HPLC分析方法驗(yàn)證中有關(guān)問題再探討

夏振華，劉文志，韓新榮，原潞潞

1 亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，運(yùn)城 044602；2 廣州科銳特生物科技有限公司，廣州 510530；3 江蘇艾蘇萊生物科技有限公司，蘇州 215123

藥品測(cè)定的準(zhǔn)確性通常是通過控制分析方法的誤差來達(dá)到的，而分析方法是否準(zhǔn)確必須經(jīng)過分析方法的驗(yàn)證來考察。因此分析方法驗(yàn)證是保證藥物分析結(jié)果準(zhǔn)確性的前提和基礎(chǔ)。對(duì)于制藥企業(yè)而言，分析方法驗(yàn)證是保證藥品質(zhì)量可控的重要環(huán)節(jié)，同時(shí)也是企業(yè)技術(shù)水平的直接體現(xiàn)，無論企業(yè)的新藥報(bào)批、還是國(guó)外注冊(cè)和GMP檢查，都有關(guān)于分析方法驗(yàn)證的明確要求。

《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[1]、美國(guó)藥典[2]及ICH[3]分析方法驗(yàn)證都制定有相應(yīng)的指導(dǎo)原則，但均很寬泛，鮮有具體操作或說明規(guī)定的理由，以至于日常驗(yàn)證中對(duì)技術(shù)要求和法規(guī)要求產(chǎn)生理解上的偏差。如僅僅通過信噪比即確定方法的定量限，把線性的范圍等同于定量的范圍，沒有關(guān)注樣品的處理過程的驗(yàn)證；又如振搖溶出參數(shù)、樣品溶液濃度、濾膜的相容性等驗(yàn)證內(nèi)容以及系統(tǒng)適用性參數(shù)的制定不是根據(jù)驗(yàn)證的耐用性結(jié)果來制定的，有關(guān)物質(zhì)的精密度測(cè)定的樣品使用不含有待測(cè)有關(guān)物質(zhì)等?？傊枰斫怛?yàn)證的真正目的和質(zhì)量控制的基本原理，才能把握正確操作，使分析方法驗(yàn)證能真正起到保證藥品質(zhì)量控制的作用。

1 關(guān)于分析方法生命周期問題

近年來，ICH和《美國(guó)藥典》納入了[4]生命周期管理的理念，《美國(guó)藥典》甚至直接將“分析方法的生命周期”作為一個(gè)新的通用章節(jié)（1220）予以收錄。

分析方法的生命周期分三個(gè)階段：①設(shè)計(jì)和開發(fā)階段；②驗(yàn)證階段；③持續(xù)監(jiān)測(cè)階段。分析方法的驗(yàn)證不是孤立的一項(xiàng)工作，它和分析方法的開發(fā)，甚至分析方法的設(shè)計(jì)分不開的，分析方法開發(fā)和驗(yàn)證是一個(gè)有機(jī)整體，即使分析方法驗(yàn)證完成后，仍需要在分析方法的生命周期中用于常規(guī)的放行或穩(wěn)定性測(cè)試中持續(xù)監(jiān)測(cè)分析方法的性能，以及測(cè)定結(jié)果是否滿足質(zhì)量控制要求，這是分析方法驗(yàn)證的最后一個(gè)階段，直至分析方法的終止。分析方法驗(yàn)證和產(chǎn)品持續(xù)穩(wěn)定性考察原理相同，重要性也是相當(dāng)?shù)?；因此建議企業(yè)年度報(bào)告中增加一項(xiàng)分析方法的性能總結(jié)等內(nèi)容，如分析一年共有多少OOS（超標(biāo)）和OOT（超趨勢(shì)）是由于分析方法本身的缺陷而引起的，并制訂糾正預(yù)防措施，以便對(duì)所采用的分析方法進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)。目前國(guó)內(nèi)幾乎沒有企業(yè)進(jìn)行這項(xiàng)工作，法規(guī)檢查也忽略了這一重要內(nèi)容。

2 關(guān)于分析方法的專屬性

2.1 峰純度問題

專屬性是建立分析方法首先要考慮的問題，否則往往會(huì)導(dǎo)致測(cè)定的系統(tǒng)誤差，而且在日常測(cè)定中很難發(fā)現(xiàn)，尤其當(dāng)多個(gè)組分出峰完全重疊時(shí)，需要通過驗(yàn)證專屬性的峰純度加以考察。對(duì)于老產(chǎn)品的專屬性的驗(yàn)證，使用過期樣品進(jìn)行峰純度測(cè)定可能比強(qiáng)制降解樣品更為科學(xué)，此外需要注意實(shí)際驗(yàn)證中經(jīng)常出現(xiàn)峰純度“假合格”和“假不合格”現(xiàn)象?！凹俸细瘛敝饕捎跈z測(cè)技術(shù)的限制使峰重疊等情況未能鑒別；但“假不合格”情況更多，主要是樣品響應(yīng)過高或過低、波長(zhǎng)選擇接近流動(dòng)相中的有機(jī)相截止波長(zhǎng)，緩沖鹽的濃度過高或流動(dòng)相附加劑的純度等因素影響所致。

