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    欖香烯對人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的放射增敏機制*

    2020-05-26 08:57:06關(guān)曉燕周衛(wèi)兵
    中國病理生理雜志 2020年4期
    關(guān)鍵詞:香烯膠質(zhì)瘤活力

    汪 鳳,朱 婷,關(guān)曉燕,2,李 玲,周衛(wèi)兵△

    (1中南大學(xué)湘雅醫(yī)院腫瘤科,湖南長沙410008;2中國科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院腫瘤科,安徽合肥230071;3中南大學(xué)湘雅醫(yī)院分子醫(yī)學(xué)研究中心,湖南長沙410008)

    高級別膠質(zhì)瘤(high-grade gliomas,HGGs)包括WHOⅢ、Ⅳ級膠質(zhì)瘤,是腦原發(fā)性腫瘤中發(fā)病率最高、最難治療的一類腫瘤,因腫瘤無完整的包膜,呈浸潤性生長,與腦組織分界不清,手術(shù)難以根除。目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案為手術(shù)聯(lián)合術(shù)后放療和(或)同步替莫唑胺化療[1-2]。放療能延長患者的無疾病進(jìn)展生存期[3],但往往因放射抵抗導(dǎo)致復(fù)發(fā),降低生存時間。因此通過藥物、生物以及物理等手段增強高級別膠質(zhì)瘤的放療敏感性已成為近年研究重點之一。

    欖香烯(elemene)是從姜科植物溫莪術(shù)(郁金)中提取出來的萜烯類化合物,主要包括β-欖香烯、γ-欖香烯和δ-欖香烯3種,其中具有明確抗癌活性的成份是β-欖香烯(1-甲基-1-乙烯基-2,4-二異丙烯基環(huán)己烷)。1994年欖香烯乳狀注射液作為國家二類非細(xì)胞毒性抗腫瘤新藥上市[4-5],但乳劑存在一些缺陷,如靜脈炎發(fā)生率高、低溫耐受性差等。石藥集團(tuán)對劑型進(jìn)行改良升級,于2012年上市水針劑型的欖香烯注射液,為無色澄明粘稠液體,均相體系顯著降低了使用者靜脈炎的發(fā)生率,其β-欖香烯含量高達(dá)96%以上,雜質(zhì)含量低且產(chǎn)品穩(wěn)定性良好。大量研究[6-10]證實,欖香烯能通過血腦屏障,具有廣譜、高效、低毒等特點,對包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的多種腫瘤表現(xiàn)出抗腫瘤作用。目前欖香烯注射液聯(lián)用化療藥開展的臨床試驗涉及惡性胸腹腔積液、多種實體瘤以及腦轉(zhuǎn)移癌等,并取得了一定的療效[11-12],具有毒副作用小(如對肝、腎功能無明顯損害,不發(fā)生骨髓抑制)、長期使用無明顯耐藥性等優(yōu)點。欖香烯亦具有放射增敏作用,但目前研究主要集中于肺癌,而對于膠質(zhì)瘤增敏作用的研究未見報道。我們前期發(fā)現(xiàn)了欖香烯對U251細(xì)胞有放射增敏作用[13],但具體機制尚不清楚,本文將欖香烯對人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞株的放射增敏作用機制進(jìn)行研究。

    材料和方法

    1 材料

    人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞(中南大學(xué)細(xì)胞分子實驗室)。欖香烯注射液[石藥集團(tuán)遠(yuǎn)大(大連)制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字H20110114,規(guī)格為每支0.2 g/10 mL];annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);鼠抗人細(xì)胞分裂周期蛋白2(cell division cycle protein 2,Cdc2)、survivin和βactin抗體及羊抗鼠、羊抗兔IgG-HRP抗體(Santa Cruz);兔抗人 p-Cdc2(Thr161)和cyclin B1抗體(Cell Signaling)。

