異甘草素通過降低ROS產(chǎn)生抑制順鉑誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞衰老

刁會 王麗 譚睿陟 李健春 樊均明，3

(西南醫(yī)科大學(xué) 1附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，四川 瀘州 646000；2附屬中醫(yī)醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合研究中心；3成都醫(yī)學(xué)院)

隨著人口老齡化社會的到來，衰老和抗衰老研究已成為醫(yī)學(xué)界的一大熱點(diǎn)。目前衰老相關(guān)理論或?qū)W說包括氧化應(yīng)激、遺傳基因、線粒體DNA損傷、自由基、自身免疫、神經(jīng)內(nèi)分泌、體細(xì)胞突變、中醫(yī)腎虛等學(xué)說。在中醫(yī)理論中，腎中精氣虧虛是衰老發(fā)生的根本機(jī)制之一,腎陰、腎陽的盛衰可直接、間接影響人的壽命和生命質(zhì)量，故腎臟是衰老最重要的影響因素。順鉑(Cis)作為廣泛用于臨床治療腫瘤(肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌等)的化療藥物〔1〕，其作用機(jī)制是與DNA結(jié)合，引起交叉聯(lián)結(jié)，破壞DNA的功能，從而影響細(xì)胞的有絲分裂，因此Cis的使用過程中不可避免的也會產(chǎn)生一些副作用，包括引起急性腎損傷等腎毒性不良反應(yīng)〔2〕。而Cis所致的腎損傷，目前除了腎臟替代治療和水合療法有一定的療效外，尚缺乏更為有效的治療手段。Cis及其代謝產(chǎn)物可能會通過腎小管上皮細(xì)胞外的離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道被吸收〔3〕，毒物的重吸收使腎小管上皮細(xì)胞遭受到有害刺激，從而產(chǎn)生大量活性氧(ROS)，使機(jī)體氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡被破壞，氧化應(yīng)激形成，而氧化應(yīng)激又是導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷乃至衰老的關(guān)鍵因素〔4〕。因此，加強(qiáng)對Cis誘導(dǎo)的腎臟細(xì)胞衰老和氧化應(yīng)激對防治腎臟損傷具有重要臨床意義。 異甘草素(Iso)為甘草中的異黃酮類化合物，已有研究表明其具有較為廣泛的藥理活性〔5〕，本研究擬分析Iso對Cis及其代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)大鼠腎小管上皮細(xì)胞NRK-52E衰老的作用及其相關(guān)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1材料 NRK-52E細(xì)胞購自ATCC;胎牛血清(FBS) 購自Gemini公司；Cis購自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科；Iso購自普瑞法公司〔高效液相色譜法純度>95 %〕； CCK-8試劑盒購自Promega公司；4,6-二氨基-2-苯基吲哚 (DAPI) 染料購自Vector公司；二氯二氫熒光素-二乙酸酯 (DCFH-DA) ROS檢測試劑盒、異硫氰酸熒光素標(biāo)記的膜聯(lián)素Ⅴ/碘化丙啶 (AnnexinⅤ-FITC/PI) 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞衰老β半乳糖苷酶染色試劑盒購自碧云天生物科技公司；實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)試劑盒購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；過氧化氫(H2O2)購自西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥房。

1.2NRK-52E細(xì)胞培養(yǎng)和實(shí)驗(yàn)分組 NRK-52E細(xì)胞用含10%FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2環(huán)境，細(xì)胞匯合度達(dá)到90%～95%并處于對數(shù)生長期時,采用0.25%胰蛋白酶〔含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化傳代備用。根據(jù)CCK-8法檢測細(xì)胞活性結(jié)果,將細(xì)胞分為NC組，4 μmol/L Cis組，5、10、15 μmol/L Iso組，Cis+H2O2組，Cis+10 μmol/L Iso+0.02% H2O2組。

1.3CCK-8法檢測NRK-52E細(xì)胞活性 NRK-52E細(xì)胞以5×104個/孔接種于96孔板,每組設(shè)5個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后,分別予以0、2、4、8、16 μmol/L Cis和0、5、10、15、20、25 μmol/L Iso刺激細(xì)胞48 h及0.000%、0.002%、0.005%、0.010%、0.020%、0.050%、0.100%、0.200%、0.500% H2O2刺激細(xì)胞30 min；吸出培養(yǎng)基,加入含100 ml/L CCK-8培養(yǎng)基,每孔100 μl,繼續(xù)培養(yǎng)3 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔吸光度 (A450) 值,根據(jù)結(jié)果計(jì)算Iso安全劑量范圍、Cis有效毒性劑量范圍及H2O2毒性劑量范圍。