2.2 物料平衡問題

強(qiáng)制降解的物料平衡是廣大分析工作者最為頭痛的問題，分析方法驗(yàn)證的指導(dǎo)原則中沒有關(guān)于降解條件的特別規(guī)定，因此做法各不相同。由于物料平衡主要是考察分析方法能否將所有雜質(zhì)有效檢出，所以含量測(cè)定沒有必要進(jìn)行物料平衡的考察，物料平衡的接受范圍問題，至今沒有統(tǒng)一的規(guī)定，其實(shí)以后也很難統(tǒng)一，需要具體情況具體分析。根據(jù)樣品中各組分性質(zhì)、降解率大小、強(qiáng)制降解雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中雜質(zhì)限度要求等因素作綜合考慮，建議平衡率設(shè)置為95.0%～105.0%較為合適。有些企業(yè)將其制定為98.0%～102.0%，接受標(biāo)準(zhǔn)過于嚴(yán)格，只考慮HPLC方法本身誤差，沒有考慮未知雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)、介質(zhì)pH等因素的影響；也有些企業(yè)對(duì)于制劑考慮到輔料的影響，將平衡率制定為90.0%～110.0%，又過于寬松，失去物料平衡考察的意義。

2.3 分離度的計(jì)算問題

分離度是HPLC法測(cè)定中重要的系統(tǒng)適用性參數(shù)，也是專屬性的重要考察參數(shù)之一，對(duì)于拖尾峰和峰形不好的峰，現(xiàn)代的色譜積分技術(shù)基本均能夠很好解決分離度的計(jì)算問題，對(duì)于分離不好，尤其是色譜峰峰響應(yīng)差別大的兩組分不完全分離的情形，積分技術(shù)很難科學(xué)解決，改善分離成為唯一手段?！吨袊?guó)藥典》2020版征求意見稿[5]和《美國(guó)藥典》[6]均有二種方法即峰底寬法和半峰寬法，其實(shí)兩者本質(zhì)均一樣；《歐洲藥典》[7]有兩種計(jì)算方法，即半峰寬法和峰谷比法（p/v法）。但對(duì)于兩個(gè)組分響應(yīng)相差很大或一個(gè)組分由于過載產(chǎn)生嚴(yán)重變形時(shí)，這些傳統(tǒng)的分離度公式均不適用，會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏低或偏高，不能有效地反映真正的分離情況。此時(shí)如采用峰谷比法[7]或使用柱效、選擇性和容量因子的公式進(jìn)行計(jì)算[8]更為科學(xué)，可惜各國(guó)藥典均沒有收載這一科學(xué)的分離度計(jì)算方式。

2.4 空白輔料峰的問題

盡管待測(cè)溶液已過濾了空白輔料變得澄清，但測(cè)定溶液中空白輔料成分依然可達(dá)主成分濃度的幾倍甚至幾百倍以上，在進(jìn)樣后使流動(dòng)相體系產(chǎn)生瞬間的波動(dòng)，導(dǎo)致在死時(shí)間附近出現(xiàn)輔料峰，該峰往往是輔料的折、散射產(chǎn)生的峰，而不其吸收產(chǎn)生的，所以其響應(yīng)并不遵循朗伯比爾定律，有時(shí)同樣配方量的空白輔料和空白片產(chǎn)生的峰面積相差很大，不同品牌的輔料甚至同一品牌不同貯存條件、不同時(shí)間產(chǎn)生的峰也不一致，鑒于輔料峰的復(fù)雜性以及工藝的保密性，實(shí)際工作中如出現(xiàn)輔料產(chǎn)生的峰，一定要進(jìn)行詳細(xì)的調(diào)查，弄清是什么輔料、什么原因產(chǎn)生的，而不能簡(jiǎn)單地在檢驗(yàn)規(guī)程中要求進(jìn)樣空白輔料溶液，這樣既不科學(xué)也不現(xiàn)實(shí)。

3 關(guān)于分析方法驗(yàn)證的精密度

實(shí)際測(cè)定時(shí)雖然精密度好，但由于方法或測(cè)定儀器等系統(tǒng)誤差因素，往往準(zhǔn)確度未必好，但反之，精密度不好、準(zhǔn)確度很難得到保證，因?yàn)闇y(cè)定的準(zhǔn)確度是建立在良好的精密度基礎(chǔ)上的，所以日常測(cè)定是通過測(cè)定平行樣品，考察測(cè)定誤差來達(dá)到控制準(zhǔn)確度的目的。在日常驗(yàn)證過程中，精密度測(cè)定時(shí)常見以下一些問題：

