黃單胞桿菌胞外多糖對核桃生理代謝的影響1)

王麗 毛鑫 譙天敏 朱天輝 李姝江

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，溫江，611130)

核桃(Juglansregia)主要分布在東亞、中亞、西亞、南亞、歐洲和美國等地[1]，是世界重要的油料樹種。我國核桃種植資源豐富，種植范圍極廣，黑龍江、遼寧、湖北、陜西、云南、四川等22省市均有分布，其主要產(chǎn)區(qū)在四川、云南、陜西等省。核桃含豐富的不飽和脂肪酸及鋅、鉀、鐵、維生素、泛酸等營養(yǎng)物質(zhì)，具有溫肺定喘、潤腸通便的功效[2-3]。隨著核桃種植面積的增加，核桃病蟲害的發(fā)生越來越頻繁[4-5]。經(jīng)研究報(bào)道顯示，在河北、山東、山西、遼寧、河南、江蘇、浙江、四川、云南、山西、甘肅等省核桃產(chǎn)區(qū)核桃病蟲害發(fā)病嚴(yán)重[6-7]。核桃黑斑病是核桃生產(chǎn)中的主要病害之一，對核桃的葉、芽、枝和果實(shí)都有一定的危害[8]。目前，對核桃黑斑病的研究主要集中在病原菌分離、發(fā)生特點(diǎn)、防治措施等方面[4-6]，對核桃黃單胞桿菌(Xanthomonascampestris)胞外多糖致病性的研究較少，因而關(guān)于致病細(xì)菌胞外多糖對核桃黑斑病有何作用是值得探索和研究的一個(gè)問題。本研究利用分離鑒定出的核桃黃單胞桿菌為試驗(yàn)菌株，進(jìn)行胞外多糖的提取。將提取出的粗多糖配制成不同質(zhì)量濃度，分別作用于健康和感病的核桃植株上，觀察其發(fā)病規(guī)律，測定其對核桃生理代謝的影響，從而確定胞外多糖對核桃黑斑病的影響，探究其致病機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

核桃黑斑病病原菌黃單胞桿菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)林木病理實(shí)驗(yàn)室分離并保存。菌株活化及振蕩培養(yǎng)采用NA固體培養(yǎng)基(蛋白胨5～10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 L，pH調(diào)到7.0)及NA液體培養(yǎng)基(蛋白胨5～10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蒸餾水1 L，pH調(diào)到7.0)。胞外粗多糖制備采用發(fā)酵培養(yǎng)基(玉米粉40.00 g，蛋白胨2.00 g，碳酸鈣3.00 g，磷酸氫二鉀5.00 g，硫酸鎂0.50 g，硫酸亞鐵0.25 g，檸檬酸0.25 g，蒸餾水定容至1 L，pH調(diào)節(jié)至7.0)。

1.2 胞外粗多糖的制備

將黃單胞桿菌接種于NA平板上活化12 h，挑取單菌落接種至裝有50 mL NA培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、200 r·min-1振蕩培養(yǎng)36 h，收集菌液按體積分?jǐn)?shù)1%比例接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，相同條件下培養(yǎng)72 h。收集發(fā)酵液，10 000 r·min-1離心15 min，取上清液加入3倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，4 ℃靜置12 h，低溫冷凍離心，收集沉淀，干燥后再次溶解于蒸餾水中，加入1/4體積的Sevag試劑，混合后劇烈震蕩20 min，分層除去下層有機(jī)相，上層液體，10 000 r·min-1離心15 min，除去變性蛋白質(zhì)，脫蛋白重復(fù)2～3次，在無蛋白沉淀溶液中加入超過2倍體積的體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，靜置4 h后，傾倒部分上清液，余下混合液于10 000 r·min-1離心15 min，棄上清液，收集多糖沉淀，烘干備用。

1.3 胞外粗多糖致病性檢測

采用針刺法，取生長良好、健康的核桃葉片，消毒處理后分別噴施1.5、3.0、5.0 g·L-1的胞外粗多糖溶液于葉片表面，每2 h噴施1次，共3次，以清水處理作為空白對照，每處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。處理葉片置于培養(yǎng)皿中，保濕培養(yǎng)3 d，觀察并記錄葉片的發(fā)病癥狀。