1.4衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色 在6孔板中,每孔接種5×104個細(xì)胞。培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁后,給予處理,分為NC組，Cis組、5、10、15 μmol/L Iso處理細(xì)胞1 h后換液,再予以Cis聯(lián)合Iso刺激細(xì)胞為Cis+Iso 5 μmol/L組、Cis+Iso 10 μmol/L組、Cis+Iso 15 μmol/L組。48 h后棄去培養(yǎng)基,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗一次,加入1 ml β半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，吸除細(xì)胞固定液，用PBS或HBSS洗滌細(xì)胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 ml染色工作液(按說明書配制)。37℃孵育過夜(不能在CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行)，用保鮮膜封住6孔板防止蒸發(fā)。去除染色工作液，加入2 ml PBS，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.5即時聚合酶鏈鎖反應(yīng)檢測衰老相關(guān)分泌表型 引物由上海生物工程有限公司合成，GAPDH上游引物5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′,下游引物:5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′;轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1上游引物:5′-GCGATCTAACCTGTTGCCTG-3′,下游引物：5′-AGCCATGGAGTAGACATCCG-3′；IL-1β上游引物:5′-TTCAAATCTCACAGCAGCAT-3′，下游引物:5′-AGGTCGTCATCATCCCAC-3′；IL-6上游引物:5′-AAAGAGTTGTGCAATGGCAATTCT-3′，下游引物：5′-AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA-3′ ；腫瘤壞死因子(TNF)-α上游引物:5′-GGAAAGCATGATCCGAGAT-3′,下游引物:5′-GTAGACAGAAGAGCGTGGTG-3′。5×104個細(xì)胞接種于6孔板中。處理方法及培養(yǎng)時間同上。48 h后棄去培養(yǎng)基，PBS清洗一次，按照總 RNA試劑盒說明書提取細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，并按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時PCR，反應(yīng)條件:95℃ 2 min，40 個循環(huán)；95℃ 15 s；60℃ 1 min。以GAPDH內(nèi)參進(jìn)行校正后，比較循環(huán)閾值(CT) 的方法對靶基因IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)水進(jìn)行相對定量分析。

1.6ELISA檢測衰老相關(guān)分泌表型 6孔板每孔接種5×104個NRK-52E細(xì)胞，處理方法及培養(yǎng)時間同上。48 h后,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測IL-1β、IL-6，最后在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm處測量各孔的吸光度 (A450)值。

1.7AnnexinⅤ-FITC/PI雙染色結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測NRK-52E細(xì)胞凋亡 6孔板每孔接種5×104個NRK-52E細(xì)胞,處理方法及培養(yǎng)時間同上。分別收集每孔細(xì)胞培養(yǎng)液,加入(不含EDTA)的胰蛋白酶消化細(xì)胞,用相應(yīng)的培養(yǎng)液終止消化；收集細(xì)胞懸液離心,棄上清；PBS重懸細(xì)胞,再次離心,用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，并取100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl AnnexinⅤ-FITC混勻后于室溫避光封閉5 min,后加入10 μl PI,并加40 μl PBS調(diào)整每管細(xì)胞體積為500 μl,立刻進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.8DCFH-DA染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞內(nèi)ROS水平 接種6孔板,每孔接種5×104個NRK-52E細(xì)胞，處理方法及培養(yǎng)時間同上。用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA (1∶8 000),棄孔內(nèi)培養(yǎng)基,PBS清洗1次；每孔加入約1 ml已稀釋的DCFH-DA,轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)30 min；PBS洗滌細(xì)胞2次后,胰蛋白酶消化收集細(xì)胞。500 μl無血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，過濾去除細(xì)胞團(tuán),流式細(xì)胞術(shù)采集數(shù)據(jù)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0、Graphpad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析 (One-way ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1Cis誘導(dǎo)法建立NRK-52E細(xì)胞衰老模型 Cis能顯著升高TGF-β1、TNF-α表達(dá)；不同濃度Cis造模，可引起腎小管上皮細(xì)胞產(chǎn)生衰老現(xiàn)象，以8 μmol/L以上Cis濃度可引起細(xì)胞形態(tài)的明顯變化；綜合以上結(jié)果，選擇4 μmol/L Cis為最佳有效實(shí)驗(yàn)濃度。見圖1，表1。