3.1 有關(guān)物質(zhì)和殘留溶劑的精密度

在有關(guān)物質(zhì)和殘留溶劑的精密度測(cè)定時(shí)，當(dāng)使用樣品測(cè)定結(jié)果為未檢出，由于分析方法是適用于符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)或不符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的所有樣品，所以應(yīng)該在樣品中加入適量的（如限度的50%～100%）待測(cè)雜質(zhì)對(duì)照品，測(cè)定其含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）考察精密度是否符合測(cè)定要求，如不是同一貯備液進(jìn)行稀釋，由于貯備液取樣量不同，需要通過計(jì)算回收率的RSD%來考察精密度是否符合測(cè)定要求。

對(duì)于有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定方法的精密度驗(yàn)證，除考察其含量的精密度外，還要考察忽略限以上雜質(zhì)個(gè)數(shù)是否一致，這常被忽視。此外，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中如規(guī)定最大未知單一雜質(zhì)時(shí)，需標(biāo)明最大單一雜質(zhì)的保留時(shí)間或相對(duì)保留時(shí)間，防止不同樣品測(cè)定時(shí)最大單一雜質(zhì)的峰發(fā)生改變而失去統(tǒng)計(jì)意義。

3.2 含量均勻度

對(duì)于使用含量均勻度測(cè)定結(jié)果作為含量放行數(shù)據(jù)的分析方法，其精密度的驗(yàn)證就比較復(fù)雜，由于含量均勻度一般取10片/粒藥物來測(cè)定結(jié)果的平均值，作為含量放行數(shù)據(jù)，同時(shí)計(jì)算A+2.2S值作為均勻度考察的指標(biāo)，在該情況下，含量的精密度驗(yàn)證應(yīng)該按照含量均勻度的10份而不是6份測(cè)定結(jié)果進(jìn)行精密度考察，即每人測(cè)定10份，2人共20份，計(jì)算A+2.2S值作為考察指標(biāo)，并與同批通過研磨或混合手段取得均勻樣本測(cè)定的含量進(jìn)行比較。

3.3 精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)問題

《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[1]對(duì)精密度的接受標(biāo)準(zhǔn)有詳細(xì)規(guī)定，但這些指標(biāo)值只考慮濃度對(duì)誤差的影響，沒有考慮方法操作（如預(yù)處理過程）、儀器本身等影響因素。藥典也規(guī)定了適當(dāng)放寬情況，所以可以根據(jù)實(shí)際情況制定接受標(biāo)準(zhǔn)，如對(duì)于含量RSD%接受標(biāo)準(zhǔn)一般為≤2.0%，但這個(gè)不是絕對(duì)的，對(duì)于原料藥或范圍要求很窄的制劑（制劑含量范圍主要是考慮生產(chǎn)和工藝的波動(dòng)范圍，適當(dāng)考慮分析測(cè)定的誤差范圍），應(yīng)該制定更小的RSD%接受標(biāo)準(zhǔn)，如≤1.0%，以保證方法能夠滿足質(zhì)量控制的要求。對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定方法驗(yàn)證的精密度接受標(biāo)準(zhǔn)列于表1供驗(yàn)證時(shí)參照使用，此表也適用于殘留溶劑等微量成分的定量測(cè)定。

表1 雜質(zhì)測(cè)定方法精密度接受標(biāo)準(zhǔn)推薦表

4 關(guān)于分析方法驗(yàn)證的檢測(cè)限和定量限

任何測(cè)定方法包括測(cè)定儀器都有其靈敏度的限制，對(duì)于微量組分的測(cè)定，考察檢測(cè)限和定量限非常必要，對(duì)于低于檢測(cè)限的測(cè)定結(jié)果應(yīng)為未檢出（Not detected或ND表示），對(duì)于＞檢測(cè)限、但低于定量限的測(cè)定結(jié)果，建議結(jié)果表達(dá)為低于定量限（below quantitation limit，BQL），只有高于定量限才可能準(zhǔn)確報(bào)告檢測(cè)數(shù)據(jù)，對(duì)于＜忽略限的測(cè)定結(jié)果通常使用低于忽略限（below disregard limit，BDL），但需要注明忽略限的具體規(guī)定如0.03%，此外忽略限不能＜定量限。關(guān)于檢測(cè)限和定量限需要注意以下幾個(gè)問題：