    2 儀器與設(shè)備

    超凈工作臺(上海申力科學(xué)儀器公司);ELx800型酶標(biāo)儀(BioTek);FACSCalibur流式細(xì)胞儀(BD);直線加速器(Siemens)。

    3 方法

    3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液,37℃飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱。

    3.2 MTT法檢測細(xì)胞活力 接種對數(shù)生長期細(xì)胞于96孔培養(yǎng)板(每孔4×103個細(xì)胞),設(shè)調(diào)零組、對照組(0 mg/L)及欖香烯(10、20、40、80和160 mg/L)組,每組設(shè)6個重復(fù)孔。常規(guī)培養(yǎng)24 h后,予以不同濃度藥物處理,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后加入MTT液20 μL,孵育4 h后吸棄,再加入DMSO 150 μL,酶標(biāo)儀490 nm波長處測定吸光度(A490)。細(xì)胞相對活力(%)=(欖香烯組A490-調(diào)零組A490)/(對照組A490-調(diào)零組A490)×100%。設(shè)調(diào)零組、對照組(0 mg/L+0 Gy)、欖香烯組(40 mg/L+0 Gy)、放療組(0 mg/L+2、4、6、8 Gy)及聯(lián)合組(40 mg/L+2、4、6、8 Gy),每組設(shè)6個重復(fù)孔,予以欖香烯40 mg/L處理24 h后,放療組及聯(lián)合組置于直線加速器(200 cGy/min,源皮距100 cm),按設(shè)定劑量進(jìn)行照射。各組繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,予以MTT法檢測各組光吸收值A(chǔ)490。放射組細(xì)胞相對活力(%)=(放射組A490-調(diào)零組A490)/(對照組A490-調(diào)零組A490)×100%,去除藥物毒性作用聯(lián)合組細(xì)胞相對活力(%)=(聯(lián)合組A490-調(diào)零組A490)/(藥物組A490-調(diào)零組A490)×100%。

    3.3 細(xì)胞分組及處理 將3×105個細(xì)胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶,設(shè)對照組(0 mg/L+0 Gy)、放療組(0 mg/L+3 Gy)、欖香烯組(40 mg/L+0 Gy)及聯(lián)合組(40 mg/L+3 Gy),每組設(shè)6個平行瓶。

    3.4 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的檢測 收集細(xì)胞,予以冰的70%乙醇固定,再加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)染料4℃避光染色,流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期。另收集細(xì)胞用預(yù)冷的PBS洗滌2次,4℃、300×g離心1 min,細(xì)胞用緩沖液(binding buffer)重懸細(xì)胞。然后加入annexin V/PI雙染色,再加入binding buffer制樣,流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡。

    3.5 Western blot檢測蛋白表達(dá)的水平 收集各組細(xì)胞,加入含10%cocktail蛋白酶抑制劑及磷酸化酶抑制劑細(xì)胞裂解液冰上裂解40 min,4℃、14 000×g離心15 min,收集上清,測定蛋白濃度。SDS-PAGE膠分離蛋白,再將凝膠中的蛋白電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素濾膜,I抗 4℃孵育 24~48 h,II抗室溫下孵育 1 h。ECL試劑發(fā)光壓片顯影。應(yīng)用ImageJ軟件檢測條帶灰度,計算各蛋白相對表達(dá)量。

    4 統(tǒng)計學(xué)處理

    以SPSS 23.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,多組比較采用方差分析+兩兩比較HSD-q檢驗,多時點觀測資料采用兩因素重復(fù)測量方差分析+組間兩兩比較HSD-q檢驗+時間兩兩比較差值t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 欖香烯對U251細(xì)胞活力的影響

    欖香烯處理U251細(xì)胞24 h后,各濃度欖香烯處理組的細(xì)胞活力均低于對照(0 mg/L)組(P<0.05);U251細(xì)胞活力隨欖香烯濃度增高而降低,欖香烯對U251細(xì)胞活力的抑制作用具有劑量依賴性,半數(shù)抑制濃度(IC50)為72.0 mg/L,見圖1。