2.2Iso對Cis誘導(dǎo)NRK-5E細(xì)胞衰老的影響 CCK8法結(jié)果顯示低于15 μmol/L的Iso無明顯影響,15 μmol/L及以上濃度對細(xì)胞活性有顯著抑制作用(P<0.01)，其中NC組細(xì)胞活性為0.64±0.02，5 μmol/L Iso組為0.65±0.03，10 μmol/L Iso組為0.66±0.02，15 μmol/L Iso組為0.66±0.01，20 μmol/L Iso組為0.59±0.02，25 μmol/L Iso組為0.52±0.02。光學(xué)顯微鏡顯示，與NC組比較，4 μmol/L Cis組細(xì)胞內(nèi)有大量的細(xì)胞被染為深藍(lán)色，部分細(xì)胞胞體萎縮或變大、漂浮；與4 μmol/L Cis組比較，Iso各劑量組細(xì)胞內(nèi)被半乳糖苷酶染成藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量明顯減少，以10 μmol/L Iso尤為顯著。見圖2。

圖1 不同Cis濃度處理下衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶酶染色(×100)

表1 各組TGF-β1、TNF-α比較

與NC組比較：1)P<0.05

2.3Iso對Cis誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型的影響 實(shí)時PCR結(jié)果顯示，與NC組相比，Cis組IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；Iso各劑量組與Cis組相比均顯著降低(P<0.05)。ELISA結(jié)果顯示，與NC組相比，Cis組IL-1β、IL-6表達(dá)顯著升高(P<0.05)；Iso各劑量組與Cis組相比，IL-1β、IL-6表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表2。

圖2 衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色檢測各組細(xì)胞衰老情況(×100)

組別TGF-β mRNATNF-α mRNAIL-6 mRNAIL-1β mRNAIL-6IL-1βNC組0.004 000±0.002 4000.000 310±0.000 0400.000 013±0.000 0020.003 230±0.000 3302.550 0±0.420 325.600±3.050Cis組0.010 600±0.002 5002)0.000 530±0.000 0302)0.000 099±0.000 0282)0.005 050±0.000 5202)6.475 0±0.411 32)59.000±6.1242)Cis+Iso 5 μmol/L組0.006 400±0.001 5001)0.000 420±0.000 0401)0.000 066±0.000 0041)0.004 230±0.000 3601)5.825 0±0.250 01)56.400±4.9301)Cis+Iso 10 μmol/L組0.005 200±0.000 8001)0.000 340±0.000 0401)0.000 060±0.000 0081)0.003 680±0.000 2801)4.750 0±0.208 21)47.200±3.1141)Cis+Iso 15 μmol/L組0.007 100±0.000 8001)0.000 410±0.000 0301)0.000 077±0.000 0111)0.004 150±0.000 2901)4.625 0±0.340 31)50.200±3.9621)F/P值6.216/0.00923.63/0.00014.74/0.00013.94/0.00078.78/0.00045.23/0.000

與Cis組比較：1)P<0.05;與NC組比較：2)P<0.05

2.4Iso有效抑制Cis誘導(dǎo)的NRK-52E凋亡 流式細(xì)胞術(shù)檢測Cis誘導(dǎo)后腎小管上皮細(xì)胞48 h后的凋亡情況，與NC組(12%)相比，Cis組凋亡(61%)明顯增多(P<0.01)；與Cis組相比，Cis+Iso 5 μmol/L、Cis+Iso 10 μmol/L、Cis+Iso 15 μmol/L組細(xì)胞凋亡(25%、23%、33%)明顯減少(P<0.01)。見圖3。

2.5Iso抑制Cis誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高 CCK-8法結(jié)果顯示0.02%濃度以上的 H2O2處理NRK-52E細(xì)胞30 min后對細(xì)胞活性有明顯抑制作用；流式檢測ROS水平的結(jié)果顯示，與NC組相比,Cis組產(chǎn)生ROS的細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.01)；與Cis組相比,Cis+Iso 10 μmol/L組ROS水平顯著降低；加入H2O2后的各組均較未加入前明顯增加(P<0.01)；但Cis+H2O2+Iso 10 μmol/L組ROS表達(dá)水平顯著低于Cis+H2O2組(P<0.01)。見圖4，圖5。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡

黑色箭頭指示藍(lán)色深染衰老細(xì)胞圖4 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色檢測各組細(xì)胞衰老情況(×100)

