櫻柏酸對叔丁基過氧化氫誘導SH-SY5Y神經(jīng)細胞氧化應激損傷的保護作用*

鄢黎，何鄉(xiāng)，馬澤康，李沛波，蘇薇薇

(中山大學生命科學學院/廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510275)

近年來，人口老齡化日趨嚴重，與衰老密切相關(guān)的疾病如神經(jīng)退行性疾病已進入高發(fā)期[1]。這類疾病嚴重的影響人們的身心健康，也給家庭和社會帶來了沉重的負擔，已然是目前亟待解決的關(guān)鍵問題。神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機理錯綜復雜，其中衰老引發(fā)的氧化應激和自由基損傷是重要因素[2]。氧化應激是指機體系統(tǒng)細胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量增加，導致自由基失衡而引發(fā)細胞整體功能的退化和喪失[3]。自由基會對神經(jīng)細胞造成脂質(zhì)過氧化、生物膜損傷、核酸斷裂交聯(lián)損傷、蛋白質(zhì)損傷等一系列影響，誘發(fā)細胞損傷及凋亡[4]。因此，尋找具有抗氧化應激作用的藥物對于延緩衰老及相關(guān)疾病的防治具有重要的臨床意義。

大量研究表明天然藥物中存在多種具有抗氧化活性的物質(zhì)，包括二萜類、多酚類、維生素類等小分子化合物。這類化合物具有來源廣泛，療效顯著，毒副作用低，生物利用度高等諸多優(yōu)點[5]。本課題組前期從具有益智和神經(jīng)保護作用的傳統(tǒng)中藥柏子仁中分離出二萜類活性單體櫻柏酸(communic acid, COM)，研究發(fā)現(xiàn)其對TBHP誘導的SH-SY5Y 細胞氧化應激損傷具有保護作用，但作用機制不明[6]。本研究將系統(tǒng)研究櫻柏酸抗氧化應激的作用及機制，以期為櫻柏酸治療神經(jīng)退行性疾病提供相應的實驗依據(jù)和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人神經(jīng)瘤細胞母細胞SH-SY5Y(購自中國醫(yī)學科學院基礎科學研究所)；叔丁基過氧化氫(SIGMA-ALDRICH)；櫻柏酸(上海遠慕)；MTS試劑盒(Promega)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(碧云天，P0009)；乳酸脫氫酶檢測試劑盒(南京建成，A020-2)；超氧化物歧化酶測試盒(南京建成，A001-3)；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測試盒(南京建成，A005)；活性氧(ROS)測試盒(南京建成，E004)；細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒(碧云天，C0602)；人8-OHdG酶聯(lián)免疫試劑盒(武漢華美)。

1.2 實驗方法

1.2.1 SH-SY5Y細胞的培養(yǎng) 人神經(jīng)瘤細胞母細胞株SH-SY5Y培養(yǎng)w=10%胎牛血清和w=1%雙抗(青/鏈霉素)的DMEM/High Glucose培養(yǎng)基，37 ℃、含φ=5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中，常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2.2 叔丁基過氧化氫誘導SH-SY5Y細胞氧化應激損傷模型的建立 用含有不同濃度TBHP的培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)細胞，TBHP終濃度分別為20、40、80和160 μmol/L；MTS法檢測：SH-SY5Y細胞經(jīng)各濃度TBHP處理24 h后，每孔加入20 μL Celltiter 96?AQueous 工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，之后用酶標儀檢測490 nm處的吸光度(A490)；計算SH-SY5Y細胞存活率。

細胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%

式中，As：實驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基，TBHP)；Ac：對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基，不含TBHP)；Ab：空白孔(不含細胞和TBHP的培養(yǎng)基)。選擇細胞存活率約50%時濃度的TBHP處理SH-SY5Y細胞24h構(gòu)建氧化應激損傷模型。

1.2.3 染色檢測β-半乳糖苷酶 6孔板接種分組處理后，吸去細胞培養(yǎng)上清液，PBS緩沖液洗滌1次，每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，吸出固定液并用PBS緩沖液洗滌3次、每次3 min，吸去PBS緩沖液，每孔加入1 mL染色工作液，37 ℃避光封閉過夜，顯微鏡下計數(shù)β-半乳糖苷酶染色細胞比例。

