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    脫細(xì)胞隨機(jī)肌腱支架促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化*

    2020-05-26 08:57:10張珂珂李紅梅
    中國(guó)病理生理雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:成骨細(xì)胞肌腱干細(xì)胞

    張珂珂,李紅梅△,劉 暢

    (1暨南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系國(guó)家中醫(yī)藥管理局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州510632;2大連市中心醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,遼寧大連116033)

    肌腱損傷的修復(fù)和重建是骨科醫(yī)生面臨的一大挑戰(zhàn)。肌腱組織血液供應(yīng)差,自我修復(fù)能力有限,因此,受損肌腱組織愈合非常緩慢,即使愈合也很難達(dá)到正常肌腱的完整結(jié)構(gòu)和機(jī)械強(qiáng)度[1]。目前用于受損肌腱修復(fù)的治療方法有自體移植物、異體移植物、合成和天然細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)來(lái)源的移植物等,成功率極低,且具有傳播疾病或產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。因此,尋找有效的肌腱組織修復(fù)材料依然是臨床面臨的重大難題[2]。

    近年來(lái),去細(xì)胞肌腱組織由于具有巨大的臨床應(yīng)用潛力而備受關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),去細(xì)胞多層肌腱切片支架可誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化為肌腱細(xì)胞[3],且天然肌腱ECM支架能增強(qiáng)受損肌腱的承重能力[4]。Tong等[5]利用牛跟腱作為支架,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)膠原纖維的方向而非膠原蛋白的含量影響B(tài)MSCs排列、延伸和分化。Yiu等[6]利用納米纖維模擬肌腱組織的膠原纖維結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)有序排列的納米纖維可以促進(jìn)干細(xì)胞向肌腱分化,而隨機(jī)排列的納米纖維則促進(jìn)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。我們前期利用大鼠尾肌腱制備了膠原纖維定向排列的肌腱ECM支架(定向肌腱ECM支架),發(fā)現(xiàn)膠原纖維的有序結(jié)構(gòu)能誘導(dǎo)BMSCs沿膠原纖維定向生長(zhǎng),并促進(jìn)BMSCs向肌腱細(xì)胞分化,然而隨機(jī)排列的膠原纖維支架對(duì)BMSCs分化的影響尚不清楚。在本研究中,我們通過(guò)打亂鼠尾肌腱膠原纖維固有的排列,制備出膠原纖維隨機(jī)排列的肌腱ECM支架(隨機(jī)肌腱ECM支架),在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究隨機(jī)肌腱ECM支架對(duì)BMSCs活力和分化的影響。

    材料和方法

    1 材料

    SPF級(jí)雄性 Sprague-Dawley(SD)大鼠,4~6周齡,160~180 g,購(gòu)自廣東醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,許可證號(hào)為SCXK(粵)2013-0020。LG-DMEM培養(yǎng)基、澳洲胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)、PBS緩沖液、0.25%胰酶(trypsin)均購(gòu)自HyClone;青霉素/鏈霉素(雙抗)購(gòu)自Gibco公司;流式檢測(cè)抗體(小鼠抗人CD44-FITC、CD45-FITC、CD90-FITC和CD106-PE)購(gòu)自 BioLegend;4%多聚甲醛固定液、DAPI、Triton X-100、DNA酶(DNase)和RNA酶(RNase)均購(gòu)自Sigma;戊巴比妥鈉購(gòu)自北京諾特萊斯生物科技有限公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8(Cell Counting Kit-8,CCK8)購(gòu)自Dojindo;DNA提取試劑盒購(gòu)自天根生物科技有限公司;Live/Dead試劑盒購(gòu)自Life Technologies;RNA提取試劑盒(RNeasy Plus Mini Kit)購(gòu)自Qiagen;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript RT Kit)和real-time PCR試劑盒(SYBR Premix Ex Taq Kit)購(gòu)自TaKaRa;所用引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。

    2 方法

    2.1 大鼠BMSCs的提取 采用全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs。SD大鼠3%戊巴比妥鈉麻醉后,小心分離股骨和脛骨,75%乙醇浸泡消毒,PBS清洗2~3次。使用含10%FBS和1%雙抗的LG-DMEM培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,獲取原代BMSCs,接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃,5%CO2)中,每隔48 h換液,棄去未貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞融合度達(dá)80%以上時(shí),1∶3傳代培養(yǎng)。

