一種PCR檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌株新方法的建立

邢楣 符林琳

重癥患者多為免疫力低下，抵抗細菌能力較低，長時間的住院治療，易出現(xiàn)院內感染的問題，尤其是耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌的感染[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）具有堅實的細胞壁，其對高溫及干燥具有很強的抵抗力的一種革蘭陽性球菌，80℃的條件下持續(xù)加熱30 min 才可能被殺滅[2]。19世紀60年代，世界第一例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的患者在英國被發(fā)現(xiàn)[3]。在甲氧西林金黃色葡萄球菌中存在一種與β-內酰胺類抗生素低親和力結合蛋白PBP2a，而甲氧西林敏感葡萄球菌中并不具有這一蛋白[4]。研究發(fā)現(xiàn)，這種蛋白是由mecA基因編碼表達的存在于甲氧西林敏感葡萄球菌細胞的表面，對β-內酰胺類抗生素有極低的親和力[5]。而mecA基因對于SA 耐藥性的產生具有至關重要的作用，細菌細胞之所以會產生耐受是由于PBPs 會被這種mecA基因編碼表達的蛋白抑制，從而使細菌在β-內酰胺類抗生素存在時不能發(fā)揮正常生理功能。PBP2a 可代替被抑制的PBPs 發(fā)揮作用，進而促使細菌得以生存。根據(jù)2011年美國臨床實驗室標準化協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦，可通過mecA基因的檢測確認甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）[6]。而既往比較常用的MRSA 檢測方法主要為紙片擴散法，但隨著研究的斷深入，有研究發(fā)現(xiàn)，由于金黃色葡萄球表達情況的各不相同，紙片擴散法存在較大誤差[7]?；蚓酆厦告湻磻≒CR）法被公認為臨床金黃色葡萄球菌檢測的標準[8]，但關于該實驗方法與紙片擴散檢查法的臨床綜合價值比較尚未明確。本試驗主要通過分析不同檢測方法對MRSA的檢出情況，旨在探討一種適合醫(yī)院檢測MRSA的簡便而可靠方法。

1 材料和方法

1.1 標本來源

收集2016年1月至2018年12月入住本院重癥加強護理病房（intensive care unit，ICU）的重癥患者的膿液、分泌物、血液等標本中分離培養(yǎng)病原菌株，且均為初次分離所得，所有菌株均來源于不同患者。

1.2 實時熒光PCR檢測

取樣本液體1 mL，10 000 rpm 離心后去除上清液后，將事先配制好20 μg/mL 的溶葡萄球菌酶加入到剛離心后的菌體沉淀中，震蕩器中震蕩后，待混合均勻后放置在水浴箱中靜置1 h，保持水溫在37℃，并注意隨時觀察離心管中的菌液是否會出現(xiàn)渾濁。待渾濁后，分別加入20 μL Proteinase K 溶液和220 μL 的GB 緩沖液，放在微型混合器上進行充分震蕩后，將其置于70℃的干式金屬浴恒溫器中，10 min 后，待溶液澄清透亮后，再加入220 μL 的無水乙醇，在微型混合器上充分震蕩后，待管內出現(xiàn)渾濁并伴隨著絮狀樣沉淀物出現(xiàn)后進行離心，將上清液保存于-20℃?zhèn)溆肹5]。然后根據(jù)耐甲氧西林mecA基因及NUC基因的保守區(qū)域來進行引物和TaqMan 探針的設計由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列為上游引物：5′-TAGTTGTAGTTGTCGGGT-3′，下游引物：5′-TATCGACGTTCAGTCAT-3′）并經BLAST 來檢驗引物和探針的特異性。最后將提取的核酸進行PCR 熒光檢測，并將熒光進行收集，擴增條件為94 ℃3 min 1個循環(huán)，93 ℃30 s、55 ℃45 s，40個循環(huán)[9]。耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌鑒定的標準[10]見表1。

表1 快速檢測MRSA結果判讀標準Table1 Rapid detection of MRSA results interpretation criteria

1.3 紙片擴散法

頭孢西丁及苯唑西林紙片擴散法（Kirby-Bauer，K-B法）均根據(jù)CLSI 的標準來進行試驗[10]。質控菌株為ATCC26859，苯唑西林瓊脂稀釋法質控菌株為ATCC25399。MH 及羊血培養(yǎng)基規(guī)格9 cm（江門凱林生產）。頭孢西丁擴散紙片及苯唑西林擴散紙片的規(guī)格均為30 μg（OXOID 生產）。紙片擴散法步驟：選取純培養(yǎng)的菌落將其配制成0.5 麥氏單位的菌懸液，15 min 內將校正過濃度的菌液接種完畢[11]。判斷標準[8，12]：金黃色葡萄球菌：頭孢西丁紙片上的抑菌圈＞22為敏感，否則為耐藥。苯唑西林紙片，抑菌圈的直徑＞12 mm為敏感，否則為耐藥。它的凝固酶陰性葡萄球菌，頭孢西丁紙片抑菌圈＞25 mm為敏感，否則即為耐藥，唑西林紙片抑菌圈直徑＞15 mm為敏感，否則為耐藥。微量瓊脂稀釋法：用Microscan 細菌鑒定儀測定苯唑西林最低抑制濃度（minimal inhibitory concentration，MIC），判斷標準遵循臨床實驗室標準化委員會制定[13]：MIC＞4 μg/mL為MRSA。