1.2.4 LDH釋放檢測 6孔板接種分組處理后收集細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清待測；LDH試劑盒檢測：設定空白孔，加入25 μL雙蒸水；設定標準孔，加入5 μL雙蒸水和20 μL標準液；設定測定孔加入20 μL待測樣本和5 μL輔酶I；設定對照孔，加入5 μL雙蒸水和20 μL待測樣本。每孔加入25 μL基質(zhì)緩沖液，混勻后37 ℃溫育15 min，加入2,4-二硝基苯肼25 μL，混勻后37 ℃溫育15 min，加入250 μL 0.4 mol/L的 NaOH溶液，混勻后室溫放置5 min，用酶標儀檢測450 nm吸光度。

1.2.5 櫻柏酸對TBHP誘導SH-SY5Y細胞損傷的影響 用含櫻柏酸和80 μmol/L的TBHP培養(yǎng)基培養(yǎng)SH-SY5Y細胞24 h，櫻柏酸濃度分別為4、8、16 μmol/L，每組設6個復孔；每孔加入20 μL Celltiter 96?AQueous 工作液，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育1 h，之后用酶標儀檢測490 nm吸光度，計算SH-SY5Y細胞存活率。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 取對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，經(jīng)胰酶消化離心后用培養(yǎng)基重懸，顯微鏡下計數(shù)，以1×105/孔接種于6孔板，實驗分為6組：空白對照組、模型組(80 μmol/L TBHP)、低劑量組(4 μmol/L櫻柏酸+80 μmol/L TBHP)、中劑量組(8 μmol/L櫻柏酸+80 μmol/L TBHP)、高劑量組(16 μmol/L櫻柏酸+80 μmol/L TBHP)、陽性對照組(8 μmol/L白藜蘆醇+80 μmol/L TBHP)；細胞過夜貼壁后，進行相關(guān)處理，培養(yǎng)24 h后，收集細胞：吸去上清液，用胰酶消化并收集貼壁細胞，PBS洗滌細胞一次，重懸計數(shù)10萬細胞，1 500 r/min離心5 min；染色：加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，混勻，室溫下避光孵育15 min；流式細胞儀上機檢測：通過FITC通道(FL1)檢測Annexin V-FITC的綠色熒光，F(xiàn)L3通道檢測PI的紅色熒光。

1.2.7 流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平 6孔板接種分組處理后，培養(yǎng)24 h，收集細胞：吸去上清液，用胰酶消化并收集貼壁細胞，PBS洗滌細胞一次并重懸細胞；染色：每孔加入1 μL DCFH-DA，混勻，于37 ℃下避光孵育30 min；流式細胞儀上機檢測。

1.2.8 ELISA法檢測DNA損傷程度 分組處理后收集細胞培養(yǎng)上清液，3 000 r/min離心15 min，取上清待測；ELISA法檢測：室溫平衡試劑30 min，并用去離子水按1∶20比例稀釋濃洗滌液，設定空白對照孔不做處理；設定標準孔加50 μL標準品，每個濃度設立2孔；設定檢測孔加入50 μL待測樣品。除空白對照孔外，每孔加入酶結(jié)合底物50 μL，不干膠封片，于37 ℃孵育1 h，手工洗板3次，每孔加入50 μL顯色液A和50 μL顯色液B，混勻后避光顯色15 min。每孔加入50 μL終止液，用酶標儀檢測450 nm吸光度。

1.2.9 細胞內(nèi)SOD酶活力檢測 6孔板接種分組處理后，細胞裂解液裂解細胞，離心收集上清，用BCA法測定蛋白濃度。設定對照孔、空白對照孔、測定孔和測定空白孔，加入200 μL底物應用液，混勻后37 ℃孵育20 min，用酶標儀檢測450 nm吸光度。