    2.2 大鼠BMSCs的鑒定 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干細(xì)胞表面標(biāo)志物:取融合率達(dá)80%以上的第2代BMSCs,棄去培養(yǎng)液,PBS清洗,0.25%胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L,裝入流式管;每管中加入500 μL細(xì)胞懸液,依次將CD44(1∶1 000)、CD45(1∶8 000)、CD90(1∶1 000)、CD106(1∶1 000)抗體稀釋到相應(yīng)比例后加入到細(xì)胞懸液中,吹打均勻,4℃避光孵育30 min;PBS清洗3次,棄去上清,加入500 μL PBS重懸細(xì)胞后,避光使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè),計(jì)算細(xì)胞表面抗原表達(dá)率。

    2.3 隨機(jī)肌腱ECM支架的制備方法

    2.3.1 天然肌腱組織的提取和脫細(xì)胞處理 對(duì)大鼠實(shí)施安樂(lè)死后,收集其尾巴,去除尾巴外包圍的皮膚組織,使尾肌腱組織內(nèi)的膠原蛋白纖維暴露出來(lái);小心去除與膠原蛋白黏附的肌肉、脂肪等組織;收集大鼠尾肌腱膠原蛋白,PBS清洗3次。收集的鼠尾肌腱即為天然肌腱組織(normal)。脫細(xì)胞肌腱組織(decellularized)經(jīng)以下處理:1%Triton X-100靜置處理48小時(shí),PBS洗滌3次,每次30 min;再用含400 μg/L DNase和200 μg/L RNase的混合液處理 24 h,37℃水平震蕩,60 Hz,PBS洗滌3次,每次30 min。利用HE染色檢測(cè)組織內(nèi)細(xì)胞核殘余情況,利用試劑盒分別提取天然組織和脫細(xì)胞組織內(nèi)DNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA濃度,并計(jì)算每g組織內(nèi)的DNA含量(μg),以μg/g為單位表示。

    2.3.2 隨機(jī)肌腱ECM支架的制備 將脫細(xì)胞肌腱組織縱向切成長(zhǎng)度約5 cm的片段后,放入含有5顆研磨珠的2 mL離心管,置于液氮中30 s,然后用組織勻漿機(jī)研磨90 s(60 Hz);經(jīng)此步驟后,肌腱呈絮狀;將絮狀肌腱基質(zhì)均勻平鋪在載玻片上,室溫下晾干后收集;使用前,修剪成1.5 cm×1.5 cm大小。利用體視顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察支架表面結(jié)構(gòu)。其他樣品經(jīng)伽馬射線滅菌后,無(wú)菌密封保存?zhèn)溆谩?/p>

    2.4 BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架上的活力檢測(cè)

    2.4.1 Live/Dead染色 支架于生物安全柜中用無(wú)菌水浸泡過(guò)夜,風(fēng)干0.5 h。以4×103/cm2的密度將BMSCs種植在支架上,37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)3 h。待細(xì)胞充分粘附在支架上后,沿壁緩慢補(bǔ)加3 mL培養(yǎng)基,每48 h更換培養(yǎng)基。培養(yǎng)1、3、7和14 d后,將支架小心轉(zhuǎn)移至新的24孔板中,PBS小心清洗;加入2 mL Live/Dead染色工作液,覆蓋支架表面,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min,PBS清洗2次,激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細(xì)胞活力和形態(tài)。

    2.4.2 CCK8法檢測(cè)細(xì)胞活力 將BMSCs按上述方法分別接種在24孔板(對(duì)照組,control group)和隨機(jī)肌腱ECM支架(實(shí)驗(yàn)組,random group)上,每孔板和支架上的接種細(xì)胞數(shù)為9 000個(gè)。培養(yǎng)1、3和7 d時(shí),每孔加入2 mL含10%(體積分?jǐn)?shù))CCK8的完全培養(yǎng)基,于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,然后吸取200 μL孵育液,加入96孔板中,用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度(A)。