4.1 信噪比法的缺陷

ICH[3]信噪比法測(cè)定檢測(cè)限和定量限，是將儀器的靈敏度測(cè)定方法用于分析方法，不太科學(xué)；因?yàn)榇郎y(cè)組分和噪音的響應(yīng)受儀器、柱效、試劑等影響，信噪比法測(cè)定的檢測(cè)限和定量限不具有普遍意義上的代表性，只是一個(gè)偶然值，根據(jù)定量限原理，信噪比不＜10，必須所有測(cè)定結(jié)果（如通常6次）均不＜10，不能取平均值不＜10，也沒有必要制訂一個(gè)范圍如8～12。此外，對(duì)所有定量限下測(cè)定峰面積的偏差需要制定一個(gè)接受標(biāo)準(zhǔn)，如RSD%≤10%，以彌補(bǔ)精密度測(cè)定沒有考察定量限濃度下的精密度，同時(shí)定量限濃度需要符合線性和準(zhǔn)確度要求，只有這幾個(gè)條件全部具備才能確定為定量限，為此，通常先根據(jù)質(zhì)量控制要求確定一個(gè)忽略限，然后直接進(jìn)行信噪比測(cè)定，關(guān)注信噪比是否不＜10，不必考慮信噪比的具體數(shù)值是多少。由于信噪比法測(cè)定定量限值影響因素多，波動(dòng)大，所以定量限除考察信噪比外，還應(yīng)制訂定量限不＞雜質(zhì)限度的50%或更低的要求，以彌補(bǔ)這一不足，如果定量限接近限度值，建議使用限度法進(jìn)行雜質(zhì)控制，而不能使用定量法進(jìn)行限度的質(zhì)量控制?；陧憫?yīng)值標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率法，雖然和信噪比法原理相同，但比信噪比法結(jié)果重現(xiàn)性更好些，似乎有代替信噪比法的趨勢(shì)。

4.2 關(guān)于噪音的測(cè)定

噪音的測(cè)定非常講究，除應(yīng)該選擇平滑的地方外，還建議應(yīng)該在離目標(biāo)峰附近前后兩段進(jìn)行，取其最高者；因?yàn)橹挥心繕?biāo)峰附近的噪音才影響目標(biāo)物的測(cè)定，遠(yuǎn)離目標(biāo)峰噪音再大也不影響測(cè)定。測(cè)定噪音的時(shí)間30秒，如果成分多，以梯度洗脫方法15秒即可，因?yàn)?5秒兩組分已能很好地分離，目前所有組分用某一段相同的基線測(cè)噪音并不太科學(xué)（除非基線很一致），收集60秒以上更沒必要，是自找麻煩的做法。

4.3 忽略限制定問題

忽略限和報(bào)告限數(shù)據(jù)值相同，但含義不同，前者為方法中的一部分，后者為制訂雜質(zhì)質(zhì)量控制策略提供依據(jù)。制定忽略限需要根據(jù)方法和測(cè)定質(zhì)量控制的要求，以及法規(guī)要求等因素綜合考慮，由于儀器的噪音等因素，使用HPLC法測(cè)定雜質(zhì)時(shí)，雖然《中國(guó)藥典》沒有提及忽略限，但在實(shí)際工作中制定了忽略限，將＜忽略限的峰不予計(jì)算，減少不少麻煩，ICH對(duì)報(bào)告限有具體規(guī)定，但只是基本要求，建議日常工作中制定更為嚴(yán)格要求容易獲得專家的認(rèn)可。通常將忽略限規(guī)定為0.03%，但不能一概而論，具體制定策略需要根據(jù)方法本身的噪音大小、雜質(zhì)限度大小等因素來制定。原則上忽略限為雜質(zhì)限度的1/5以下，如1/5計(jì)算值＞0.03%，取0.03%，如＜0.03%取1/5計(jì)算值，忽略限必須不能＜定量限，對(duì)于穩(wěn)定性考察的測(cè)定由于需要進(jìn)行趨勢(shì)分析，建議直接將定量限作為報(bào)告限更有適用性。

5 關(guān)于分析方法驗(yàn)證的線性和范圍

線性關(guān)系考察是定量分析的基礎(chǔ)和必要條件，定量是基于呈一元一次方程的線性關(guān)系進(jìn)行的，對(duì)于不呈線性的方法，可以通過轉(zhuǎn)換，如HPLC-ELSD檢測(cè)或使用二次擬合曲線法，如HPLC-CAD檢測(cè)，但線性不是定量的充分條件，呈線性未必能夠準(zhǔn)確定量；這特別多見于低濃度受輔料干擾（線性一般只使用對(duì)照品進(jìn)行）以及有背景吸收和扭曲效應(yīng)等影響的情況，所以此時(shí)還需要考察方程的準(zhǔn)確度和精密度，確定測(cè)定范圍。此外，除了考察相關(guān)系數(shù)以確定是否呈線性外，還必須考察回歸方程的截距問題，通常使用兩種方法：一種為Y軸截距絕對(duì)值與標(biāo)準(zhǔn)（100%）之比法；另一種為剩余標(biāo)準(zhǔn)差標(biāo)準(zhǔn)（100%）之比法。兩種方法均能反映截距的大小，對(duì)于含量應(yīng)該不＞2%，對(duì)于有關(guān)物質(zhì)和殘留溶劑應(yīng)該不＞25%（建議不＞15%更科學(xué)），如果截距不符合要求，不能說明方法不能定量，只是不能采用常用的一個(gè)對(duì)照濃度進(jìn)行測(cè)定，需要每次測(cè)定時(shí)采用多個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行。