1.2.10 細胞內(nèi)GSH-Px酶活力檢測 6孔板接種分組處理后，冰浴下用超聲波細胞破碎儀破碎細胞，離心收集上清，用BCA法測定蛋白濃度。設定對照管和測定管，加入試劑進行酶促反應，混勻后，3 500 r/min離心10 min，取1 mL上清液設定空白管、標準管、對照管和測定管作顯色反應，混勻后室溫靜置15 min，用酶標儀檢測412 nm吸光度。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準誤(mean±S.E.M)表示，采用SPSS16.0 分析軟件對結(jié)果進行統(tǒng)計處理，用單因素方差分析(one-way ANOVA)做多組比較及組間兩兩比較。經(jīng)方差齊性檢驗后，方差齊同采用Bonferroni 法，方差不齊用Tamhane’s 法，以檢驗各組間差異的顯著性。P<0.05 則認為存在顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 構(gòu)建TBHP誘導SH-SY5Y細胞氧化應激損傷模型

用40、80和160 μmol/L的TBHP作用于SH-SY5Y細胞24 h后，檢測細胞存活率，結(jié)果如圖1所示：與空白組相比，40、80、160 μmol/L TBHP均降低SH-SY5Y細胞存活率，且呈劑量依賴性，具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；其中80 μmol/L組損傷率約為50%，因此后續(xù)實驗以80 μmol/L的TBHP作用SH-SY5Y細胞24 h，作為構(gòu)建細胞氧化應激損傷模型的條件。

圖1 TBHP對SH-SY5Y細胞存活率的影響Fig.1 The influence of TBHP on cell viability of SH-SY5Y cells 與空白組相比:##P<0. 01 ## P<0.01 compared with control group, values represent means±S.E.M, n=4

2.2 櫻柏酸對TBHP損傷的SH-SY5Y細胞活力的影響

MTS法檢測細胞存活率，結(jié)果如圖2所示，與空白組相比，模型組細胞存活率降低，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.01)；與模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能提高TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激模型的細胞存活率，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。

圖2 櫻柏酸對TBHP所誘導SH-SY5Y 細胞氧化應激損傷的保護作用Fig.2 Protective effect of communic acid on oxidative stress injury of SH-SY5Y cell induced by TBHP 與空白組相比:##P<0. 01;與模型組相比：*P<0.05 ##P<0.01 compared with control group; *P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

2.3 櫻柏酸改善TBHP誘導SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞衰老

染色檢測細胞衰老，結(jié)果如圖3所示：與空白對照組相比，模型組衰老細胞比例和程度增加；和模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能降低TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激模型衰老細胞比例和衰老程度，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。

2.4 櫻柏酸減輕TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞膜的損傷

檢測各組細胞培養(yǎng)上清液LDH含量，結(jié)果如圖4所示：與空白對照組相比，模型組LDH含量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)；與模型組相比，櫻柏酸能減少TBHP誘導SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞LDH釋放，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。

2.5 櫻柏酸抑制TBHP誘導的SH-SY5Y細胞凋亡

通過Annexin V-FITC/PI染色后進行流式細胞儀檢測檢測細胞凋亡率，結(jié)果如圖5所示：與空白對照組相比，模型組晚期細胞凋亡率增高(P﹤0.01)；與模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能降低TBHP誘導的SH-SY5Y細胞晚期細胞凋亡率，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。

圖3 櫻柏酸改善TBHP誘導的SH-SY5Y細胞衰老Fig.3 Communic acid improves cell senescence in SH-SY5Y cells induced by TBHP(A)空白組；(B)模型組(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L櫻柏酸)；(D)中劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L櫻柏酸)；(E)高劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L櫻柏酸)；(F)陽性藥組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜蘆醇)；與空白組相比:##P<0. 01; 與模型組相比：*P<0.05(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F):positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES),##P<0.01 compared with control group;*P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

圖4 LDH法檢測櫻柏酸對TBHP 誘導損傷的SH-SY5Y細胞活性影響Fig.4 The effect of communic acid on TBHP-treated SH-SY5Y cells by LDH assay 與空白組相比:#P<0. 05; 與模型組相比：*P<0.05 #P<0.05 compared with control group; *P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=4

2.6 櫻柏酸減少TBHP誘導SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞內(nèi)ROS水平

用DCFH-DA 染料處理細胞，經(jīng)流式細胞儀檢測細胞內(nèi)ROS水平，結(jié)果如圖6所示：與空白對照組相比，模型組細胞細胞內(nèi)ROS水平顯著增；與模型組相比，4 μmol/L櫻柏酸能降低TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞內(nèi)ROS水平(P﹤0.05)，中高劑量組細胞內(nèi)ROS水平顯著性降低(P﹤0.01)。

