花椒中麻味物質的呈味機理及制備方法研究進展

徐丹萍，蒲 彪,，葉 萌，卓志航，付本寧

（1.四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014；2.四川農業(yè)大學林學院，四川 成都 611130）

花椒是蕓香科、花椒屬落葉灌木或小喬木，種類有Zanthoxylum bungeanum、Zanthoxylum piperitum、Zanthoxylum schinifolium、Zanthoxylum armatum DC.等[1]。經人工和自然選擇在全國形成的優(yōu)良花椒品種及其中間類型大約有60 種[2]。通常所說的花椒指的是果實成熟后的花椒干果皮?；ń饭ぃㄒ韵陆y(tǒng)稱花椒）具有濃郁辛香，可作為調味品、香料、木本油料或入藥[3]?；ń分谢瘜W成分主要有揮發(fā)油、酰胺、生物堿、黃酮等，引起麻味的主要成分是鏈狀多不飽和脂肪酸酰胺[4]，這些花椒中提取的引起人體辛麻感覺的酰胺類物質統(tǒng)稱為麻味物質，麻味物質以山椒素為主要代表。麻味物質在空氣中極易發(fā)生化學變化，目前國內外尚未建立花椒麻味評價及適用于工業(yè)生產的麻味物質提取的標準方法，這一現狀阻礙了花椒的深加工及廣泛的市場流通。不少學者對酰胺的制備方法及產生麻味的原因進行了分析，試圖揭開麻味物質在人體中的響應機制并為花椒中麻味物質的快速檢測構建有效方法。本文主要對花椒中麻味物質的主要種類、麻味物質呈味機理及制備方法的研究現狀進行綜述，為花椒麻味物質構效關系的深入探究和麻味物質檢測標準方法的建立等提供支持。

1 麻味物質的主要種類

表1 山椒素及其衍生物結構Table1 Structures of sanshool and its derivatives in prickly ash

麻味物質分布于花椒的花、莖、葉、果皮、種子中，并在果皮中的含量最高[5-7]。大部分麻味物質為白色晶體，易溶于氯仿、乙酸乙酯等有機溶劑。結晶體在空氣中易變色，一般在安瓿瓶中充氮氣密封保存[5]。目前從花椒中分離鑒定出的天然不飽和脂肪酸酰胺有20多種[8-12]，其中具有麻味的成分主要是以山椒素為代表的α-、β-、γ-、δ-山椒素等及其衍生物、結構如表1[8,13-14]。這些山椒素及其衍生物在結構上都有一個酰胺基團頭部（N端）和一個鏈狀多不飽和烷基尾部（C端），且C鏈末端都有3 個共軛雙鍵；主要區(qū)別體現在C端烷基鏈長短、C端不飽和雙鍵個數和位置及N端異丁基結構的變化。

2 麻味物質的呈味機理

2.1 麻味物質激發(fā)感覺神經

不同麻味物質對人體產生的具體感覺不同，例如羥基-α-山椒素主要產生刺痛的感覺，δ-、γ-和α-山椒素產生燃燒的感覺，而β-山椒素則主要產生麻木的感覺等[15-16]。麻味不是基本味覺，人體對麻味的感知主要與酰胺基團有關。一方面，酰胺基團N原子上的孤對電子不定域不易與其他原子形成共價鍵，脂烴基對氨基氮的斥電子效應使N原子上的電子云密度增大；另一方面，酰胺基團的C＝O雙鍵與脂肪鏈上的C＝C雙鍵形成π-π共軛，使電子云向氧原子方向移動，造成整個酰胺基團電子云密度增大，與質子結合力變強，刺激舌黏膜和觸覺神經產生辛麻感[17]。