    2.5 RT-qPCR檢測(cè) 將BMSCs以1×105/cm2的密度種植在不含支架的24孔板(對(duì)照組,control group)和隨機(jī)肌腱ECM支架上(實(shí)驗(yàn)組,random group)上。培養(yǎng)14 d后,將隨機(jī)ECM支架轉(zhuǎn)移至新的24孔板中,PBS清洗2次;加入2 mL胰酶,37℃下消化5 min,鏡下觀察到有脫落的圓形細(xì)胞時(shí),加入6 mL培養(yǎng)基中和,然后利用培養(yǎng)基清洗支架3次,收集所有液體;2 000 r/min離心5 min,去上清;使用RNeasy Plus Mini Kit提取BMSCs總RNA,逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,利用real-time PCR技術(shù)檢測(cè)肌腱標(biāo)志物I型膠原蛋白(collagen type I,Col I)、肌腱特異轉(zhuǎn)錄因子scleraxis(SCX)及成骨標(biāo)志物堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2,RUNX2)的mRNA表達(dá)水平。所用引物序列如表1所示。GAPDH作為內(nèi)參照,通過(guò)2-ΔΔCt法計(jì)算各組mRNA的表達(dá)量。

    表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    使用SPSS 14.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,兩組間均數(shù)比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 BMSCs的鑒定

    原代BMSCs培養(yǎng)至第4天時(shí)在倒置相差顯微鏡下進(jìn)行觀察,細(xì)胞呈紡錘形,貼壁生長(zhǎng),并逐漸形成均一群落,見(jiàn)圖1A,與文獻(xiàn)報(bào)道BMSCs形態(tài)一致[4]。流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,第2代BMCSs中間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物CD44和成纖維細(xì)胞標(biāo)志物CD90表達(dá)率分別為95.6%和99.5%,均大于95%;淋巴細(xì)胞標(biāo)志物CD45和內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD106表達(dá)率分別為3.25%和2.32%,均小于5%,見(jiàn)圖1B,證明分離純化的細(xì)胞是BMSCs。

    2 肌腱組織脫細(xì)胞處理

    HE染色結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)1%Triton X-100和DNase/RNase脫細(xì)胞處理后,肌腱組織內(nèi)細(xì)胞核顯著減少,見(jiàn)圖1A。此外,與天然肌腱組織(normal)相比,脫細(xì)胞處理組(decellularized)肌腱組織的DNA含量顯著降低(P<0.05),從(481.7±15.8)μg/g顯著降至(31.0±3.8)μg/g,見(jiàn)圖2B。

    Figure 1.The morphological observation and stemness identification of the BMSCs.A:the morphological observation of the BMSCs at passage 0(scale bar=100 μm);B:flow cytometric analysis of the expression of mesenchymalstem cell marker CD44,fibroblast marker CD90,leukocyte marker CD45 and endothelial cell marker CD106 on BMSCs.圖1 BMSCs形態(tài)觀察及干性鑒定

    Figure 2.Decellularization of rat tail tendons.A:HE staining of normal tendons and decellularized tendons(scale bar=50 μm);B:cell DNA content in normal tendons and decellularized tendons.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs normal group.圖2 肌腱組織脫細(xì)胞

    3 隨機(jī)肌腱ECM支架的表面結(jié)構(gòu)表征

    隨機(jī)肌腱ECM支架的制備過(guò)程如圖3A所示,其外觀圖和表面結(jié)構(gòu)如圖3B所示,材料表面結(jié)構(gòu)均勻,且觀察不到原有膠原纖維的有序結(jié)構(gòu),膠原纖維呈無(wú)序排布。

    4 BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架上活力增強(qiáng)

    Live/Dead染液將活細(xì)胞標(biāo)記為綠色,死細(xì)胞標(biāo)記為紅色。BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架上培養(yǎng)1、3、7和14 d后,均未在支架表面檢測(cè)到死細(xì)胞;隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),隨機(jī)肌腱ECM支架表面BMSCs數(shù)目逐漸增多,呈多邊形,細(xì)胞之間聯(lián)系密切;第14天,BMSCs充滿整個(gè)支架表面,見(jiàn)圖4A。CCK8結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),與對(duì)照組相比,培養(yǎng)第7天BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架上的活力顯著增強(qiáng)(P<0.05),見(jiàn)圖4B。