1.4 胞外粗多糖處理后核桃葉片生理指標(biāo)測定

采用盆栽試驗(yàn)，用蒸餾水配制質(zhì)量濃度為0.5、1.5、3.0、5.0 g·L-1的胞外多糖溶液，分別對長勢相同的核桃苗進(jìn)行噴施，并以清水作為對照(CK1)。每個(gè)質(zhì)量濃度處理5株核桃苗，重復(fù)3次。同時(shí)，選取2組生長基本保持一致的核桃植株分別接種黃單胞桿菌。接種24 h后，處理組分別噴施質(zhì)量濃度為0.5、1.5、3.0、5.0 g·L-1的胞外多糖溶液，另一組作為空白對照(CK2)。噴施胞外多糖溶液后0、1、3、5、7 d分別采集核桃葉片測定相關(guān)生理指標(biāo)，每個(gè)指標(biāo)重復(fù)3次。電導(dǎo)率測定使用DDS-11A型直讀式電導(dǎo)儀：相對電導(dǎo)率=處理電導(dǎo)率/煮沸電導(dǎo)率×100%；丙二醛(MDA)質(zhì)量摩爾濃度測定采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法；游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定采用茚三酮顯色法；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍(lán)四唑(NBT)光還原法；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚氧化法[9]。

1.5 數(shù)據(jù)分析與處理

應(yīng)用Excel 2010和SPSS 20.0分析處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并制圖。采用單因素方差分析和最小顯著性差異(LSD)分析各組數(shù)據(jù)的差異性。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外粗多糖的致病性

培養(yǎng)3 d后，對照組的核桃葉片生長良好，噴施不同質(zhì)量濃度胞外多糖的核桃葉片，出現(xiàn)病斑、萎焉癥狀。胞外多糖質(zhì)量濃度為0.5 g·L-1時(shí)，核桃葉片表面出現(xiàn)零星病斑，隨著處理質(zhì)量濃度的增加，葉片表面的病斑開始擴(kuò)大且蔓延。當(dāng)質(zhì)量濃度為5.0 g·L-1時(shí)，病斑面積覆蓋整個(gè)葉片的80%左右，葉片出現(xiàn)枯黃萎焉等癥狀(圖1)?？梢姡瑢舛嗵亲饔糜诤颂胰~片，會(huì)使葉片表現(xiàn)相應(yīng)癥狀，隨著質(zhì)量濃度的增加，其癥狀也呈現(xiàn)加重趨勢。

2.2 胞外粗多糖對核桃葉片細(xì)胞膜透性的影響

由表1可見，處理后3～7 d，健康植株和感病植株各處理組葉片細(xì)胞的電導(dǎo)率隨處理質(zhì)量濃度增加而增高，不同質(zhì)量濃度梯度的電導(dǎo)率也隨著處理時(shí)間的增加而呈上升趨勢，并顯著高于對照組(CK1)，表現(xiàn)出葉片細(xì)胞電導(dǎo)率同處理時(shí)間、處理質(zhì)量濃度呈正相關(guān)關(guān)系，表明噴施胞外多糖會(huì)對核桃葉片細(xì)胞的膜系統(tǒng)造成損傷。相比于健康植株處理組，感病植株在同一處理水平的電導(dǎo)率更高，細(xì)胞膜受損傷程度更大，對照組(CK2)的電導(dǎo)率也有一定程度的提高，但這是由于細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外水勢差異的影響造成的，與其他質(zhì)量濃度處理組相比上升幅度不大。

2.3 胞外粗多糖對核桃葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

由表2可見，用胞外多糖溶液處理健康核桃和感病核桃后，葉片中MDA質(zhì)量摩爾濃度均明顯高于對照，表明胞外多糖溶液處理的核桃細(xì)胞膜脂過氧化水平和膜損傷程度較高。相同處理時(shí)間，MDA質(zhì)量摩爾濃度隨處理質(zhì)量濃度增加而升高。在處理前5 d內(nèi)，隨處理時(shí)間延長，MDA質(zhì)量摩爾濃度增加，二者呈正相關(guān)關(guān)系，到第7天，其質(zhì)量摩爾濃度較第5天有所下降，但仍顯著高于對照組。健康核桃和感病核桃的MDA質(zhì)量摩爾濃度均在5.0 g·L-1處理5 d時(shí)最高，但感病核桃葉片MDA質(zhì)量摩爾濃度高于健康核桃且上升更快。

表1 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細(xì)胞電導(dǎo)率的影響

處理時(shí)間/d接種后葉片細(xì)胞電導(dǎo)率/%CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(10.15±0.36)a(10.27±0.86)a(9.85±0.96)a(10.65±0.62)a(10.52±0.58)a1(12.93±0.24)b(14.55±0.77)b(15.09±0.60)b(16.85±0.85)ab(18.27±1.22)a3(24.57±0.88)e(30.75±1.15)d(36.74±0.93)c(40.96±1.02)b(44.75±1.10)a5(30.91±1.08)e(38.67±0.72)d(45.52±0.80)c(49.39±1.20)b(55.97±0.97)a7(34.07±0.89)d(45.62±0.82)c(52.97±2.03)b(57.82±1.44)b(65.45±3.55)a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示不同時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。

