二仙膏總皂苷 總多糖的含量測定*

賽春梅 賈玲玉 趙 爽 張國印 高 峰 張方鵬

(1濟寧醫(yī)學院藥學院，日照 276826；2山東廣育堂國藥有限公司， 濟寧 272071)

二仙膏(Erxiangao)組方主要有人參、枸杞、鹿角膠、龜板、牛鞭、黃芪、黑芝麻、核桃仁、熟地黃(砂仁拌)、制何首烏、五味子(酒制)、沙苑子、遠志、牛膝、丹參、山藥十六味藥，輔料為蜂蜜。二仙膏滋陰助陽，益氣養(yǎng)血。用于治療氣血兩虛，神疲體倦，周身懶軟，神經衰弱。其組方合理，是廣育堂傳承的經驗方，國家首批中藥保護品種，入選國家非物質文化遺產保護代表性項目。

二仙膏用于腫瘤患者康復治療，顯著提高患者的生活質量和生存時間，得到許多患者的一致好評。初步藥理試驗結果表明，二仙膏對化療藥致白細胞減少癥小鼠模型的免疫功能有明顯改善作用，可顯著增加白細胞和造血細胞的數(shù)量，增強機體免疫力[1-2]。中藥復方成分復雜，研究其藥效物質基礎對于闡明整體功效、作用機制及提高質量標準具有關鍵作用，其中，中藥復方有效成分的研究能夠在一定程度上明確中藥發(fā)揮藥效的物質基礎，尋找并定量測定其有效部位是現(xiàn)階段中藥藥效物質基礎研究的最基礎、最重要環(huán)節(jié)[3-4]。中藥復方質量標準的完善制定是確保療效穩(wěn)定、用藥安全的有效依據(jù)[5]。雖然二仙膏有很好的臨床療效，但是現(xiàn)有質量標準簡單，且藥效物質基礎尚不明確，需進一步深入研究。通過分析二仙膏的方解及文獻報道藥味的有效成分，表明總皂苷、總多糖提高機體免疫力效果明顯[6-8]，且預實驗表明這2大類成分含量較高，故本文研究紫外可見分光光度法測定二仙膏總皂苷、總多糖的含量，為提高質量控制方法和下一步藥效物質基礎的深度研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

TU-1901光雙束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；102-2A電熱鼓風干燥箱(龍口市先科儀器公司)；JJ224BC電子天平(G&G公司)；旋轉蒸發(fā)儀(鞏義市予華儀器有限公司)；SHK-IIIS循環(huán)水式多用真空泵(鄭州科泰實驗設備有限公司)；玻璃儀器氣流烘干器(河南省予華儀器有限公司)。

1.2 試藥

二仙膏(山東廣育堂國藥有限公司，批號20190501、20190601、20190701)；齊墩果酸(中國藥品生物制品檢定所，批號110709-201705)；AR無水葡萄糖(天津市登科化學試劑有限公司，批號161111)；AB-8大孔樹脂(天津市光復精細化工研究所，批號20170408)；正丁醇，無水乙醇，硫酸，乙酸，高氯酸，甲醇，蒽酮均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 二仙膏總皂苷的測定

2.1.1對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的齊墩果酸對照品14.00mg，置10ml容量瓶中，加入甲醇溶解，搖勻，定容；精密吸取1.0ml，用甲醇定容至10ml，搖勻，即得。

2.1.2供試品溶液的制備 精密稱取二仙膏0.6g，加水2ml，溶解后用正丁醇萃取4次，合并正丁醇減壓蒸干，浸膏用甲醇溶解，過濾，定容至50ml，精密吸取5.0ml，用甲醇定容至10ml，搖勻，即得。

2.1.3溶液的顯色 精密量取對照品溶液或供試品溶液0.4ml，置于25ml具塞試管中，水浴揮干溶劑，依次加入0.2ml 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8ml高氯酸，搖勻后置70℃恒溫水浴15min，隨后立即取出，置冰浴中冷卻3min，加冰乙酸5.0ml，搖勻，放置10min，用于吸光度測定。

2.1.4測定波長的選擇 分別精密量取齊墩果酸對照品溶液和供試品溶液0.4ml，置于25ml具塞試管中，按照“2.1.3”項下方法進行顯色，以相應試劑為空白對照，于400～800nm波長處掃描，結果顯示對照品溶液和樣品溶液均在(540±2)nm處有最大吸收，故確定檢測波長為540nm。

2.1.5標準曲線的繪制和線性范圍 分別精密量取0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50ml對照品溶液，分別置于25ml具塞試管中，按照“2.1.3”項下方法進行顯色，以空白溶劑同法處理作參比，于540nm波長下測定吸光度，以吸光度(A)為縱坐標，濃度(C)為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程為：y=11.182x-0.0629(r=0.9999)，表明齊墩果酸在0.021～0.070mg/mL濃度范圍內與吸光度有良好的線性關系。見圖1。

圖1 齊墩果酸對照品標準曲線

2.1.6精密度試驗 取同一供試品溶液(批號20190601)0.4ml，置25ml具塞試管中，按“2.1.3”項方法進行顯色，以空白溶劑同法處理作參比，于540nm波長下測定吸光度，平行測定吸光度值6次。計算吸光度的RSD為0.23%(n=6)，表明精密度良好。

