采用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法準(zhǔn)確測定原料奶中的舒巴坦

穆姣姣 崔相勇

舒巴坦是一種典型的競爭性不可逆的β-內(nèi)酰胺酶抑制劑，與β-內(nèi)酰胺環(huán)類抗生素聯(lián)合應(yīng)用，通過對酶的抑制，保護抗生素免受破壞，提高抗菌活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療行業(yè)。由于原料奶中的青霉素類抗生素殘留量有限量要求，因此為消除這種青霉素類抗生素殘留，不法商販向原料奶中添加β-內(nèi)酰胺酶來降解抗生素；而為了逃避質(zhì)檢機構(gòu)對β-內(nèi)酰胺酶的檢測，商販極有可能向原料奶中添加舒巴坦，來抑制β-內(nèi)酰胺酶活性。為保證乳制品質(zhì)量安全和保障消費者的身體健康，建立原料奶中舒巴坦的準(zhǔn)確快速檢測方法是十分必要的。

本文采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/ MS）來測定原料奶中的舒巴坦，沉淀蛋白試劑為甲醇，以乙腈及0.1%甲酸為流動相進行梯度洗脫，經(jīng)過反相色譜分離后以多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進行檢測。

一、材料和方法

1.儀器。API 4000型三重四極桿質(zhì)譜儀，配有Analysis1.4.2軟件處理系統(tǒng)，美國Sciex公司；與之聯(lián)用的LC-20A液相色譜儀（包括自動進樣器、二元輸液泵及柱溫箱），日本島津公司。

2 .藥品及試劑。舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)品（含量89.7%），批號：130430-200906，購自中國藥品生物制品檢定所。實驗室用水為一級水。甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

3.標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。精密稱取舒巴坦0.1000g，置于100mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。此標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液每毫升相當(dāng)于1.0mg舒巴坦。

4.質(zhì)譜條件。儀器配有ESI電噴霧離子化源；離子噴射電壓：-3000V；源溫度：550C；源內(nèi)Gas1壓力：60psi，Gas2壓力：60psi；氣簾氣壓力：15psi；均為氮氣。負離子模式檢測；舒巴坦的碰撞能量（CE）為-20eV，解簇電壓（DP）為-36V；用于定量分析的離子對為m/z231.8-m/z139.9。

5.色譜條件。色譜柱：Symmetry C18柱，3.5μm，150×2.1mm I.D.，waters公司；流動相：B（乙腈）-A（含0.1%甲酸）；進樣量：20μL；柱溫：25C；流速：0.3mL/min。梯度洗脫條件：0-1min，5%B；1-3min，5%-98%B；3-4.5min，98%B；4.5-5min，98%-5%B。

6.原料奶樣品的預(yù)處理。稱取原料奶樣品5g（精確至0.01g），加入15mL甲醇，渦旋沉淀蛋白1min；轉(zhuǎn)移并定容于25mL容量瓶中，震蕩1min后，置于超聲波中超聲提取15min；轉(zhuǎn)移至50mL離心管中，10000r/min離心10min；取上清液經(jīng)0.22μm有機濾膜過濾，取20μL供LC-MS/MS分析。

7.空白原料奶萃取液制備。選擇未添加舒巴坦的原料奶，按步驟6提取，進行LC-MS/MS分析，以確定在舒巴坦色譜出峰處不存在干擾。

二、結(jié)果

1.色譜行為和專屬性。按上述步驟6操作，分別制備空白原料奶樣品、空白原料奶加入舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液（相當(dāng)于含10μg/kg舒巴坦）進行測試。色譜圖分別見圖1-A和圖1-B，舒巴坦色譜出峰處不存在干擾，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。

2.線性范圍和檢出限。取空白原料奶萃取液，依次加入適量舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，配制成相當(dāng)于濃度為2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg、20μg/kg、50μg/kg的萃取液，按上述步驟6操作，進樣分析；以舒巴坦峰面積為縱坐標(biāo)，舒巴坦?jié)舛葹闄M坐標(biāo)，進行回歸運算，求得擬合方程為y=4830x-2910，即為標(biāo)準(zhǔn)曲線，相關(guān)系數(shù)為0.9981。由此可見，舒巴坦在2μg/kg-50μg/kg范圍內(nèi)線性良好，方法檢出限為2μg/kg（此時信噪比S/N=3）。

3.精密度和回收率。制備相當(dāng)于含舒巴坦2μg/kg、10μg/kg、50μg/kg的低、中、高3個濃度的原料奶樣品，按上述步驟6的操作方法進行處理，每濃度六樣本分析，同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以當(dāng)時的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的測得濃度，計算得出本法的精密度與回收率。低、中、高3個濃度的回收率范圍分別為91.56%-96.1%、93%-98.4%和92.5%-100.2%，均在85%-115%之間；精密度RSD分別為5.4%、3.9%和6.6%，均小于10%。

三、討論

1.質(zhì)譜條件優(yōu)化。（1）將濃度為200ng/mL的舒巴坦標(biāo)準(zhǔn)溶液吸入注射器，置于蠕動泵進樣器上，設(shè)置蠕動泵以25μL/min的速度進樣來優(yōu)化質(zhì)譜條件，使舒巴坦響應(yīng)信號最高。分別選擇舒巴坦在正、負兩種離子化模式下進行掃描，比較響應(yīng)值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)負離子化效率高于正離子化效率，且負離子響應(yīng)較為穩(wěn)定，因此使用負離子掃描模式。（2）經(jīng)過Q1全掃描，發(fā)現(xiàn)m/z231.8的響應(yīng)信號最高，作為舒巴坦定量分析的母離子，在子離子掃描模式（MS2）下，可得到一些碎片離子，其中m/z139.9響應(yīng)最高，其次是m/z63.9，在MRM掃描模式下，選擇m/z231.8 → m/z139.9用于舒巴坦的定量分析。（3）在蠕動泵持續(xù)進樣的條件下，對解簇電壓、碰撞能量、離子源參數(shù)進行進一步優(yōu)化，使得舒巴坦響應(yīng)值達到最佳。

2.色譜條件優(yōu)化。為了減少原料奶中內(nèi)源性物質(zhì)對測定產(chǎn)生干擾，需將其與舒巴坦進行色譜分離，所以需對色譜條件進行選擇及優(yōu)化。在質(zhì)譜分析常用的流動相條件下，舒巴坦在小粒徑的C18色譜柱上都可以得到較好的保留，試驗中選擇了Symmetry C18柱（3.5μm，150×2.1mmI.D.）。LC-MS/MS反相色譜分析方法中用到的有機相主要為乙腈和甲醇，選用乙腈作為有機相時，舒巴坦的色譜行為較好。為了改善舒巴坦峰形，選擇了0.1%的甲酸作為水相。

3.提取條件的選擇。試驗中采用有機試劑沉淀體系，操作簡單，考察了甲醇和乙腈作為沉淀試劑的沉淀蛋白效果。采用乙腈作沉淀試劑，在稀釋5倍下能獲得良好的沉淀效果，但舒巴坦峰形較差；采用甲醇作沉淀試劑，沉淀蛋白效果良好，同時改善了峰形。此外，超聲提取的使用會提高舒巴坦的提取效率。