不少學者從生理機制角度提出了辛麻感產生的原因：

一種觀點認為，麻味物質通過激活瞬時受體電位（transient receptor potential，TRP）V1和TRPA1離子通道來激活感覺神經。TRPV1離子通道除了可以被麻味物質激活外，還可以被熱（43 ℃）和質子激活，TRPA1離子通道主要在感覺神經末梢中與TRPV1共表達[18]。TRPA1和TRPV1是非選擇性陽離子通道，屬于TRP家族[19]。TRP家族現在包括超過30 個陽離子通道，其中大多數可滲透二價和單價陽離子，包括Ca2＋、Na＋和Mg2＋[20]。這些離子通道介導細胞對外部瞬時刺激（例如溫度、光、機械力和滲透壓）的“受體”誘導的響應。刺激作用可以增加或降低TRP通道對特定離子的選擇性滲透性，隨后改變細胞膜電位并導致去極化[21]。TRPV1和TRPA1在受到麻味物質的刺激后，使感覺神經元去極化，引起Ca2＋內流，并誘發(fā)內向電流[22-23]，使人體感受到麻味物質帶來的辛麻感覺。

另外一種觀點認為，麻味物質通過抑制兩孔鉀離子通道激發(fā)感覺神經元。兩孔鉀離子通道能夠作為動作電位和興奮性的主要調節(jié)器與感覺神經元相互作用[24]。對大鼠細胞外的三叉神經纖維研究表明羥基-α-山椒素能夠激活三叉神經元引發(fā)刺激感受[25]。據報道，KCNK兩孔鉀離子通道家族的3 個成員KCNK3、KCNK9和KCNK18作為羥基-α-山椒素受體，與通過刺激物打開TRP通道相反，羥基-α-山椒素抑制兩孔鉀離子通道導致感覺神經元活化[26]。Beltrán[27]等通過使用非洲爪蟾卵母細胞的兩電極電壓鉗實驗評估幾種刺激性化合物對野生型和突變型兩孔鉀離子通道的影響，發(fā)現幾種刺激性化合物均能抑制兩孔鉀離子通道。

2.2 麻味物質的構效關系

電位離子通道TRPV1和TRPA1能被山椒素及其衍生物激活產生辛麻感，但是當刺激性物質的結構不同時，能刺激不同的受體產生刺激感受[28]。據報道，羥基-α-山椒素衍生物烷基鏈結構和極性酰胺結構在TRPA1激活中起作用，TRPA1的激活完全依賴烷基鏈部分，但是烷基結構的修飾和改變對TRPV1的激活卻具有非常低的影響，意味著TRPA1對于山椒素的不飽和性表現出了選擇性，而TRPV1沒有表現出選擇性[13]。雖然花椒中的刺激性感覺由TRPA1和TRPV1共同介導，但對于TRPA1激活，羥基-α-山椒素的多烯鏈中的順式C6雙鍵是關鍵的，而對于TRPV1的激活不需要結構特異性[29]。此外，麻味強度受到C鏈長短及N端結構的影響，C鏈長度越長麻味強度越低；同時，N端結構對麻味強度的影響，按照降序排列順序依次是：異丁基酰胺、哌啶、乙醇胺和2-乙基己胺、吡咯烷、3-甲基丁胺、丁胺和甲基丁基酰胺[30-31]。

圖1 麻味物質必需結構[32]Fig. 1 Structural requirements of numb-taste compounds[32]

據報道，N端酰胺最小結構N-（2-甲基-2-羥丙基）酰胺和C端烷基鏈基序CH＝Z＝CH—CH2—CH2—CH＝E＝CH是麻味物質引發(fā)辛麻感的必需結構，如圖1所示。C鏈上的順勢雙鍵結構是引發(fā)麻味的關鍵結構，且C鏈上不能有其它支鏈的存在。圖1中x、y代表C端烷基鏈的長度，n代表雙鍵的個數，R代表N端酰胺基團所連結構。當R＝H、n＝1、x＝1時是產生辛麻感的最小結構；當N端R被—OH取代時，麻味強度提高；最小結構加兩個可選結構可以產生明顯的麻味，即在最小結構的基礎上，同時滿足可選結構3 個條件（R＝OH、n＝2、x＞2）中的兩個，產生明顯麻味。