    5 BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架上向成骨細(xì)胞分化

    Figure 3.Preparation of random tendon ECM scaffolds(A)and their appearance,stereomicroscopic image(scale bar=100 μm)and SEM image(B).圖3 隨機(jī)肌腱ECM支架的制備和表面結(jié)構(gòu)觀察

    Figure 4.The viability of the BMSCs.A:BMSCs seeded on the random tendon ECM scaffolds at day 1,day 3,day 7 and day 14 were observed by fluorescence microscopy,with live cells stained green and dead cells stained red;B:the viability of the BMSCs at day 1,day 3 and day 7 was measured by CCK8 assay.Control:BMSCs seeded on the culture plate;random:BMSCs seeded on random tendon ECM scaffolds.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.圖4 BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架上的活力增強(qiáng)

    與單獨(dú)在24孔板中培養(yǎng)的BMSCs對(duì)照(control)組相比,BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架(random)上培養(yǎng)14 d后,肌腱細(xì)胞標(biāo)志物Col I和SCX的表達(dá)量顯著下調(diào)(P<0.05),而成骨標(biāo)志物ALP和RUNX2在隨機(jī)肌腱ECM支架上的表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),見(jiàn)圖5。

    討 論

    脫細(xì)胞天然肌腱組織,被認(rèn)為是肌腱組織工程的理想支架材料,在肌腱組織工程和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到廣泛重視[7]。目前常用的動(dòng)物肌腱組織取自兔、牛等,材料獲取周期長(zhǎng)。而大鼠來(lái)源充足,個(gè)體間差異較小,且尾肌腱材質(zhì)均一,取材簡(jiǎn)單,可有效提高實(shí)驗(yàn)效率。因此,本研究利用大鼠尾肌腱ECM作為基質(zhì)微環(huán)境,研究膠原纖維排列方式對(duì)BMSCs分化的影響,希望為修復(fù)肌腱損傷的組織工程提供所需生物材料。

    Figure 5.Differentiation of BMSCs at day 14.Relative mRNA expression levels of tenocyte-related markers collagen type I(Col I)and scleraxis(SCX),and osteogenic markers alkaline phosphatase(ALP)and Runt-related transcription factor 2(RUNX2)were detected by RT-qPCR.Control:BMSCs seeded on the culture plate;random:BMSCs seeded on random tendon ECM scaffolds.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group.圖5 BMSCs在隨機(jī)肌腱ECM支架上向成骨細(xì)胞分化

    在應(yīng)用來(lái)源于動(dòng)物的肌腱組織作為支架材料時(shí),首先要進(jìn)行脫細(xì)胞處理,以去除組織原本的細(xì)胞和表面抗原,降低免疫原性,但要保持其ECM結(jié)構(gòu)、組成及固有的生物力學(xué)特性,以保證肌腱ECM再細(xì)胞化后用于肌腱重建效果良好[8]。物理法、化學(xué)試劑處理法和生物試劑處理法是最常見(jiàn)的脫細(xì)胞方法。十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)和Triton X-100被廣泛用于脫細(xì)胞處理[9],其中SDS脫細(xì)胞能力強(qiáng),但對(duì)組織損傷也較嚴(yán)重;Triton X-100較為溫和,但脫細(xì)胞效果不如SDS。使用這些化學(xué)物質(zhì)時(shí),對(duì)于不同的組織,其使用濃度、處理時(shí)間以及其他物理或化學(xué)參數(shù)都要相應(yīng)地發(fā)生變化,很難設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)方案。在本研究中,大鼠尾肌腱組織經(jīng)1%Triton X-100處理48 h,DNase/RNase混合液處理24 h后,未觀察到殘余細(xì)胞核,組織內(nèi)殘留的DNA 含量小于 50 μg/g,符合脫細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)[10],同時(shí)又保留了天然肌腱的物理結(jié)構(gòu)。

