構(gòu)體。麻味強(qiáng)度最強(qiáng)的γ-山椒素在15批次曬干頂壇花椒樣品中含量低而且不穩(wěn)定(見(jiàn)表1)[15]。冷凍干燥頂壇花椒(S16～S32)的共有模式對(duì)照指紋圖譜中，標(biāo)定了6個(gè)麻味共有峰(見(jiàn)圖4中B和表2)，鑒定出了羥基-ε-山椒素(峰1)、羥基-α-山椒素(峰2)、羥基-β-山椒素(峰3)、羥基-γ-山椒素(峰4)和γ-山椒素(峰6)5個(gè)已知麻味素。其中麻味最強(qiáng)的γ-山椒素作為共有峰出現(xiàn)，含量顯著大于曬干頂壇花椒(見(jiàn)表1)。羥基-α-山椒素在兩類頂壇花椒中都是含量最高的麻味素，但冷凍干燥的頂壇花椒中相對(duì)含量更大，而麻味強(qiáng)度較小的羥基-β-山椒素在曬干品中則變大。

圖4 曬干(A)和冷凍干燥(B)頂壇花椒的HPLC共有峰模式Fig.4 HPLC common peak pattern of (A) sun-dried and (B) freeze-dried Z.planispinum var. dingtanensis

結(jié)果顯示：兩種干燥方法處理的頂壇花椒指紋圖譜，可以較為方便地表現(xiàn)出兩類頂壇花椒產(chǎn)品的不同麻味素相對(duì)組成特征。

2.6.2 相似度測(cè)定

表3 15批曬干頂壇花椒及17批凍干頂壇花椒的 共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積Table 3 The relative retention time and relative peak areas of the common peaks of 15 batches of sun-dried Z. planispinum var. dingtanensis and 17 batches of freeze-dried Z. planispinum var. dingtanensis

由表3可知，曬干頂壇花椒供試品之間的相似度及其與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均大于0.98，而冷凍干燥花椒供試品之間的相似度及其與對(duì)照指紋圖譜之間的相似度均大于0.99(見(jiàn)表4和表5)，說(shuō)明根據(jù)相同干燥方法得到的頂壇花椒產(chǎn)品可以保持較高的穩(wěn)定性。

表5 17批次凍干頂壇花椒相似度計(jì)算結(jié)果Table 5 Simlilarity calculation results of 17 batches of freeze-dried Z.planispinum var. dingtanensis

3 討論

本研究首先確立了花椒中主要麻味素組分HPLC分離方法，色譜條件下，花椒中主要麻味成分的色譜峰分離度、基線和峰形都較好，色譜峰信息豐富，并通過(guò)紫外吸收和質(zhì)譜結(jié)果進(jìn)行了溶劑峰和尾峰切除，集中對(duì)比更能反映花椒風(fēng)味特征的麻味組分。

基于共有峰(配對(duì)大部分的樣品)相對(duì)峰面積和6種麻味素相對(duì)含量作為變量的聚類分析，可以明確指出，頂壇花椒具有與其他來(lái)源花椒不同的麻味素組成特征，但與近緣種之間可能具有一定的相似性。更為重要的是，對(duì)花椒采集后以不同方法進(jìn)行干燥，得到的花椒產(chǎn)品的麻味素組分表現(xiàn)出不一樣的特點(diǎn)，并可以據(jù)此區(qū)分出不同的產(chǎn)品類別。因而，本文在此基礎(chǔ)上完成了對(duì)不同處理方法得到的頂壇花椒指紋圖譜的研究。

37個(gè)批次花椒樣品的6個(gè)麻味素質(zhì)量分?jǐn)?shù)波動(dòng)較大。與其他來(lái)源的花椒對(duì)比，頂壇花椒樣品的總麻味素含量總體呈現(xiàn)較高的水平。因?yàn)槠渌麃?lái)源花椒的樣品數(shù)量太少，難以進(jìn)行更全面對(duì)比，但也從側(cè)面說(shuō)明頂壇花椒確實(shí)具備了麻味重的特色。

對(duì)兩種頂壇花椒產(chǎn)品指紋圖譜共有峰的結(jié)構(gòu)確認(rèn)結(jié)果指出，構(gòu)成兩種產(chǎn)品的麻味組成成分大部分相同，但不同成分的相對(duì)含量有差別。由對(duì)照指紋譜圖可以看出，冷凍干燥的頂壇花椒與新鮮花椒的麻味組成基本一致，其中羥基-α-山椒素的含量明顯高于自然曬干花椒中的含量。33個(gè)批次的頂壇花椒麻味素含量測(cè)定結(jié)果也顯示，羥基-α-山椒素是大多數(shù)花椒的主要麻味成分，含量最高。冷凍干燥頂壇花椒不同批次樣品中，羥基-α-山椒素的相對(duì)含量測(cè)定也高于曬干頂壇花椒，但羥基-β-山椒素的相對(duì)含量明顯低于曬干品。頂壇花椒曬干或烘干過(guò)程中的光照(或加熱)導(dǎo)致的不飽和脂肪酸酰胺中順勢(shì)構(gòu)型雙鍵轉(zhuǎn)變?yōu)闊崃W(xué)更穩(wěn)定的全反式結(jié)構(gòu)，使得曬干頂壇花椒中羥基-α-山椒素比重下降，羥基-β-山椒素增加?；ń分袠O性較小的γ-山椒素的麻味強(qiáng)度最大，山椒素氧化后得到的極性較大的羥基-山椒素，麻味強(qiáng)度減弱，并且不同羥基-山椒素的麻味強(qiáng)度差異也較大，如羥基-α-山椒素的麻味強(qiáng)度閾值比羥基-β-山椒素低1倍以上。溫和的冷凍干燥處理方法，使得凍干頂壇花椒產(chǎn)品中麻味強(qiáng)度最大的γ-山椒素得以保留，并成為其指紋圖譜中的重要指標(biāo)，這可能也是新鮮花椒或凍干花椒比曬干品麻味大的原理。

本研究提示了花椒生產(chǎn)中采用不同的干燥方法，可以影響其麻味素的組成特征。因而在花椒產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)中，需要關(guān)注麻味成分結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化和含量變化，如作為調(diào)味品的花椒產(chǎn)品，保持麻味更強(qiáng)的羥基-α-山椒素和γ-山椒素的含量，這將有利于保持頂壇花椒產(chǎn)品“麻味重、香味濃”的品質(zhì)特征，則需要對(duì)新鮮花椒采摘后的干燥方法和過(guò)程進(jìn)行合理控制。冷凍干燥方法可以得到與新鮮花椒產(chǎn)品類似的風(fēng)味特征，但成本較高，曬干或烘干會(huì)導(dǎo)致高強(qiáng)度麻味組分含量的降低，但生產(chǎn)成本更低。同時(shí)，HPLC指紋圖譜不僅可以有效地區(qū)分不同干燥方法得到的頂壇花椒產(chǎn)品，作為產(chǎn)品質(zhì)量控制的重要手段，同時(shí)基于頂壇花椒與其他植物來(lái)源花椒HPLC指紋圖譜共有峰特征的差異，還可以作為頂壇花椒地理標(biāo)志產(chǎn)品的判別。