表2 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細(xì)胞MDA質(zhì)量摩爾濃度的影響

處理時(shí)間/d接種后葉片細(xì)胞MDA質(zhì)量摩爾濃度/μmol·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(0.013±0.002)a(0.014±0.001)a(0.015±0.001)a(0.014±0.003)a(0.015±0.002)a1(0.018±0.003)a(0.022±0.002)a(0.021±0.002)a(0.022±0.002)a(0.023±0.002)a3(0.024±0.002)c(0.032±0.002)b(0.041±0.003)a(0.045±0.002)a(0.047±0.002)a5(0.035±0.002)c(0.047±0.002)b(0.053±0.002)b(0.059±0.004)ab(0.063±0.002)a7(0.041±0.003)c(0.045±0.004)bc(0.049±0.001)b(0.056±0.002)ab(0.058±0.002)a

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示不同時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。

2.4 胞外粗多糖對核桃葉片游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由表3可見，不同質(zhì)量濃度胞外多糖溶液處理核桃葉片后，各組游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈上升趨勢，且均高于對照。同一水平上，在0.5～3.0 g·L-1時(shí)，游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨胞外粗多糖質(zhì)量濃度上升而增加，兩處理組均在質(zhì)量濃度為3.0 g·L-1、處理7 d時(shí)，葉片細(xì)胞脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到峰值，感病核桃高于健康核桃。當(dāng)質(zhì)量濃度提高到5.0 g·L-1時(shí)，兩處理組游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)開始下降，這說明在核桃可以忍受的胞外多糖質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)有一定程度的增加，但超過了這個(gè)質(zhì)量濃度范圍，由于細(xì)胞器溶解等生理生化反應(yīng)，核桃可能失去原有的組織功能，導(dǎo)致游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)急劇下降。

2.5 胞外粗多糖對核桃葉片SOD酶活性的影響

由表4可見，不同質(zhì)量濃度胞外多糖溶液處理后，核桃葉片中的SOD活性較對照顯著上升，處理0～5 d，活性隨處理時(shí)間增加而升高，第5天后開始下降。不同質(zhì)量濃度的胞外多糖溶液與對照組相比，SOD活性差異顯著。同一時(shí)間段，在質(zhì)量濃度為0.5～3.0 g·L-1時(shí)，SOD活性隨胞外粗多糖質(zhì)量濃度上升而增加，質(zhì)量濃度為3.0 g·L-1、處理5 d時(shí)，2個(gè)處理組細(xì)胞中SOD活性達(dá)最大值，分別為457.13、507.18 U·g-1，較相同處理時(shí)間內(nèi)對照組高103.07%、38.05%。當(dāng)胞外多糖溶液質(zhì)量濃度增加到5.0 g·L-1時(shí)，SOD活性逐漸降低，表明核桃葉片中的SOD活性和抗病性隨病害嚴(yán)重程度的增加而增加，但當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度過高時(shí)，SOD酶系統(tǒng)失去功能，會(huì)使酶損傷，導(dǎo)致其活性降低。

2.6 胞外粗多糖對核桃葉片POD酶活性的影響

由表5可知，不同質(zhì)量濃度胞外粗多糖處理下，各處理組細(xì)胞內(nèi)POD活性均顯著高于對照組。同一質(zhì)量濃度作用下，隨著處理時(shí)間的增加，POD活性呈先上升再下降的趨勢。相同處理時(shí)間內(nèi)，當(dāng)質(zhì)量濃度從0.5 g·L-1增加到3.0 g·L-1時(shí)，細(xì)胞內(nèi)POD活性隨著質(zhì)量濃度的增加而上升，但當(dāng)處理質(zhì)量濃度增加到5.0 g·L-1L時(shí)，POD活性開始下降。質(zhì)量濃度為3.0 g·L-1、處理5d時(shí)，葉片中POD活性達(dá)到峰值，分別為684.359、756.18 U·g-1，比對照組高217.26%、40.88%。這表明核桃葉片在發(fā)病過程中生理活動(dòng)旺盛，具有一定的抗性，但當(dāng)胞外多糖質(zhì)量濃度達(dá)到相應(yīng)閾值后，POD活性不再提高反而下降，說明植物的機(jī)體組織可能已經(jīng)遭到破壞。

表3 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細(xì)胞游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