《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[1]參照ICH要求報(bào)告殘差平方和，這一指標(biāo)是考察線性的各點(diǎn)偏離程度，是考察線性斜率、截距、線性的綜合的標(biāo)準(zhǔn)，無法制定統(tǒng)一可建議的接受標(biāo)準(zhǔn)，法規(guī)上通常是要求報(bào)告殘差平方和的數(shù)值，用于評(píng)定方法的優(yōu)劣。

6 關(guān)于分析方法驗(yàn)證的準(zhǔn)確度

雖然檢測(cè)永遠(yuǎn)不能測(cè)定到待測(cè)成分的真實(shí)含量，但測(cè)定結(jié)果盡量接近真值是分析工作者的最高目標(biāo)。雖然加樣回收率對(duì)于某些樣品由于崩解溶出等因素的影響不能完全反映準(zhǔn)確度，但其仍然是驗(yàn)證方法準(zhǔn)確度最好的方法，了解以下幾個(gè)問題對(duì)于準(zhǔn)確度的測(cè)定會(huì)有裨益。

6.1 《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[1]關(guān)于回收率的接受標(biāo)準(zhǔn)為非對(duì)稱范圍，如98%～101%，因?yàn)椴豢赡苡谢衔锖砍^100%，超過100%部分完全是分析誤差，所以原料藥的標(biāo)準(zhǔn)范圍呈非對(duì)稱，如98.5%～101.0%，而加樣回收率不同，真實(shí)含量為100%的上下波動(dòng)，呈對(duì)稱的正態(tài)誤差分布，這一規(guī)定誤導(dǎo)分析方法允許存在系統(tǒng)誤差，即高于100%的誤差小于低于100%的誤差，藥典表2中的回收率范圍小數(shù)點(diǎn)位數(shù)不科學(xué)，98%～101%應(yīng)為98.0%～101.0%，此外還有其他諸多問題，建議實(shí)際工作中不予采納，對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定方法驗(yàn)證的回收率范圍及誤差接受標(biāo)準(zhǔn)，列于表2供驗(yàn)證時(shí)參照使用，此表適用于殘留溶劑等微量成分的定量測(cè)定。

表2 雜質(zhì)回收率范圍及誤差表

6.2 對(duì)于有關(guān)物質(zhì)（包括溶劑殘留）的定量測(cè)定，由于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定不是范圍，僅是限度，所以應(yīng)該分兩部分進(jìn)行，即在LOQ的濃度下和限度附近（限度的50%、100%和150%），其中限度濃度是決定產(chǎn)品合格不合格的關(guān)鍵濃度，是風(fēng)險(xiǎn)最大的區(qū)域，所以需要在該濃度的附近進(jìn)行準(zhǔn)確度的測(cè)定，不做50%的限度濃度是不科學(xué)，回收率范圍一般規(guī)定為80.0%～120.0%，9次測(cè)定結(jié)果的RSD應(yīng)≤10.0%，如果限度濃度高，可以嚴(yán)格到90.0%～110.0%，甚至95.0%～105.0%，而LOQ濃度比較低，加上遠(yuǎn)離限度值，風(fēng)險(xiǎn)較小，回收率范圍可以適當(dāng)放大到70%～130%，根據(jù)驗(yàn)證回收率來制訂內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不失為一種科學(xué)的方法，如回收率為85.0%，考慮方法的準(zhǔn)確度，限度可以從0.2%修訂為0.17%。

6.3 對(duì)于有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，由于雜質(zhì)對(duì)照品較難獲得，常常使用與主成分相比進(jìn)行測(cè)定，由于雜質(zhì)和主成分的結(jié)構(gòu)不同，響應(yīng)可能不同，需要進(jìn)行校正才能測(cè)定真實(shí)含量，否則為表觀含量?！吨袊?guó)藥典》2020版征求意見稿[5]和《歐洲藥典》[7]使用的為校正因子，而《美國(guó)藥典》[6]使用的是響應(yīng)因子，兩者互為倒數(shù)關(guān)系，對(duì)于質(zhì)量型檢測(cè)器由于響應(yīng)與待測(cè)組分的質(zhì)量關(guān)系，所以通常不需要測(cè)定校正因子。

