骨髓單個核細胞移植對潰瘍性結(jié)腸炎小鼠miR-21及炎癥因子TNF-α表達的影響

陳曦 韓宇鵬 陳剛 苗秋實 李錦倫 姜威

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科，黑龍江 佳木斯 154000)

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)屬于炎癥性腸病的范疇，近年來其發(fā)病率與患病率逐年增加。目前針對UC的傳統(tǒng)治療均未達到明確療效，疾病控制并不理想，所以探索一種高效的治療方法成為當(dāng)前主要研究方向。研究發(fā)現(xiàn)〔1〕，骨髓單個核細胞(BM-MNCs)移植可以有效地治療UC，但機制研究不多，本實驗通過建立UC小鼠模型，使用BM-MNCs移植治療小鼠UC，以探討其作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗動物 54只健康成年KM小鼠，雄性，體重29～31 g，由遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司提供。

1.2試劑 小鼠骨髓淋巴細胞分離液試劑盒(天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司)，磷酸鹽緩沖液(PBS)(武漢博士德生物工程有限公司)，動物組織miRNA提取試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)、cDNA第一鏈合成試劑盒(上海羅氏)、葡聚糖硫酸鈉(DSS)(美國MP公司)、電化學(xué)發(fā)光(ECL)液、放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)。

1.3分組與造模 將小鼠隨機分成移植組、PBS組和Control組，每組18只。將移植組、PBS組進行UC模型造模，給予小鼠2.5%的DSS溶液自由飲用7 d，Control組常規(guī)實驗中心滅菌水和飼料喂養(yǎng)。

1.4BM-MNCs制備 用10%的水合氯醛將KM小鼠麻醉處死，剝離股骨和脛骨，用剪刀剪斷骨頭兩端，露出內(nèi)腔，制備BM-MNCs懸液，實驗操作嚴格按照說明書進行。臺盼藍檢測骨髓細胞成活率，使用4′6-二脒基2-苯基吲哚(DAPI)標(biāo)記BM-MNCs懸液。

1.5BM-MNCs移植 UC造模成功后，移植組經(jīng)尾靜脈注入0.4 ml細胞懸液(含3×106個DAPI標(biāo)記的P3-BM-MNCs)；PBS組及Control組尾靜脈注入0.4 ml PBS。

1.6一般情況觀察 給予充足的水和食物，對小鼠的體質(zhì)改變，進食、排便情況、體重及精神狀態(tài)進行密切觀察。小鼠疾病活動指數(shù)(DAI)評估〔2〕：實時觀察檢測體重變化、糞便性質(zhì)，檢測便隱血情況，并詳細記錄。根據(jù)表1進行DAI評分。

表1 DAI評分

1.7Western印跡檢測結(jié)腸組織腫瘤壞死因子(TNF)-α的表達 移植5 d后，KM小鼠用10%水合氯醛麻醉處死，剖取結(jié)腸，縱行剪開，PBS沖洗后采集新鮮結(jié)腸組織，使用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液制備蛋白樣品，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，上樣，60 V電泳30 min，80 V電泳90 min，恒流200 mA轉(zhuǎn)模100 min，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗(1∶4 000)4℃過夜，Tween-20-Tris PBS(PBST)洗3次，每次10 min，二抗(1∶4 000)室溫孵育1 h，PBST洗2遍，PBS洗1遍，加入ECL發(fā)光液進行曝光顯影。

1.8實時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)檢測結(jié)腸組織miR-21的表達 采集新鮮的結(jié)腸組織30 mg，按照動物組織miRNA提取試劑盒說明書中的步驟，將小鼠結(jié)腸組織經(jīng)液氮冰凍后磨碎勻漿，從中提取出總RNA。使用羅氏cDNA第一鏈合成試劑盒合成20 μl體系，其中包括模板-引物混合物13 μl、5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4 μl、RNA水解酶抑制劑0.5 μl、脫氧核苷酸混合物(dNTP)2 μl、逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 μl。反應(yīng)條件為25℃下10 min，55℃條件下孵育30 min，加熱至85℃維持5 min，將反應(yīng)管置于冰上終止反應(yīng)，得到cDNA。