    肌腱組織ECM的組成和膠原纖維排列方式為細(xì)胞接種、黏附、增殖和分化提供了理想的微環(huán)境[11]。文獻(xiàn)報(bào)道,經(jīng)脫細(xì)胞處理后,肌腱ECM中的蛋白聚糖(纖維調(diào)節(jié)蛋白、雙糖鏈蛋白聚糖)和生長(zhǎng)因子(TGF-β1、IGF-1、VEGF和CTGF)能妥善保存在組織內(nèi)[12]。在本研究中,我們制備了膠原纖維隨機(jī)排列的肌腱ECM支架,發(fā)現(xiàn)種植在支架上的BMSCs能夠維持較高的細(xì)胞活力,這可能與脫細(xì)胞肌腱支架中保留的蛋白聚糖和少量生長(zhǎng)因子有關(guān)。Zhang等[13]的研究也發(fā)現(xiàn)兔來(lái)源的肌腱干細(xì)胞在肌腱基質(zhì)上的增長(zhǎng)速度比在塑料培養(yǎng)皿上更快,這與我們的研究結(jié)果一致。我們?cè)谇捌谘芯恐欣么笫笪布‰熘苽淞思‰炷z原纖維定向排列的脫細(xì)胞肌腱ECM支架,發(fā)現(xiàn)種植在其上的BMSCs沿膠原纖維平行方向排列生長(zhǎng)[14];在本研究中,我們利用勻漿機(jī)研磨制備膠原纖維隨機(jī)排列的肌腱ECM支架,發(fā)現(xiàn)種植在其上的BMSCs排列雜亂,并非平行排列生長(zhǎng),這些結(jié)果均表明支架中膠原纖維的排列方式能夠影響種子細(xì)胞的排列和生物行為學(xué)。

    肌腱ECM微環(huán)境的生物化學(xué)和生物物理信號(hào),可以直接參與調(diào)控干細(xì)胞的生物學(xué)行為。據(jù)報(bào)道,纖維調(diào)節(jié)蛋白和雙糖鏈蛋白聚糖是構(gòu)成肌腱組織ECM的兩個(gè)關(guān)鍵成分,它們的缺失可能會(huì)導(dǎo)致種子細(xì)胞從成腱分化變?yōu)槌晒欠只?5]。此外,也有報(bào)道ECM微環(huán)境的表面形貌在調(diào)節(jié)干細(xì)胞行為中起重要作用[16]。另一個(gè)重要的微環(huán)境因素——基質(zhì)硬度已證明能決定干細(xì)胞命運(yùn)。Engler等[17]發(fā)現(xiàn),在模仿大腦組織的柔軟基質(zhì)上,MSCs開(kāi)始顯示神經(jīng)元表型;在類(lèi)似橫紋肌硬度的中等基質(zhì)上,干細(xì)胞發(fā)育成肌細(xì)胞譜系;在類(lèi)似骨骼前體(類(lèi)骨質(zhì))的堅(jiān)硬基質(zhì)上,干細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞[18]。我們前期研究發(fā)現(xiàn),定向肌腱ECM支架能促進(jìn)BMSCs向肌腱細(xì)胞進(jìn)行特異性分化[14]。而本研究發(fā)現(xiàn),在隨機(jī)肌腱ECM支架上BMSCs肌腱細(xì)胞標(biāo)志物Col I和SCX的表達(dá)顯著下調(diào),而成骨細(xì)胞標(biāo)志物ALP和RUNX2顯著上調(diào),表明隨機(jī)肌腱ECM支架具有誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的潛能。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)定向肌腱ECM支架對(duì)干細(xì)胞成骨分化的誘導(dǎo)作用很弱;相反地,生長(zhǎng)在隨機(jī)肌腱ECM支架上的BMSCs中Kdm6b和Jmjd1c的表達(dá)水平上調(diào),表明隨機(jī)ECM支架的表面形貌可以調(diào)控表觀遺傳基因的表達(dá),增強(qiáng)參與成骨分化信號(hào)傳導(dǎo)途徑的激活。綜上所述,隨機(jī)肌腱ECM支架和定向肌腱ECM支架對(duì)BMSCs分化的不同誘導(dǎo)作用可能與肌腱ECM的生化成分、基質(zhì)硬度、基質(zhì)表面形貌等因素有關(guān),但這些因素對(duì)干細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

    本研究制備的膠原纖維隨機(jī)排列的肌腱ECM支架,能支持BMSCs黏附,增強(qiáng)BMSCs活力,并誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化,在韌帶/肌腱-骨連接的修復(fù)應(yīng)用中具有重大潛能。

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