    Figure 1.Inhibitory effect of elemene on the viability of U251 cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs 0 mg/L group.圖1 欖香烯對U251細(xì)胞活力的抑制作用

    2 欖香烯(40 mg/L)對U251細(xì)胞放射敏感性的影響

    欖香烯濃度為40 mg/L的聯(lián)合組中,接受不同劑量放療的細(xì)胞活力均低于欖香烯濃度為0 mg/L的單獨放射組(P<0.05),表明40 mg/L欖香烯具有放射增敏作用。鑒于單獨放射組細(xì)胞活力在3 Gy劑量時出現(xiàn)下降(P<0.05),故選用40 mg/L欖香烯聯(lián)合3 Gy放療進(jìn)行后續(xù)研究。見圖2。

    3 欖香烯對細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的作用

    欖香烯與放療在U251細(xì)胞的早期凋亡率(P=0.047)、繼發(fā)性壞死率(P=0.008)、總死亡率(P=0.004)及G2/M期阻滯(P=0.032)方面存在交互作用。放射組細(xì)胞早期凋亡率、繼發(fā)性壞死率和總死亡率相對于對照組有增高趨勢,而G2/M期細(xì)胞比例降低;欖香烯與放射聯(lián)合作用進(jìn)一步提高細(xì)胞早期凋亡率、繼發(fā)性壞死率及總死亡率(P<0.05),G2/M期細(xì)胞比例亦顯著升高(P<0.05);欖香烯組細(xì)胞早期凋亡率、總死亡率及G2/M期細(xì)胞比例相對于空白組均顯著增高(P<0.05),提示欖香烯通過誘導(dǎo)U251細(xì)胞G2/M期阻滯和早期凋亡、提高細(xì)胞總死亡率而發(fā)揮其放射增敏作用。見圖3。

    Figure 2.Radiosensitizing effect of elemene on the U251 cells.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs 0 mg/L elemene group.圖2 欖香烯對U251細(xì)胞的放射增敏效應(yīng)

    4 欖香烯對細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)作用

    Western blot結(jié)果顯示,欖香烯藥物治療與放療對cyclin B1蛋白存在交互作用(P=0.007)。單獨放射組cyclin B1蛋白表達(dá)與對照組相比顯著提高(P<0.05);與單獨放射組相比,聯(lián)合組cyclin B1表達(dá)顯著降低,提示欖香烯能夠拮抗放療誘導(dǎo)的cyclin B1表達(dá)增高,降低cyclin B1表達(dá)。此外,欖香烯可顯著降低Cdc2、p-Cdc2(Thr161)和survivin蛋白水平(P<0.05)。見圖4。

    討 論

    放療是膠質(zhì)瘤的重要輔助治療方式之一,但腫瘤周圍存在重要組織器官、腫瘤細(xì)胞內(nèi)在放療敏感性差、術(shù)后腫瘤供血供氧不足而產(chǎn)生放療抵抗或耐放射性等,常導(dǎo)致療效下降。所以,通過放療和放射增敏劑聯(lián)合使用的方法或可提高療效。研究發(fā)現(xiàn),欖香烯可抑制多種腫瘤,具有毒副作用小、逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥等特點,欖香烯具備臨床放射增敏劑的潛能。欖香烯在其它實驗[14-16]證明對膠質(zhì)瘤 U87、C6和U251細(xì)胞系體外具有增殖抑制作用。本研究結(jié)果顯示,欖香烯作用24 h對膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的IC50為72.04 mg/L,表明欖香烯對U251細(xì)胞體外亦具有增殖抑制作用,與前期實驗[13]實驗結(jié)果相近。

    Figure 3.Flow cytometry was used to analyze the apoptosis and the cell cycle distribution.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs radiation group.圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布的變化