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組ROS變化

3 討 論

Cis是一種治療惡性腫瘤的重要抗癌藥物，但具有毒性副作用，如耳毒性、腎毒性和神經(jīng)毒性。盡管進(jìn)行預(yù)防性水合療法，但仍有約30%的CP患者會出現(xiàn)腎毒性〔6〕。既往研究表明〔7〕，ROS的產(chǎn)生參與了Cis誘導(dǎo)的腎毒性發(fā)展。ROS可誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子如TNF-α及其他氧化介質(zhì)的產(chǎn)生。這些炎癥和氧化介質(zhì)導(dǎo)致腎小管細(xì)胞和腎組織損傷。研究發(fā)現(xiàn)〔8〕，腎小球、腎小管，特別是近曲小管和集合管是Cis腎損傷的主要靶位，而其發(fā)病機(jī)制與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系。Cis通過腎小管上皮細(xì)胞的重吸收進(jìn)入細(xì)胞后可破壞線粒體結(jié)構(gòu)，使ROS產(chǎn)生增加。而大量的ROS可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)鈣離子向胞質(zhì)釋放，引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。由此可見，氧化應(yīng)激在Cis誘導(dǎo)的細(xì)胞衰老中起重要作用，與其他途徑互為因果關(guān)系，共同加速細(xì)胞衰老甚至凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)Cis對NRK-52E細(xì)胞刺激48 h 后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯增加，并用衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色等一系列實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞衰老現(xiàn)象的出現(xiàn)，證明建模成功。

Iso為甘草中的異黃酮類化合物，已有研究表明Iso具有較為廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎及對心臟和腦的保護(hù)等作用〔9〕。Zhao等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)Iso可通過抑制M2巨噬細(xì)胞極化而有效防治大腸桿菌相關(guān)腫瘤的發(fā)生。Denzer等〔11〕證明在氧化和亞硝化應(yīng)激細(xì)胞模型中，Iso能改善線粒體功能。任歡歡等〔12〕通過Iso預(yù)處理可以逆轉(zhuǎn)I/R誘導(dǎo)的損傷效應(yīng)，減輕I/R心肌損傷，作用機(jī)制可能與其抗氧化、抗炎和抗凋亡作用相關(guān)。而Cis誘導(dǎo)的腎小管上皮衰老細(xì)胞通過自分泌和旁分泌途徑分泌大量促炎因子、趨化因子、生長因子和蛋白酶等，影響臨近細(xì)胞和組織的微環(huán)境，加速衰老，衰老細(xì)胞的這一特征被定義為衰老相關(guān)分泌表型(SASP)，常見的SASP有：IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、TGF-β等。Zhang等〔13〕研究證明Iso能抑制IL-1β誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，Chen等〔14〕研究表明Iso通過阻斷IL-6信號傳導(dǎo)抑制多發(fā)性骨髓瘤的生長，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)Iso能降低細(xì)胞衰老相關(guān)表型，減緩細(xì)胞衰老，與既往不同疾病中的研究結(jié)果相似，但關(guān)于Iso對Cis誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞凋亡前衰老過程的影響研究甚少。Patricia Moreno-Londoo等〔15〕研究表明Iso預(yù)處理可減輕Cis誘導(dǎo)的近端小管細(xì)胞的死亡，增強(qiáng)Cis膀胱癌T24細(xì)胞株的毒性。本研究結(jié)果顯示，Iso能有效抑制Cis誘導(dǎo)的 NRK-52E 細(xì)胞衰老，提高細(xì)胞存活率，其機(jī)制可能與抑制ROS產(chǎn)生有關(guān)。在細(xì)胞氧化應(yīng)激研究中，Wang等〔16〕發(fā)現(xiàn)通過增加H2O2，可刺激ROS的表達(dá)，而Vashistha等〔17〕證實(shí)在HG培養(yǎng)基中ROS代謝顯著增加，與通過細(xì)胞凋亡和獲得衰老表型的細(xì)胞死亡增加有關(guān)。本研究結(jié)果提示Iso可通過降低ROS的產(chǎn)生抑制Cis誘導(dǎo)的大鼠NRK-52E細(xì)胞衰老。

綜上，Iso可能通過降低 NRK-52E 細(xì)胞內(nèi)ROS 水平，減少衰老相關(guān)表型的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞衰老。由此推測，在臨床上，對于Cis化療的腫瘤患者，適當(dāng)加用Iso治療，不僅增強(qiáng)Cis抗腫瘤作用，還能緩解Cis引起的腎臟衰老。