2.1.7穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液(批號20190601)0.4ml，置25ml具塞試管中，按“2.1.6”項操作，分別在0、20、40、60、80、100、120min時各測定一次吸光度，計算吸光度的RSD為1.54%(n=7)，結果表明供試品溶液在120min內穩(wěn)定性良好。

2.1.8重復性試驗 精密稱量二仙膏(批號20190601)，共6份，置50ml燒杯中，按“2.1.2”項方法制備，精密吸取供試品溶液0.4ml，置25ml具塞試管中，按“2.1.6”項操作，在540nm處測定其吸光度，計算總皂苷的平均含量為8.10mg/g，RSD為3.53%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.1.9加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的批號為20190601的二仙膏6份，每份0.3000g，分別精密加入0.14mg/ml的齊墩果酸對照品溶液16.9ml，依“2.1.2”項制備供試品溶液，依法測定，測得齊墩果酸的平均回收率為96.77%，RSD為1.61%，表明該方法準確性良好。見表1。

表1 加樣回收率實驗結果

2.1.10樣品總皂苷的測定 精密稱取不同批次二仙膏0.6g，按“2.1.2”項制備供試品溶液，依法測定，計算總皂苷含量。見表2。

表2 樣品總皂苷測定實驗結果

2.2 二仙膏總糖的測定

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品6.0mg，加水溶解，并定容至50ml，搖勻，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取二仙膏2.0g，加3.0ml水溶解，過AB-8大孔樹脂柱(內徑2.4cm，高22.5cm)，用水洗脫3個柱體積，洗脫液濃縮，加水定容至50ml，從中精密吸取0.5ml，加水定容至100ml，混勻，即得。

2.2.3溶液的顯色 精密吸取葡萄糖對照品溶液或供試品溶液0.5ml，置25ml具塞試管中，加水至2ml，加0.2%蒽酮-濃硫酸溶液6.0ml，搖勻，置水浴中加熱15min，取出，放入冰浴中冷卻15min，用于吸光度測定。

2.2.4測定波長的選擇 分別精密量取葡萄糖對照品溶液和供試品溶液0.50ml，置于25ml具塞試管中，按照“2.1.3”項進行顯色，以相應試劑為空白對照，于400～800nm波長處掃描，結果顯示對照品溶液和樣品溶液均在620nm處有最大吸收，故確定檢測波長為620nm。

2.2.5標準曲線的繪制和線性范圍 分別精密吸取濃度為0.12mg/ml葡萄糖對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml置25ml具塞試管中，加水至2ml，精密加入0.2%硫酸-蒽酮溶液6.0ml，搖勻，置水浴中加熱15min，取出，放入冰浴中冷卻15min，在620nm處測定吸光度，計算回歸方程為：y=6.8708x+0.0231(r=0.9999)，表明葡萄糖在0.024～0.120mg/mL濃度范圍內與吸光度有良好的線性關系。見圖2。

圖2 葡萄糖對照品標準曲線

2.2.6精密度試驗 取同一供試品溶液(批號20190701)0.5ml，置25ml具塞試管中，按“2.2.3”項進行顯色，以空白溶劑同法處理作參比，于620nm波長下測定吸光度，平行測定吸光度值6次。計算吸光度的RSD為0.12%(n=6)，表明精密度良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一供試品溶液(批號20190701)0.5ml，置25ml具塞試管中，按“2.2.6”項操作，分別在0、20、40、60、80、100min時各測定一次吸光度，計算吸光度的RSD為0.71%(n=6)，結果表明供試品溶液在100min內穩(wěn)定性良好。

2.2.8重復性試驗 精密稱量二仙膏(批號20190701)，共6份，按“2.2.2”項方法制備，精密吸取供試品溶液0.5ml，置25ml具塞試管中，按“2.2.6”項操作，在620nm處測定其吸光度，計算總糖的平均含量為34.78%，RSD為3.58%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.9加樣回收率試驗 精密稱定已知含量的批號為20190701的二仙膏6份，每份1.0g，分別精密加入347.8mg的葡萄糖對照品，依“2.2.2”項制備供試品溶液，依法測定，測得葡萄糖的平均回收率為101.83%，RSD為0.92%，表明該方法準確性良好。見表3。

表3 加樣回收率試驗結果

2.2.10樣品總糖的測定 精密稱取不同批次二仙膏2.0g，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，依法測定，計算總糖含量。見表4。

表4 樣品總糖含量測定結果

注：二仙膏工藝中加入了約4倍清膏量的蜂蜜，故所測的總糖含量中有約80%來自蜂蜜，其他藥味中含總多糖約為8%。

3 討論

二仙膏有滋陰助陽，益氣養(yǎng)血的功效，結合文獻報道分析該藥的處方組成及方解，通過系統(tǒng)化學成分預試驗的方法，初步確定二仙膏中含量較高的有效成分主要有皂苷類、多糖類[9-12]。本文通過方法學考察，表明紫外可見分光光度法測定總皂苷及總糖的含量方法簡便、準確、靈敏度高、重復性好、穩(wěn)定性高，可作為二仙膏中總皂苷、總糖的含量測定方法。本文二仙膏中大類成分的含量測定，為后續(xù)其物質基礎研究和質量控制奠定了基礎。