處理時(shí)間/d接種后葉片細(xì)胞游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)/μg·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(38.517±0.73)a(38.917±0.94)a(38.956±0.20)a(39.072±0.80)a(39.437±1.28)a1(41.072±0.79)d(44.163±1.16)c(48.812±0.73)b(54.082±0.89)a(45.917±1.03)bc3(49.514±1.25)d(55.379±1.32)c(60.817±0.74)b(65.179±0.96)a(57.862±1.05)bc5(54.816±0.52)d(60.763±1.06)d(75.516±1.40)b(81.327±1.33)a(65.265±1.60)c7(65.356±0.37)d(72.516±0.77)c(83.916±0.43)b(89.056±1.13)a(72.316±1.12)c

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示不同時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。

表4 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細(xì)胞SOD活性的影響

處理時(shí)間/d接種后葉片細(xì)胞SOD活性/U·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(192.108±7.23)a(194.375±6.37)a(197.714±12.86)a(198.923±4.37)a(198.834±9.22)a1(230.572±10.25)a(237.654±6.48)a(240.953±7.63)a(242.075±4.10)a(244.919±7.72)a3(321.751±4.45)c(374.105±4.25)b(389.517±7.32)ab(400.172±5.05)a(380.246±5.16)b5(396.092±6.61)d(429.216±7.37)c(486.649±4.83)b(507.178±5.74)a(491.627±5.44)ab7(347.075±14.17)c(390.374±8.09)b(417.517±5.00)a(426.167±6.20)a(409.972±5.75)ab

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示不同時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。

表5 黃單胞桿菌胞外多糖對核桃葉片細(xì)胞POD活性的影響

處理時(shí)間/d接種后葉片細(xì)胞POD活性/U·g-1CK2胞外多糖0.5g·L-1胞外多糖1.5g·L-1胞外多糖3.0g·L-1胞外多糖5.0g·L-10(213.758±2.57)a(209.756±4.16)a(215.357±5.22)a(218.627±5.91)a(207.568±1.65)a1(309.857±2.93)b(317.654±5.69)b(336.859±3.64)a(348.516±3.85)a(339.862±3.87)a3(457.821±3.47)e(497.268±9.01)d(518.273±4.50)c(617.821±5.42)a(557.864±4.79)b5(536.743±3.61)d(619.743±4.46)c(665.382±3.82)b(756.175±5.94)a(676.168±4.80)b7(413.768±3.10)d(457.856±4.99)c(500.965±9.62)b(605.863±3.91)a(518.236±5.14)b

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，數(shù)據(jù)后同列不同小寫字母表示不同時(shí)間處理間差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論與討論

植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的胞外多糖屬于次級代謝產(chǎn)物，相關(guān)研究表明，胞外多糖是重要的致病因子，對病害的發(fā)生起著重要作用，可以對寄主的生理生化代謝、酶系統(tǒng)活性及核酸代謝等產(chǎn)生顯著地影響[10-13]。本研究用胞外多糖溶液分別處理健康和感病的核桃葉片，通過分析相關(guān)生理生化指標(biāo)，從而確定了其致病性。

本研究中，用胞外粗多糖溶液處理后，核桃葉片的細(xì)胞膜系統(tǒng)受損傷，導(dǎo)致透性改變、電解質(zhì)外滲、電導(dǎo)率增加，且細(xì)胞中MDA質(zhì)量摩爾濃度上升，這與張婷等[14]、李小琴等[15]的研究結(jié)果一致。此外，接種黑斑病的核桃葉片經(jīng)胞外多糖溶液處理后，其電導(dǎo)率及MDA質(zhì)量摩爾濃度增長較對照組更快，證明胞外多糖溶液加速了細(xì)胞電解質(zhì)外滲，提高了電導(dǎo)率，導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷加重。在逆境脅迫下，大多數(shù)植物均會(huì)積累大量的脯氨酸，以適應(yīng)在逆境條件下植物細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的變化，使植物具有一定的抗性和保護(hù)作用[16-18]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過胞外粗多糖溶液處理游離脯氨酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)上升，表明核桃葉片具有一定的抗脅迫能力。該結(jié)果同王勇等[19-21]研究結(jié)果一致。本研究所提取的黃單胞桿菌胞外粗多糖尚未純化為單一多糖，除單一多糖外還含有蛋白等成分。據(jù)前人研究結(jié)果推測粗多糖提取液中主要致病因子為多糖成分[22]，此推測有待進(jìn)一步分離純化胞外粗多糖成分后進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上，核桃黃單胞桿菌胞外多糖質(zhì)量濃度在一定程度上能夠影響核桃機(jī)體的正常生理指標(biāo)，從而揭示了胞外多糖具有致病性，這同李群良、陳小強(qiáng)等人的研究[32-33]相符。但其確切的致病因子及成分還有待研究和驗(yàn)證。