校正因子最好為不同儀器和人員，至少測(cè)定兩次，允許誤差一般為10%，這是基于雜質(zhì)回收率要求在90.0%～110.0%，這也就是國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心[9]規(guī)定0.9～1.1可不需要校正的原因，《英國(guó)藥典》要求將0.8～1.2可不進(jìn)行校正，此規(guī)定范圍過于寬松，建議不予采用。此外，如藥典方法進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)時(shí)，和藥典規(guī)定值比較誤差也應(yīng)在10%內(nèi)，由于影響校正因子準(zhǔn)確的因素很多，如對(duì)照品含量誤差（如吸水）、保留時(shí)間差別大、峰型差別大（如拖尾嚴(yán)重）、DAD和紫外檢測(cè)器的差別、鹽類藥物對(duì)照品沒有折算成活性部分等，鑒于藥典校正因子的測(cè)定次數(shù)多，日常測(cè)定盡量使用藥典的校正因子進(jìn)行。

即使校正因子在0.9～1.0之間，建議按照實(shí)際測(cè)定校正因子的數(shù)值進(jìn)行，可避免多次測(cè)定結(jié)果值在邊緣上下的時(shí)候處理數(shù)據(jù)的麻煩，如校正因子發(fā)生改變，必須對(duì)以前測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)估，特別是校正因子變大的情形。鑒于校正因子重要性，不管結(jié)果是否＜1.0，其結(jié)果建議均應(yīng)保留小數(shù)點(diǎn)二位。

雜質(zhì)的校正因子的測(cè)定有多種方法，但使用雜質(zhì)線性的斜率和主成分的線性斜率比最為常見，雜質(zhì)的線性最大濃度為限度的150%（或120%濃度），最低濃度為定量限（或忽略限濃度），但主成分的線性濃度要考慮不同限度要求的雜質(zhì)以及低濃度的因素，最大濃度的確定比較復(fù)雜，建議使用最大的限度值的雜質(zhì)的150%，或測(cè)定的對(duì)照低濃度的150%（兩者取最大者）進(jìn)行，以滿足所有雜質(zhì)測(cè)定的要求。

6.4 雖然討論的主要針對(duì)HPLC法，對(duì)于頂空氣相色譜準(zhǔn)確度的驗(yàn)證，需要關(guān)注的是由于其測(cè)定原理是氣液平衡，測(cè)定的是相對(duì)回收率，所以影響組分的氣液平衡的因素在方法開發(fā)和方法驗(yàn)證中均要考慮，特別是對(duì)照溶液和樣品溶液的溶質(zhì)有很大差別，樣品溶液中含有高濃度的樣品，存在樣品的基質(zhì)效應(yīng)，該效應(yīng)有時(shí)是正效應(yīng)，有時(shí)是負(fù)效應(yīng)，正效應(yīng)導(dǎo)致回收率偏高，負(fù)效應(yīng)導(dǎo)致回收率偏低，具體與待測(cè)組分的結(jié)構(gòu)、沸點(diǎn)、性質(zhì)、稀釋劑的種類有關(guān)，基質(zhì)效應(yīng)是頂空最大難題，在滿足測(cè)定要求情況下減少樣品量可以減少基質(zhì)效應(yīng)，但不能徹底消除，徹底消除基質(zhì)效應(yīng)的最好方法是采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行測(cè)定。

6.5 制劑和原料藥的主成分含量的準(zhǔn)確度測(cè)定濃度選擇范圍均在80%、100%、120%三個(gè)濃度下進(jìn)行，但其目的并不相同，制劑的標(biāo)示量通常在90.0%～110.0%，考慮到風(fēng)險(xiǎn)問題以及方法的適用性，所以在80.0%～120.0%濃度范圍進(jìn)行，而原料藥是基于藥典精密稱量約的含義為±10%，即供試品濃度的90.0%～110.0%，同樣考慮到風(fēng)險(xiǎn)問題以及方法適用性更廣的原因，適當(dāng)放寬為80.0%～120.0%濃度范圍，對(duì)于中藥，由于其主成分復(fù)雜，通常放寬到50%～150%的濃度范圍。

《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[1]規(guī)定如不能得到輔料全部成分，使用樣品加入待測(cè)對(duì)照成分進(jìn)行回收率考察，這樣操作會(huì)導(dǎo)致實(shí)際待測(cè)成分均在測(cè)定濃度之上，沒有包含低于測(cè)定濃度的準(zhǔn)確度情況，而低于標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定測(cè)定邊緣數(shù)據(jù)得不到驗(yàn)證，存在極大風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于企業(yè)而言，在知曉處方和工藝情況下，最好進(jìn)行模擬處方法進(jìn)行回收率試驗(yàn)。