3 麻味物質的制備方法

對麻味物質激活感覺神經和構效關系的探索引發(fā)了學者對麻味物質制備的研究。花椒中麻味物質的制備方法主要有常規(guī)制備方法和化學合成的方法。常規(guī)制備方法即利用有機溶劑、超臨界CO2萃取，通過系列柱層析、制備色譜等分離純化進行制備；化學合成方法即借助易得到的化合物作為反應起始物，通過一系列化學反應合成具有特定結構的麻味物質。

3.1 常規(guī)制備方法

目前麻味物質的常規(guī)制備過程是：首先，利用有機溶劑或超臨界CO2等對樣品進行初步提取，初提后的樣品進行硅膠、凝膠等色譜的梯度洗脫，收集不同洗脫條件下的餾分；其次，利用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜（gas chromatography，GC）、質譜（mass spectrometry，MS）等直接進行定性、定量，或者采用制備型薄層色譜（thin-layer chromatography，TLC）、制備/半制備型HPLC、高速逆流色譜（high-speed counter-current chromatography，HSCCC）、超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）等儀器進一步對樣品分離純化；最后結合核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）、紅外光譜（infrared spectrum，IR）、紫外光譜（ultraviolet spectrum，UV）、MS分析等，進行麻味物質結構的鑒定[8-11]。

3.1.1 麻味物質的提取和分離

常用的提取方法有有機溶劑提取、超臨界CO2萃取等，主要的分離方法有硅膠色譜、制備/半制備型HPLC、HSCCC、UPLC等。

用于麻味物質初步提取的有機溶劑有甲醇、乙醇、氯仿、石油醚、乙醚、植物油等[9,11,23,33-34]，其中甲醇、乙醇是最常使用的麻味物質粗提溶劑。單一的有機溶劑提取得到的麻味成分的含量較低，一般結合其他方法進行提純。用石油醚作為索氏提取的溶劑，經甲醇溶液浸提后，采用逆流干柱層析法提取花椒油樹脂中的麻味物質，不飽和酰胺在麻味物質純品中的相對含量達到了95.50%[35]。有機溶劑提取法的缺點比較明顯，易引入雜質，導致麻味物質變性，提取率較低，所得麻味成分質量不高等。超臨界CO2萃取技術溶解度相對較高，并且可以有效避免萃取成分發(fā)生化學變化，能夠與萃取成分完全分離，是花椒和辣椒刺激成分萃取的有效方法[36-37]。采用超臨界CO2萃取花椒麻味成分，用半制備型HPLC分離提純，得到的羥基-α-山椒素純度達到98.2%[38]。

大孔樹脂、硅膠、凝膠等配合使用，利用不同溶劑梯度洗脫，能夠得到種類和質量不同的樣品。用于麻味物質柱色譜分離中梯度洗脫的溶劑主要有正己烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇等[11]。采用Toyopearl HW-40C、MCI-gel CHP-20P和YMC-gel ODS色譜分離，結合制備型HPLC純化含有酰胺的級分，Hatano等[10]從花椒中成功分離出了6 種長鏈多不飽和酰胺類化合物（1）～（6），分別是（1）：（6RS）-(2E,7E,9E）-6-羥基-N-（2-羥基-2-甲基丙基）-11-氧代-2,7,9-十二碳三烯酰胺、（2）：（11RS）-（2E,7E,9E）-11-羥基-N-（2-羥基-2-甲基丙基）-6-氧代-2,7,9-十二碳三烯酰胺、（3）：（10RS,11SR）-（2E,6Z,8E）-10,11-二羥基-N-（2-羥基-2-甲基丙基）-2,6,8-十二碳三烯酰胺、（4）：（10RS,11RS）-(2E,6Z,8E）-10,11-二羥基-N-（2-羥基-2-甲基丙基）-2,6,8-十二碳三烯酰胺、（5）：（6RS,11SR）-(2E,7E,9E）-6,11-二羥基-N-（2-羥基-2-甲基丙基）-2,7,9-十二碳三烯酰胺、（6）：（6RS,11RS）-（2E,7E,9E）-6,11-二羥基-N-（2-羥基-2-甲基丙基）-2,7,9-十二碳三烯酰胺。Sugai等[39]利用硅膠色譜和半制備型HPLC對花椒不同部位的麻味物質進行了分析，認為麻味物質主要存在于其果實中，幼葉和花中的主要麻味成分是α-山椒素，果實中的主要麻味成分是羥基-α-山椒素。HSCCC是20世紀80年代發(fā)展起來的一種連續(xù)、高效的液-液分配色譜分離技術，因不需要任何固態(tài)支撐物或載體，避免了不可逆吸附引起的樣品損失、失活、變性等問題，適于天然產物的分離，廣泛應用在食品、醫(yī)藥、天然產物等領域[40-41]。Wang Shi等[42]采用HSCCC法在正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比為7∶3∶5∶5，流速為1.5 mL/min，轉速為850 r/min的條件下，得到純度為98.0%的烷基酰氨0.19 g，所得物質純度高、得率大。UPLC是基于小顆粒填料的液相色譜技術，可以實現樣品的同時檢測。Kumar等[43]采用超高效液相色譜-二極管陣列檢測器結合串聯(lián)電噴霧離子化質譜（ultra performance liquid chromatography-diode array detector-electrospray ionizationtandem mass spectrometry，UPLC-DAD-ESI-MS/MS）對青花椒中的酰胺、呋喃木酚木脂素、芝麻素等幾種化合物進行了同時定量，并鑒定了16 種酰胺類化合物和呋喃丹木脂素類化合物，縮短了分析時間并減少了溶劑消耗。