2.7 櫻柏酸減輕TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞DNA損傷

檢測細胞培養(yǎng)上清液中8-OHdG含量，結(jié)果如圖6所示：與空白對照組相比，模型組細胞培養(yǎng)上清液中8-OHdG含量增加；與模型組相比，櫻柏酸能降低TBHP誘導SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞培養(yǎng)上清液中8-OHdG的含量，且呈劑量依賴性，差異具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.01)。

圖5 櫻柏酸抑制TBHP誘導SH-SY5Y細胞凋亡Fig.5 Communic acid against apoptosis of SH-SY5Y cells induced by TBHP(A)空白組；(B)模型組(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L櫻柏酸)；(D)中劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L櫻柏酸)；(E)高劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L櫻柏酸)；(F)陽性藥組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜蘆醇)；與空白組相比:#P<0. 05; 與模型組相比：*P<0.05(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F) positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES),##P<0.01 compared with control group;*P<0.05 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=3

圖6 櫻柏酸降低TBHP誘導SH-SY5Y細胞內(nèi)ROS水平Fig.6 Communic acid decreases the intracellular ROS level on TBHP-induced ROS accumulation in SH-SY5Y cells(A)空白組；(B)模型組(80 μmol/L TBHP刺激)；(C)低劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+4 μmol/L櫻柏酸)；(D)中劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L櫻柏酸)；(E)高劑量組(80 μmol/L TBHP刺激+16 μmol/L櫻柏酸)；(F)陽性藥組(80 μmol/L TBHP刺激+8 μmol/L白藜蘆醇)；與空白組相比: #P<0.05; 與模型組相比：*P<0.05,**P<0.01(A) control group; (B) model group(treated by 80 μmol/L TBHP); (C) low concentration group (treated by 80 μmol/L TBHP+4 μmol/L COM); (D) medium concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L COM); (E) high concentration group(treated by 80 μmol/L TBHP+16 μmol/L COM); (F) positive group(treated by 80 μmol/L TBHP+8 μmol/L RES), ##P<0.01 compared with control group;*P<0.05,**P<0.01 compared with model; group values represent means±S.E.M,n=3

2.8 櫻柏酸提高TBHP誘導SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞抗氧化系統(tǒng)能力

檢測細胞內(nèi)SOD和GSH-Px酶活力，結(jié)果如圖8所示：與空白對照組相比，模型組SOD和GSH-Px酶活力降低；與模型組相比，中高劑量組櫻柏酸能提高TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激模型細胞內(nèi)SOD和GSH-Px酶活力，差異有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)。

3 討 論

氧化應激誘導細胞產(chǎn)生ROS所介導的生物分子損傷會導致細胞凋亡及衰老，是誘發(fā)衰老及神經(jīng)退行性疾病的關(guān)鍵因素[7]。因此，使用抗氧化劑抑制ROS的產(chǎn)生是延緩衰老及治療氧化應激相關(guān)疾病的有效途徑。叔丁基過氧化氫(TBHP)是一種常見的過氧化物，產(chǎn)生的羥自由基可引起脂質(zhì)過氧化反應，刺激大量ROS生成，導致細胞氧化應激損傷，目前被廣泛用于氧化應激損傷模型的建立[8]。

圖7 櫻柏酸減輕TBHP誘導 SH-SY5Y細胞DNA損傷Fig.7 Communic acid inhibits 8-OHdG generate of SH-SY5Y cells induced by TBHP 與空白組相比:##P<0. 01; 與模型組相比：**P<0.01 ##P<0.01 compared with control group;**P<0.01 compared with model; group values represent means±S.E.M, n=3

圖8 櫻柏酸提高TBHP誘導 SH-SY5Y細胞內(nèi)抗氧化酶活力Fig.8 Communic acid increases intracellular antioxidant enzyme activity in SH-SY5Y cells induced by TBHP(A) 櫻柏酸對SH-SY5Y細胞內(nèi)SOD活性的影響;(B) 櫻柏酸對SH-SY5Y細胞GSH-Px活性的影響；與空白組相比:##P<0. 01; 與模型組相比：*P<0.05(A)Effect of Communic acid on intracellular SOD activity in SH-SY5Y cells; (B) Effect of Communic acid on intracellular GSH-Px activity in SH-SY5Y cells.## P<0.01 compared with control group;* P<0.05 compared with model group; values represent means±S.E.M, n=3