1.4 藥敏試驗及耐藥性分析

采用API 或全自動微生物分析儀（VITEK）鑒定系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）鑒定[14]。細菌敏感性測定采用紙片擴散法（K-B法）。藥敏試驗：參照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》（第三版）[15]進行。

2 結果

2.1 實時熒光PCR檢測mecA 方法和紙片擴散法檢測結果的比較

43 株金黃色葡萄球菌中實時熒光定量PCR 方法檢測到11例耐藥金黃色葡萄球菌陽性，其中頭孢西丁K-B 法與苯唑西林K-B 法中檢測出的耐藥金黃色葡萄球菌病例均在實時熒光PCR檢測的結果中，見表2、圖1。

表2 實時熒光PCR檢測mecA 方法和紙片擴散法檢測結果的比較Table2 Comparison of real-time fluorescent PCR method and paper diffusion method to detect mecA gene

圖1 樣本中mecA 基因實時熒光PCR檢測結果Figure1 Results of real-time fluorescent PCR detection of mecA gene in the sample

2.2 耐甲氧西林菌株樣本中耐甲氧西林金葡菌的檢測結果

11例耐甲氧西林mecA基因陽性的樣本中NUC基因陽性2例，這樣不僅具有耐甲氧西林mecA基因還具有NUC基因的即為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。見表3、圖2。

表3 耐甲氧西林菌株樣本中耐甲氧西林金葡菌的檢測結果Table3 Test results of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in methicillin-resistant strain samples

圖2 樣本中NUC 基因實時熒光PCR檢測結果Figure2 Results of real-time fluorescent PCR detection of NUC gene in the sample

2.3 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析

以mecA基因檢測呈陽性為“金標準”，所有耐甲氧西林金葡萄球菌對青霉素和苯唑西林均表現(xiàn)出極強的耐藥性，而在紅霉素和克林霉素中耐藥性較青霉素稍弱，對萬古霉素、替加環(huán)素、利奈唑胺、利福平均表現(xiàn)為敏感，對四環(huán)素、慶大霉素等具備一定的敏感性，見表4。

3 討論

金葡菌容易引起乳腺炎、癰、感染性休克、膿毒血癥等常見疾病[16]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的產生主要是由于金黃色葡萄球菌獲得了一種外源性插入到MRSA的基因片段-mecA基因，這種基因片段能夠編碼產生低親和力的青霉素結合蛋白（PBP）2a[17]。傳統(tǒng)的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢測方法為苯唑西林紙片擴散法及MRSA 篩選試驗等，這些方法只能篩選出部分耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，其準確度不能達到100%[18]。mecA基因對于SA 耐藥性的產生有著至關重要的作用，同時mecA的表達會受到遺傳背景等很多相關因素的影響，因此獲得性mecA葡萄球菌的耐藥水平從敏感到耐藥具有很大差異[19]。檢測金黃色葡萄球菌上的mecA基因，可作為MRSA 感染觀測的一項分子標記[20]。

表4 耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析Table4 Analysis of drug resistance of methicillin-resistant Staphylococcus aureus

根據(jù)以往的研究[21]可知，PBP2a 表達量的降低苛刻解除mecl 蛋白對mecA基因的抑制作用，從而促使mecA活化，進而對苯唑西林耐藥。故患者在治療中應避免使用一內酰胺類抗生素，減少其耐藥機會。而在本研究中，采用實時熒光PCR 方法檢測法準確度高于頭孢西丁及苯唑西林紙片擴散法，且所有耐甲氧西林金葡萄球菌對青霉素和苯唑西林均表現(xiàn)出極強的耐藥性，而對紅霉素和克林霉素中的耐藥性較青霉素稍有降低，對利奈唑胺、替加環(huán)素、萬古霉素、利福平均表現(xiàn)為敏感。由此可見，及時明確耐甲氧西林金葡萄球菌存在并分析其藥敏情況制定正確的治療方案對患者具有極為重。結合以往研究[22]和本組資料認為，實時熒光定量PCR 較傳統(tǒng)檢查方法檢測具有更加快速和準確的特點，且本組研究中所使用的利用實時熒光定PCR的方法設計了針對mecA基因的引物和Taqman 探針，以快速而特異的檢測，引起金黃色葡萄球菌對甲氧西林等β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的基因mecA。通過對各指標和條件的優(yōu)化使檢測過程中的反應體系和反應條件均達到最佳。且有研究[23-24]顯示，在實時熒光定量PCR檢測過程中，實時熒光定量PCR 可以在PCR 反應過程中直接檢測熒光信號，無需配膠、電泳等步驟，可以更加快速有效地鑒別出MRSA，且可以對靶位基因進行定量檢測，由此更高程度地提高了檢測結果的準確性。

綜上所述，在采用mecA基因作為目標基因檢測出的耐甲氧西林葡萄球菌基礎上，再以金黃色葡萄球菌特異性凝固酶基因NUC基因特異性引物探針檢測來測定。與頭孢西丁紙片擴散法和苯唑西林紙片擴散法相比較而言，前者檢測其是否為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的準確度更高，特異性更好，能夠更準確檢測出耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，值得進一步研究推廣。