3.1.2 麻味物質的結構鑒定

經分離提純后的樣品通過NMR、IR、UV、MS等進行綜合分析，能夠得到麻味物質的精確化學結構，為進一步研究麻味物質的構效關系及不同麻味物質間的相互作用提供了基礎[42]。

NMR、IR、UV、MS能夠提供化合物中原子的化學位移、耦合常數、積分曲線，分子中化學鍵、官能團的振動吸收頻率，電子躍遷吸收波長，離子質荷比等方面的信息，是進行結構鑒定的常用方法。Bader等[8]將超臨界流體萃取的四川花椒（Zanthoxylum piperitum）中的麻味物質進一步通過液相色譜-飛行時間質譜（liquid chromatography-time of flight- mass spectrometry，LC-TOF-MS）、LC-MS及1D/2D NMR分析，檢測出了8 種不飽和脂肪酸酰胺，7 種麻味物質的結構得到了鑒定，其中1 種未經過文獻報道。利用有機溶劑甲醇進行初提，正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等進行硅膠色譜梯度洗脫，YMC色譜柱過濾，結合LC-Q-TOF-MS、NMR、傅里葉變換紅外光譜進行分析，Yang等[11]從花椒（Zanthoxylum piperitum）中提取鑒定出了9 種化合物，其中化合物6,7,10,11-四羥基-N-（2-羥基-2-甲基丙基）-2E,8E-十二碳二烯酰胺是在花椒中新發(fā)現的物質。Tian Junmian等[9]將經過乙醇提取后的提取物在硅膠柱色譜上用CHCl3重復洗脫，并依次經過羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20）、反相柱色譜、制備型TLC、半制備型HPLC進行純化，利用MS、IR、NMR進行結構鑒定，最終得到了8 種化合物，其中3 種是花椒中新鑒定出的長鏈不飽和酰胺。

3.2 麻味物質的化學合成

因麻味物質結構中不飽和雙鍵的存在，使其在常規(guī)制備方法中容易產生異構化、氧化、聚合或光降解等反應，且常規(guī)制備方法操作繁瑣、提取效率低，不適于大規(guī)模生產。因此，不少學者對麻味物質尤其是山椒素的化學合成方法進行了探索。

Wittig反應是合成雙鍵、共軛雙烯、醛、酮等結構的重要反應，也是麻味物質合成的常用方法。Sonnet[44]在1969年最先報道了合成β-山椒素的方法，利用Wittig反應采用市售山梨醛為起始反應物，經過5 步化學反應得到得率為72%白色針狀麻味物質。以2,6,8,10-十二碳四烯酸作為合成反應的關鍵中間體，Wu Bo等[45]利用涉及6 個反應的Wittig反應得到了總產率為21%的羥基-α-山椒素。以2,6,8,10-十二碳四烯酸作為反應中間體不僅可以用于制備山椒素，而且可以制備酰胺類似物來豐富酰胺文庫。