7 關(guān)于分析方法驗(yàn)證的耐用性

分析用儀器雖然經(jīng)過校正，但允許存在一定的誤差，如紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)允許±1 nm，柱溫允許±1 ℃～2 ℃等，分析方法沒有規(guī)定一定要在驗(yàn)證方法儀器上測(cè)定，是所有經(jīng)過校正合格的儀器上都能適用。此外，還有一個(gè)目的，是通過耐用性測(cè)定，在耐用性變動(dòng)參數(shù)范圍內(nèi)改變均不算改變方法，比如流速，雖然儀器流速誤差小，但仍然進(jìn)行有±10%～20%的變動(dòng)耐用性考察，主要是實(shí)際測(cè)定時(shí)為了保證符合系統(tǒng)適用性要求對(duì)某些參數(shù)進(jìn)行調(diào)節(jié)。耐用性還要發(fā)現(xiàn)方法的風(fēng)險(xiǎn)點(diǎn)，為以后日常測(cè)定出現(xiàn)異常提供一些參考的信息。

7.1 耐用性除測(cè)定系統(tǒng)適用性參數(shù)外，還需測(cè)定目標(biāo)物的含量并與正常測(cè)定條件作比較，在規(guī)定范圍內(nèi)，對(duì)于雜質(zhì)測(cè)定方法還需要統(tǒng)計(jì)雜質(zhì)個(gè)數(shù)和最大未知雜質(zhì)的保留時(shí)間或相對(duì)保留時(shí)間，以考察不同條件下方法的檢測(cè)能力是否耐用。

7.2 關(guān)于耐用性波長(zhǎng)的考察，《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[1]沒有提及，主要是否進(jìn)行波長(zhǎng)微小變化的考察取決于測(cè)定方法，如HPLC法采用紫外檢測(cè)器測(cè)定主成分時(shí)，往往利用同一結(jié)構(gòu)的對(duì)照品進(jìn)行比較，由于對(duì)照品和測(cè)定的主成分結(jié)構(gòu)相同，其紫外吸收相同，所以耐用性就沒有必要進(jìn)行不同波長(zhǎng)的耐用性考察，但如與主成分比較測(cè)定雜質(zhì)，由于雜質(zhì)和主成分結(jié)構(gòu)不同，不同波長(zhǎng)的校正因子不同，不同儀器波長(zhǎng)存在一定的偏差如±2 nm，所以即使《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[5]規(guī)定分析方法的波長(zhǎng)不能改變，但耐用性驗(yàn)證需要考察不同波長(zhǎng)情況下的測(cè)定結(jié)果，如波長(zhǎng)參數(shù)耐用性不好，建議改為外標(biāo)法，也可重新選擇測(cè)定波長(zhǎng)，使雜質(zhì)和主成份在該波長(zhǎng)附近紫外吸收曲線趨勢(shì)盡量一致。

7.3 耐用性參數(shù)的變化在考慮儀器和計(jì)量誤差范圍外適當(dāng)放寬即可，如果變化值放得過寬，會(huì)引起耐用性失敗，如柱溫，通常柱溫箱的溫度精度為±2 ℃，耐用性只需做到±3 ℃即可，同樣，波長(zhǎng)變化范圍±2 nm（或±3 nm）。耐用性結(jié)果如發(fā)現(xiàn)分析條件對(duì)測(cè)定結(jié)果影響很大，必須在方法中予以說明，如緩沖液pH的變化范圍±0.2，出現(xiàn)耐用性不好，可以嚴(yán)格到±0.1，但必須在分析方法中注明（不注明可視為±0.2）。

7.4 對(duì)照品溶液和樣品溶液穩(wěn)定性考察可以在耐用性中進(jìn)行，因?yàn)閷?duì)照品溶液需要作為控制對(duì)照在檢測(cè)最后測(cè)定，以考察系統(tǒng)是否漂移。而樣品溶液需要在穩(wěn)定性情況下才具有代表性，測(cè)定時(shí)儀器不關(guān)閉才有驗(yàn)證意義，這和貯備液的穩(wěn)定性考察不同，后者不是方法本身一部分，是為了節(jié)省對(duì)照品的用量而采取的管理上的措施，不需要在方法驗(yàn)證中同時(shí)進(jìn)行，切不可混淆。

8 關(guān)于分析方法驗(yàn)證的系統(tǒng)適用性

系統(tǒng)適用性是保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的前提，分析方法驗(yàn)證不管進(jìn)行什么項(xiàng)目的驗(yàn)證，均應(yīng)作系統(tǒng)適用性的測(cè)定，以考察測(cè)定是否有效？如果測(cè)定方法中對(duì)照溶液參與測(cè)定計(jì)算還應(yīng)進(jìn)行檢查對(duì)照的測(cè)定，以考察工作對(duì)照的容量操作是否有問題？如測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，還應(yīng)該進(jìn)行控制對(duì)照的測(cè)定，以考察整個(gè)測(cè)定過程中系統(tǒng)是否漂移？如果方法比較穩(wěn)定，不必在測(cè)定過程中定期測(cè)定控制對(duì)照。此外，在驗(yàn)證總結(jié)中需將所有的系統(tǒng)適用性的數(shù)據(jù)予以列出，以利于評(píng)審專家的審評(píng)。