    欖香烯可能通過參與調(diào)控細(xì)胞增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)、信號通路活性等途徑發(fā)揮放射增敏作用。本實驗發(fā)現(xiàn)欖香烯通過誘導(dǎo)U251細(xì)胞G2/M期阻滯和早期凋亡、提高細(xì)胞總死亡率而發(fā)揮其放射增敏作用。細(xì)胞增殖依賴于有絲分裂,并主要由3個檢查點(G1/S檢查點、G2/M檢查點和紡錘體組裝檢查點)調(diào)控細(xì)胞有絲分裂周期的不可逆運行[17]。目前,有關(guān)G2檢查點的應(yīng)答通路尚未完全闡明,但有研究證實Cdc2活性在此過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18],而且cyclin B-Cdc2復(fù)合物形成及Cdc2激活推動細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換。本研究結(jié)果表明,欖香烯能夠降低Cdc2蛋白表達(dá),同時拮抗放療誘導(dǎo)的cyclin B1表達(dá)增高,抑制cyclin B1表達(dá),初步證實欖香烯聯(lián)合放療可抑制cyclin B-Cdc2復(fù)合物形成,導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯。Cdc2蛋白活性通過大量磷酸化反應(yīng)調(diào)控,Cdc2蛋白存在一個正性調(diào)節(jié)位點(Thr161)及2個負(fù)性調(diào)節(jié)位點(Thr14及Tyr15)。磷酸化Cdc2第161位蘇氨酸可激活Cdc2,促進(jìn)細(xì)胞G2/M期轉(zhuǎn)換。相反,磷酸化Cdc2兩個負(fù)性調(diào)節(jié)位點則抑制Cdc2活性,導(dǎo)致細(xì)胞G2/M阻滯。我們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)欖香烯能夠抑制Cdc2第161位蘇氨酸磷酸化,導(dǎo)致p-Cdc2(Thr161)蛋白水平降低,抑制Cdc2活性,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞于G2/M期阻滯。大量研究證實,G2期及M期細(xì)胞對放療最敏感,S期細(xì)胞對放療耐受性最強,且G2/M期細(xì)胞放射敏感性比S期細(xì)胞高近3倍[19]。有研究發(fā)現(xiàn),欖香烯可誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌和卵巢癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。另外,陳琦等[6]報道β-欖香烯亦可通過降低cyclin B1和p-Cdc2(Thr161)蛋白水平誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。這些研究進(jìn)一步證實欖香烯可在不同類型的腫瘤中引起G2/M期阻滯,從而達(dá)到放射增敏的作用。

    Figure 4.The expression of G2/M check point-related proteins and protein level of survivin.Mean±SD.n=6.*P<0.05 vs control group;#P<0.05 vs radiation group.圖4 G2/M檢測點相關(guān)蛋白及survivin蛋白表達(dá)的變化

    既往研究表明,survivin高表達(dá)的膠質(zhì)瘤表現(xiàn)出放射抵抗[20-22]。也有人認(rèn)為survivin可抑制caspase-3、caspase-7[23-25]和caspase-9[26]的活化而抑制其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡;survivin還能與Smac(second mitochondria-derived activator of caspase)/DIABLO(direct inhibitor of apoptosis-binding protein with low pI)結(jié)合,發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡功能[27]。本實驗運用Western blot檢測survivin蛋白表達(dá),發(fā)現(xiàn)欖香烯能顯著降低其在膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中表達(dá),提示欖香烯能夠降低U251細(xì)胞survivin蛋白表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,從而增強放療作用。但誘導(dǎo)凋亡的具體途徑有待進(jìn)一步研究。

    綜上所述,欖香烯可抑制人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞活力,增強其放射敏感性;欖香烯可降低Cdc2和cyclin B1蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制cyclin B-Cdc2復(fù)合物形成;欖香烯可能抑制Cdc2蛋白磷酸化,降低Cdc2活性,導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯,增強細(xì)胞放射敏感性;欖香烯還可能通過下調(diào)survivin表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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