實時PCR檢測miR-21的表達，應(yīng)用熒光定量PCR試劑盒合成50 μl體系，其中包括含cDNA模板5 μl、含20 mmol/L MgCl2的反應(yīng)緩沖液(10×)5 μl、PCR核苷酸混合物1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl。引物序列，miR-21a-5p上游：5′-CGCGCGTAGCTTATCAGACTGA-3′、下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6 上游：5′-CTCGCTCGGCAGCACA-3′、下游：5′-AACGCTCACGAATTGCGT-3′。DNA聚合酶0.4 μl、水 36.6 μl。U6為內(nèi)參，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5 min，然后94℃ 10 s、50℃ 20 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)，72℃ 7 min、4℃冷卻。采用2-ΔΔCT表示miR-21的相對水平。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進行正態(tài)分布計量數(shù)據(jù)單因素方差及LSD法檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組DAI評分比較 移植組、PBS組、Control組DAI評分分別為(3.83±0.92)、(8.18±1.29)、0分，3組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=112.124，P=0.000 0)。與Control組相比，PBS組、移植組DAI評分明顯升高(均P=0.000 0)。移植組DPI評分較PBS組明顯降低(P=0.000 0)。

2.2各組組織中miR-21、TNF-α水平 Control組、PBS組和移植組miR-21、TNF-α水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000 0)。PBS組miR-21、TNF-α表達顯著高于Control組(P=0.000 0)，且移植組miR-21、TNF-α表達顯著低于PBS組(P=0.000 2)。見表2、圖1。

表2 3組組織miR-21、TNF-α相對表達量

與Control組相比:1)P<0.001;與PBS相比:2)P<0.001

圖1 3組結(jié)腸組織中TNF-α的表達

3 討 論

BM-MNCs是骨髓中一種具有多種潛能的成體干細胞，其中包括造血干細胞，骨髓間充質(zhì)干細胞和內(nèi)皮祖細胞〔3〕。BM-MNCs具有向多種細胞分化的能力，如內(nèi)胚層、中胚層及神經(jīng)外胚層來源細胞，還可以在適當(dāng)?shù)臈l件下分化為軟骨、骨骼肌細胞、心肌細胞、脂肪、神經(jīng)細胞等〔4〕。BM-MNCs還可以通過細胞間的相互作用產(chǎn)生細胞因子，從而調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)〔5〕。研究證明，BM-MNCs可以通過血液循環(huán)定植于腸道組織中，被標(biāo)記的BM-MNCs成功移植到UC小鼠模型后，可以分布在腸道黏膜層，并通過調(diào)節(jié)腸道免疫、修復(fù)腸道黏膜、改善胃腸動力等方式來治療UC〔6,7〕。

UC是一種發(fā)生在腸道的慢性非特異性炎性疾病，病程長，常在加重與緩解中反復(fù)發(fā)作、遷延不愈，病情較兇險，嚴重時可威脅患者的生命〔8〕。UC的發(fā)病機制至今仍未明確，目前普遍認為與遺傳、環(huán)境、免疫、腸道菌群有關(guān)〔9〕，特別是免疫越來越受到大家的重視，主要表現(xiàn)為促炎因子與抑炎因子的調(diào)節(jié)失衡。多項研究證明，炎癥因子與UC發(fā)病關(guān)系密切〔10〕。TNF-α是一種重要的促炎癥細胞因子，它主要由單核巨噬細胞、T細胞和B細胞分泌，TNF-α可以激活上皮細胞，誘導(dǎo)趨化因子，聚集中性粒細胞，放大炎癥效應(yīng)，導(dǎo)致腸黏膜組織損傷。大量實驗證明，TNF-α的表達水平與UC嚴重程度呈正相關(guān)〔11〕。微小RNA(miRNA)是一類有19～24個核苷酸組成的短小非編碼RNA，可以通過其表達水平的上調(diào)或下調(diào)，在轉(zhuǎn)錄后抑制或降解不同靶 mRNA 的表達繼而引起下游相應(yīng)靶點基因的改變，從而影響組織和細胞的功能。miR-21是哺乳動物的眾多細胞類型中表達水平最高的非編碼RNA，既往關(guān)于miR-21的研究多集中在腫瘤方向，miR-21可以下調(diào)抑癌基因的表達從而具有促癌作用。近年來，Svrcek等〔12〕發(fā)現(xiàn)miR-21在炎癥性腸病(IBD)患者腸黏膜組織中呈高表達，并且通過抑制巨噬細胞甘露糖受體發(fā)揮作用。研究表明，在UC中，miR-21上調(diào)可以導(dǎo)致Rho-mRNA降解從而使腸上皮通透性增加，損壞腸黏膜屏障，加重炎癥反應(yīng)，參與UC的發(fā)病過程〔13,14〕。miR-21與UC的炎癥反應(yīng)呈正相關(guān)，并可以作為評估UC炎癥反應(yīng)程度的重要指標(biāo)。

本研究提示BM-MNCs移植治療可以改善小鼠的一般狀態(tài)、減輕腸道炎癥反應(yīng)，對UC起到一定的治療作用。TNF-α、miR-21的表達水平與UC的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性。BM-MNCs移植治療能通過降低TNF-α、miR-21的表達水平而發(fā)揮治療作用。