9 方法確認(rèn)和方法轉(zhuǎn)移

分析方法確認(rèn)和分析方法轉(zhuǎn)移是一個(gè)比較經(jīng)濟(jì)的驗(yàn)證分析方法，也是準(zhǔn)確性的方式，《中國(guó)藥典》2020版征求意見稿[10，11]專門增加了分析方法確認(rèn)和分析方法轉(zhuǎn)移兩個(gè)指導(dǎo)原則，從法規(guī)上給予分析方法確認(rèn)和分析方法轉(zhuǎn)移的合法地位，是新版藥典的亮點(diǎn)之一。雖然指導(dǎo)原則比較原則，但其意義很大，如制劑企業(yè)購(gòu)買的原料藥、輔料，其驗(yàn)證工作量巨大，如采用分析方法轉(zhuǎn)移的方式可大大減輕企業(yè)負(fù)擔(dān)，方法轉(zhuǎn)移可以同一公司不同部門，也可以不同公司之間，但產(chǎn)品的生產(chǎn)工藝或處方必須完全一致，否則只能驗(yàn)證或確認(rèn)。轉(zhuǎn)移方式有4種[11]，即比對(duì)試驗(yàn)、共同驗(yàn)證、再驗(yàn)證、轉(zhuǎn)移豁免，其中比對(duì)測(cè)試最為常用。

方法確認(rèn)系藥典方法，由于方法內(nèi)容、樣品情況不同，方法確認(rèn)的項(xiàng)目指導(dǎo)原則[10]未作出具體規(guī)定，需要根據(jù)實(shí)際情況經(jīng)過科學(xué)評(píng)估進(jìn)行選擇，由于原料藥沒有輔料的干擾和不存在崩解等因素，確認(rèn)對(duì)于原料藥較為適用，一般進(jìn)行專屬性、精密度和線性范圍三個(gè)項(xiàng)目，分別考察干擾情況、測(cè)定誤差和定量基礎(chǔ)是否影響測(cè)定方法的準(zhǔn)確度，如雜質(zhì)的微量測(cè)定方法，還需要作定量限和檢測(cè)限的測(cè)定，以考察方法靈敏度，對(duì)于制劑測(cè)定方法，由于輔料及工藝對(duì)測(cè)定方法準(zhǔn)確度影響的復(fù)雜性，不建議進(jìn)行確認(rèn)，即使確認(rèn)，除非有足夠的科學(xué)評(píng)估，否則確認(rèn)項(xiàng)目為除了耐用性外的其他所有驗(yàn)證項(xiàng)目。

10 其 他

10.1 對(duì)照品標(biāo)化所采用分析方法應(yīng)該經(jīng)過驗(yàn)證，但驗(yàn)證需要標(biāo)化后的對(duì)照品才能進(jìn)行，這就存在“先有雞還是先有蛋”的矛盾，如何解決這一問題，建議將對(duì)照品的標(biāo)化和分析方法驗(yàn)證一起進(jìn)行，兩者同時(shí)進(jìn)行以解決這一矛盾。

10.2 檢測(cè)限和定量限、線性和范圍、定量限濃度下的準(zhǔn)確度三個(gè)項(xiàng)目一般直接使用對(duì)照品進(jìn)行，也不需要加入樣品，而其他項(xiàng)目則需要具體項(xiàng)目具體分析，如原料藥不含輔料，在準(zhǔn)確度的測(cè)定時(shí)，使用50%的測(cè)定濃度的樣品溶液，分別加入30%、50%、70%的測(cè)定濃度的對(duì)照品來測(cè)定回收率。

10.3 通常分析方法與工藝及設(shè)備驗(yàn)證不同，不需要進(jìn)行周期性再驗(yàn)證，即使儀器搬遷也不需要進(jìn)行方法本身的再驗(yàn)證（儀器再確認(rèn)是必須的），這是由于方法驗(yàn)證的目的和內(nèi)容決定的，但如果生產(chǎn)工藝或處方的改變，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)限度或分析方法發(fā)生變化即使稀釋劑的改變，都應(yīng)該進(jìn)行方法再驗(yàn)證，方法再驗(yàn)證不代表全驗(yàn)證，驗(yàn)證哪些項(xiàng)目依據(jù)具體情況進(jìn)行評(píng)估后確定，可能評(píng)估結(jié)果是再驗(yàn)證，只需進(jìn)行專屬性驗(yàn)證，甚至可能不需要進(jìn)行再驗(yàn)證。