然而，Wittig反應作為一種低選擇性合成方法，在所合成的山椒素結構中都缺少羥基，不能實現物質的空間結構的立體選擇性。Igarashi等[46]在2012年首次報道了采用Suzuki-Miyaura偶聯(lián)反應進行羥基-α-山椒素和羥基-β-山椒素全合成的方法，這種方法能夠選擇性合成具有羥基基團的順式/反式結構的山椒素。Aoki等[47]探索了一種通過2,4-己二烯醛與Fe（CO）3絡合合成羥基-α-、羥基-β-和γ-山椒素的方法，最終得到3 種山椒素的總產率分別是45%、26%和31%，這種方法能夠體現立體選擇性并得到具有羥基基團的特定化合物。此外，得到的中間產物2,6,8,10-十二碳四烯酸作為1 種固體羧酸可以用作麻味物質的替代保存品，并實現麻味物質的大規(guī)模生產。采用立體選擇性Wittig反應、Corey-Fuchs反應，在合成過程中共享相同的中間體Z異構體2,4,8,10,12-十四碳五烯酸，并對上述Aoki的方法進行改進，可以得到更高產率的γ-山椒素和羥基-γ-山椒素[14]。除上述幾種山椒素外，δ-山椒素因還可以用作I型糖尿病的潛在治療藥物，其化學合成方法也已經建立起來[48]。

麻味物質容易發(fā)生化學變化，分離純化較復雜，提取率低，麻味物質標準品還未實現工業(yè)化生產?；瘜W合成麻味物質采用市售化學物質作為反應起始物，能夠在工業(yè)化生產中通過控制化學反應過程關鍵參數，以經濟、可控、快速、規(guī)?；臉藴蕦崿F批量生產。此外，以化學反應中間體作為麻味物質前體物質進行保存，能夠有效實現麻味物質保存、運輸等過程的穩(wěn)定性[47]?；瘜W合成麻味物質為麻味物質標準品制備、花椒中麻味物質含量檢測、花椒分級及花椒油標準制定等領域提供了條件。

4 結 語

目前的研究表明山椒素是刺激口腔黏膜產生麻味的主要物質，通過研究刺激受體激活的山椒素基團或結構的類型，對探明酰胺產生麻味的必需結構具有一定意義。物質的麻味強度受分子結構的影響，通過將麻味物質結構數值化，量化麻味強度和分子結構的關系，有助于深入分析麻味物質的構效關系?；ń分形镔|種類復雜，麻味強度還受到揮發(fā)油、酮類等物質的影響，探究其他物質對麻味強度的相生相克作用，有助于明確人體對麻味的響應機制。

國內外還沒有麻味評價或者麻味物質標準品制備的標準方法，亟待建立麻味物質快速、工業(yè)化制備方法。麻味物質在空氣中易發(fā)生化學變化，常規(guī)提取制備過程繁瑣，不適于大規(guī)模生產，通過探索化學合成、分子印跡、微萃取技術等麻味物質制備的新方法，是滿足工業(yè)化和市場化的需求的一個努力方向。采用刪除不必要的結構或分析用其他基團取代麻味物質部分結構（例如采用苯環(huán)替代C鏈末端的共軛結構等），穩(wěn)定麻味物質的化學性質，來探索麻味物質新型保存方法。此外，改進現有方法，或借助感官評價、電子舌等方法，從整體上對花椒的麻味進行評價，建立不同產地、不同品種花椒的麻味評價體系，也將對花椒產業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

在化學合成中，探索化學性質更穩(wěn)定、選擇性合成更有效、經濟成本更低的反應中間體，麻味物質的保存可以轉化為合成反應中間體的保存，實現批量、便捷、低成本運營。構建麻味物質及其類似物文庫，能夠為深入探究麻味物質結構對麻味強度的影響及麻味物質在人體中的響應機制提供豐富資源，也是今后麻味物質研究的一個方向。