櫻柏酸是廣泛存在于松柏類植物的活性單體。文獻報道，櫻柏酸能通過抑制MMP-1的表達來防止膠原蛋白降解，具有抗皮膚光老化作用[9]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)櫻柏酸對神經(jīng)細胞具有保護作用，故本實驗選用80 μmol/L TBHP 作用SH-SY5Y細胞24 h建立氧化應激損傷模型，來研究櫻柏酸抗氧化應激損傷的作用及機制，并使用天然抗氧化劑白藜蘆醇作為陽性對照藥[10-11]。β-半乳糖苷酶是評價衰老的重要指標，通過染色檢測其染色率和染色程度研究櫻柏酸對TBHP誘導SH-SY5Y細胞氧化應激損傷模型細胞衰老比例和細胞衰老程度的影響，結(jié)果表明，櫻柏酸能延緩TBHP誘導SH-SY5Y氧化應激損傷模型細胞衰老。因此，櫻柏酸具有潛在抗氧化應激損傷延緩細胞衰老的作用。本研究通過MTS法檢測細胞活性，結(jié)果顯示櫻柏酸能提高細胞的活性。為了進一步研究櫻柏酸的抗氧化應激損傷作用，本實驗通過檢測細胞外乳酸脫氫酶(LDH)的釋放量，來考察細胞膜的完整性，結(jié)果再次證實櫻柏酸能明顯提高氧化應激損傷細胞的活性。氧化應激造成的損傷最終導致細胞凋亡[12]，因此本實驗檢測了細胞的凋亡率。結(jié)果表明，櫻柏酸可以抑制TBHP誘導的細胞凋亡。由此可見，櫻柏酸對TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激損傷具有保護作用。

ROS是導致細胞活性下降和細胞膜損傷的關(guān)鍵因素[13]，本研究發(fā)現(xiàn)櫻柏酸能降低細胞內(nèi)ROS水平。ROS引起的DNA過氧化會導致基因突變，影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合和微管的穩(wěn)定性。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是指示DNA堿基對的改變的特異性物質(zhì)[14]。本實驗通過測定細胞培養(yǎng)上清中8-OHdG的含量，來考察細胞DNA氧化應激損傷的程度。結(jié)果表明，櫻柏酸能減輕氧化應激所致的SH-SY5Y細胞DNA損傷。同時，機體抗氧化系統(tǒng)的失衡也會導致氧化應激損傷。超氧化歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)是人體代謝產(chǎn)生的內(nèi)源性抗氧化劑，在生理水平下能抑制ROS的產(chǎn)生，維持人體代謝平衡，延緩衰老及預防各種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[15]。而隨著機體的衰老，體內(nèi)SOD和GSH-Px的含量大幅下降，最終導致各類慢性病的產(chǎn)生，如能及時補充外源性的抗氧化劑，抑制體內(nèi)SOD和GSH-Px含量的減少，能有效抑制ROS氧化應激損傷，進而減緩機體衰老進程及預防神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[16]。本實驗對細胞內(nèi) SOD 和 GSH-Px 的活力檢測結(jié)果顯示，櫻柏酸能提高體內(nèi)抗氧化酶 SOD 和GSH-Px 的含量。說明櫻柏酸能通過增強細胞自身對氧化應激的防御能力，來起到保護細胞抗氧化應激損傷的作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)櫻柏酸減輕TBHP誘導的SH-SY5Y細胞氧化應激損傷及延緩細胞衰老進程，其作用機制可能通過減少ROS對細胞膜和DNA等氧化應激損傷、同時提高體內(nèi)源性氧化劑SOD和GSH-Px活力起效。本研究有助于闡明櫻柏酸作為天然抗氧化劑抗細胞損傷延緩衰老的作用機制，為進一步開發(fā)治療氧化應激相關(guān)疾病和抗衰老藥物等臨床藥物的提供了相關(guān)理論及實驗依據(jù)，具有重要的社會和經(jīng)濟價值。